نشكر الأستاذ الدكتور أ. فينوجرادوف وGrivennikova فيرا لإدخال الكتاب في ميدان البيولوجيا الميتوكوندريا ورؤى كثيرة مفيدة والمشورة في هذا الإجراء. المؤلفون ممتنون السيدة أماندا McKintock من مكتب جامعة كوينز وسائل الإعلام للمساعدة في إعداد الفيديو.

مقدمة الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية. ويمكن الحصول عليها بسرعة وبشكل موثوق في كمية كبيرة من نوع البرية أو الحيوانات خروج المغلوب. الإجراء عامة تتألف من الأنسجة التي تجزيء عملية الهضم ، والتربسين الطرد المركزي المغاير. هناك العديد من الشروط التي يجب أن تبقى خلال عزل الميتوكوندريا من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك القلب (الشكل 1). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسيج يجب أن يكون المفروم جيدا ، لأنه يؤثر تأثيرا مباشرا على محصول الميتوكوندريا التي حصل عليها. أنسجة القلب من الأفضل أن اللحم المفروم مع مقص منحني الصغيرة ويمكن أن تتبعها استخدام طاحونة Latapie الأنسجة ، أو إذا كان طاحونة الأنسجة غير متوفر ، والصحافة والثوم مع قطر الثقوب مخرج قطرها حوالي 1.0 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري للحفاظ على درجة حرارة الحلول في كل خطوة. ولذلك الإجراء بأكمله والتي ستنفذ في غرفة باردة وجميع الصكوك والحلول يجب أن تكون مستعدة وتبريده مقدما. إذا كنت لا يمكن أن أبقى ظروف الحرارة تفقد العديد من الخصائص المستقرة للإعداد. هيكل الميتوكوندريا هي حساسة جدا لتجميد overfreezing ذلك لتعليق (على سبيل المثال أثناء الطرد المركزي) غير مسموح به ، لا سيما إذا دراسات النقل النشط والهام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلمة المهم هو الوقت المناسب للطول الداخلي ؛ يجب أن يتم تنفيذ العزل في أسرع وقت ممكن ، والتحضير لابد من الحصول على استخدامها على الفور. ولذلك ، الأدوات الجراحية ، والحلول والأجهزة يجب أن تكون معدة مسبقا. </li></ul> المواد والأدوات الصكوك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستقيم مقص التشغيل ، نقطة حادة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقص منحني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق بتري </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قمع صغير + قطعة من النايلون تصفية (prewashed) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 أكواب 50 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمامون اثنين المغناطيسي والحمامات الجليد two </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام واحد كبير الجليد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 أشرطة مغناطيسية صغيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاعق للتجريف بيليه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (يمكن استبداله مع الصحافة الثوم) Latapie الصحافة الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفلون الزجاج homogenisers 20ml و 1 - 2ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النفايات الدورق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيبندورف أنابيب لتعليق الميتوكوندريا النهائي وعينات لتحديد البروتين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمامات الجليد </li></ol> حلول (محسوبة بنسبة 2 الجرذان) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العازلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (7.2 درجة الحموضة =) ، و 0.2 ملي EDTA (1000 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة العزلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (الرقم الهيدروجيني = 7.4) ، 0.2 ملي EDTA ، 1 ملغ / مل BSA (سيغما A6003) (100ML أعدت من المخزن المؤقت الغسل). يمكن أن تكون بديلا ألبومين المصل البقري بنسبة أقل تكلفة نظائرها خال من الأحماض الدهنية. ويمكن استخدام نفس المنطقة العازلة أو الاختلافات في متساوي التوتر وإعادة التعليق العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التربسين (سيغما T8003) الحل : في 2.5mg/ml 1MM حمض الهيدروكلوريك (0.5 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثبط التربسين من فول الصويا (سيغما T9128) 6.5 مل من mg/10 عازلة عزل </li></ol> بروتوكول ويظهر المخطط العام للالإجراء على الشكل. 1. يجب أن يبرد القلوب وغسلها في غسالة الأنسجة العازلة البطين ، رفعه ، المفروم ومتجانسة أثناء العلاج الضوئي مع التربسين. يتم طرد تعليق على سرعة منخفضة ويتم طرد وطاف حصلت مرة أخرى في أعلى سرعة لجمع الميتوكوندريا. يمكن بالاعتماد على التجارب المقررة الاستعاضة عن إعادة التعليق العازلة التي متساوي التوتر أي حل آخر. أنهيت الحيوانات وفقا للالمملكة المتحدة &quot;حيوانات (الإجراءات العلمية) القانون&quot;. عنق الرحم عن طريق الخلع تلتها قطع الرأس. فمن الضروري لاستخراج القلب مباشرة بعد قطع الرأس للحيوان ، حتى لا يكون هناك أي تأخير إنهاء بين الحيوانات واستخراج القلب. إذا كان من المتوقع أن العزلة موازية للكبد الميتوكوندريا يكون صام الفئران ليلا قبل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاثة أكواب تحتوي على 40 مل من الغسل العازلة. تبريدها في حمام الثلج الملح لمدة 3 إلى 5 دقائق قبل الانتقال الى الخطوة التالية. تأكد من عدم overfreeze لهم واستخدامها على الفور بعد السحب من بلورات الثلج تبدأ في الظهور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح القفص الصدري للفأر مقطوعة الرأس واستخراج القلب. جعل شقوق صغيرة ثم نقل على الفور إلى حل وسط الجليد الباردة في الدورق الأول. تضغط على القلب لإزالة الدم ووضعها في الدورق الثاني. كرر هذه العملية لكل القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قلوب جافة على ورقة الترشيح. إزالة كل الدهون والدم متخدر ، أذينات فافة وحمام سباحة والنسيج البطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرم النسيج المجمعة مع مقص منحني صغيرة على طبق بيتري على الجليد لحوالي 5 دقائق حتى حجم الجسيمات حوالي 1-2 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنسجة المفروم في الصحافة الأنسجة وتمريرمن خلال. أن تدرك أن كمية كبيرة من المواد يمكن أن تبقى في الصحافة حتى جمع جميع أنسجة القلب من أسفل الجدران والصحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المواد الى الدورق مع 50 مل الاحتياطي الغسل ويحرك. ثم تصفية تعليق من خلال مرشح النايلون. يغسل النسيج مفروم على 3 مرات مع مرشح الاحتياطي الغسل ورفض الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة غسلها في 20 مل من الاحتياطي الغسيل ووضعه في حمام الثلج على مغناطيسي. إضافة 0.5 مل من محلول التربسين مع التحريك المستمر وبدء موقت. إعداد آخر مغناطيسي ، حمام الثلج والثاني 50 مل دورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الدقيقة ال 4 homogenise فترة وجيزة على جزء التعليق من استخدام جزء صغير مجهز بشكل فضفاض الزجاج تفلون homogeniser (10 - 15ml) مع بعدة جلطات صعودا وهبوطا لتفريق بسبب الايقاف. بعد تعليق نقل تجانس في الدورق الثاني. كرر الإجراء في الدقيقة ال 9 ، بحيث يمكنك تنفيذ تجانس لوقف مرتين في المجموع. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، إضافة 10 مل من عزل مثبط التربسين العازلة التي تحتوي على واحتضان لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية التعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون وحفظ الترشيح. جمع الكسر الجسيمات اليسار على مرشح وhomogenise لمدة 1 دقيقة في 15-20 مل من الاحتياطي الغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين جناسة مع الترشيح والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 600G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية بعناية طاف الناتج إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة. تجنب التلوث من قبل بيليه وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي بسرعة عالية وتجاهل طاف شطف 2-3 مرات بيليه مع 1 مل من تجاهل للرقيق الأبيض العازلة طبقة الحافة الخارجية. تفريق بيليه مع ملعقة ولكن تجنب بقعة حمراء من الكريات الحمراء في الأسفل. إذا حصلت على لوس خلايا الدم ، وإزالة البتات الحمراء من التعليق قبل التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية مع homogeniser صغيرة أو بالتناوب pipetting لطيف. تمييع التعليق مع أكثر Isolationbuffer وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، resuspend الكرية في إعادة التعليق عازلة (وجود مخزن مؤقت متساوي التوتر في الاختيار) ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الناتج البني بيليه يحتوي الميتوكوندريا سليمة غسلها. Resuspend الكرية في حجم صغير جدا من المخزن متساوي التوتر التي تختارها. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مخطط يدل على خطوة خطوة من إجراءات العزل من قلب فأر الميتوكوندريا. الجزء العلوي ، 1-9 مراحل : تعطيل الأنسجة والعلاج التربسين وتجانس ؛ الجزء السفلي ، ومراحل 10-15 : الطرد المركزي المغاير.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يوصف بروتوكول السريع مفصلة لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. ويمكن استخدام إعداد البحوث الفنية التي تم الحصول عليها لأو الهيكلي على الطاقة الحيوية الخلوية ، والدراسات البروتين أو تحليل الحمض النووي والمحتوى الدهني. ويمكن أيضا للدراسات البيوفيزيائية النقل النشط للأيونات وسيطة الأيضية أن يؤديها. فمن الممكن لعملية إعداد مزيد من الميتوكوندريا من أجل عزل جزيئات submitochondrial ، الغشاء الخارجي أو مكونات منفصلة تنقية الفسفرة المؤكسدة. وصف الأسلوب هو تعديل للبروتوكول قياسي من العزلة التي وجاكوبوس ساكس 1. العائد المتوقع من الميتوكوندريا أعد ما يقرب من 10-15 ملغ من البروتين الميتوكوندريا في القلب والجهاز التنفسي نسبة السيطرة على مالات / الغلوتامات إعداد مثل هذه تختلف ما بين 8 إلى 12 مع تنفس رابعا الدولة نحو 0.12 μmol O البروتين xmin xmg 2 -1 -1 عند 23 درجة مئوية في المتوسط ​​تضم السكروز 0.25 م و 10 ملي بوكل ، EDTA 0.2 ملم ، 5 فوسفات البوتاسيوم ملم (8.0 درجة الحموضة) مع ADP 150 ميكرومتر لبدء التنفس ثالثا الدولة (للظروف الدقيقة والإضافات التجريبية ، انظر المرجع 2). وينبغي إيلاء اهتمام خاص لالتفاصيل التقنية قبل عدة بدءا من إجراءات العزل. فمن الأهمية بمكان أن الاستخدام النظيف البولي بروبلين أو أنابيب الطرد المركزي ، وبالتالي ينبغي أنابيب غسلها جيدا بفرشاة نظيفة والماء الساخن ، ولكن ينبغي أن تظل معاملة المنظفات في الحد الأدنى. أيضا ، فمن الأفضل لجمع كل الأواني والأدوات اللازمة في الغرفة الباردة قبل يوم من العزلة. خلال العزلة عندما نقل إلى مخازن قوارير من الأكواب ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص а لمنع قطرات من الماء المثلج في الحلول. يجب عند التعامل مع الأنسجة ينبغي التشديد على أنه ينبغي أن يتم استخراج القلب في أقرب وقت ممكن حتى منذ فترة قصيرة من التأخير بين انفصال رأس الحيوان وتبريد الأنسجة من شأنه أن يؤدي في الميتوكوندريا uncoupled جزئيا. التبريد السريع والغسل الكامل للقلوب إزالة أمر ضروري للحصول على إعداد المعيار ، وخالية من خضاب الدم وكرات الدم الحمراء NADase. يستخدم التربسين عن تدهور البروتينات الضام لزيادة حساسية الأنسجة للقوة القص خلال التجانس. وينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة من النسيج البروتيني لأنها نتيجة في الميتوكوندريا من نوعية رديئة. وينبغي بعد centrifugations عالية السرعة أن تمحى من على الجدران أنابيب الطرد المركزي مع المناديل الورقية لإزالة أي رواسب من المواد الدهون المتراكمة على الجدران. لإعادة تعليق النهائي فإنه من الأفضل استخدام حجم منخفض من المنطقة العازلة النهائية من أجل تقليل الخسائر في الوظائف الميتوكوندريا أثناء التخزين (150 الى 200 ميكرولتر من المنطقة العازلة في القلب). لإجراء دراسات حول نقل الكاتيونات ثنائي التكافؤ يجب أن أية عوامل مخلبية تكون موجودة في الميتوكوندريا الإعداد النهائي وبالتالي يجب غسلها عدة مرات مع EGTA خالية المتوسطة واستخدامها في غضون ساعات الأولى بعد العزلة.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

ومن المعترف به على نطاق واسع وظيفة الميتوكوندريا في توليد ATP الخلوية في عملية الفسفرة المؤكسدة. خلال العقود الماضية لم يكن هناك تقدم كبير في فهمنا لوظائف أخرى من الميتوكوندريا توليد الطاقة. وتشمل هذه دورها في موت الخلايا المبرمج ، بوصفها إشارات العضيات ، والتنمية في الثدييات والشيخوخة ، فضلا عن مساهمتها في التنسيق بين الخلايا والأيض تكاثر الخلايا. ويستند فهمنا من العمليات البيولوجية عن طريق التضمين الميتوكوندريا على أساليب العزل وقوية لمعالجة سليمة الميتوكوندريا من الأنسجة من الحيوانات المختبرية. الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية بما في ذلك دراسات على الحيوانات ، بالضربة القاضية. نحن هنا وصف مفصل الأسلوب السريع لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. هذا النوع من التحضير لقلب فأر الميتوكوندريا هو كائن ممتازة للبحوث الفنية والهيكلية على الطاقة الحيوية الخلوية ، ونقل الجزيئات الحيوية ، ودراسات وتحليل البروتين الحمض النووي والبروتينات والدهون.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.

إعداد قلب فأر اقترن الارتحال الميتوكوندريا

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Manchester. وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.

Video: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

زرع الأنسجة المهندسة في قلب فأر

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

التحضير للثقافات الجرذ الحصى الدماغ العصبية للتنمية والدراسات الدبقية

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

إعداد الأوتار ذيل فأر النشاط الحيوي للدراسات وMechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.