وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من فاندربيلت ، انجرام السرطان غرانت مركز الدعم (P30 CA068485) ، واستئصال ورم من الدماغ مؤسسة الطفولة والمعاهد الوطنية للصحة (NS042205).

1. الجزئي تشريح الورم الحاملة المخيخ وتفكك نسيج الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرجاعها من الأنسجة الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وغالبا ما runted الفئران المريضة التي تحمل نخاعي ، وعرض موه الرأس وأعراض عصبية نموذجية ، بما في ذلك الشلل الخلفي والفشل في استعادة الموقف عندما انقلبت. لاسترداد أنسجة الورم ، والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. فمن imporant عدم تنفيذ خلع عنق الرحم ، وهو الإجراء الذي يولد الضغط في الجمجمة الخلفي ، ويمكن حل وسط الورم سلامة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ قطع الرؤوس على الفور بعد وفاة باستخدام مقص ، وإزالة الشعر والأنسجة العضلية قدر الإمكان عن التصور الجيد للجمجمة. تنظيف السطح من الجمجمة مع Kimwipe غارقة مع الايثانول 95 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع غرامة فتح على طول خط الوسط من الجمجمة ، وإزالة الأنسجة الجمجمة باستخدام الملقط غرامة ، والنقطة التي يتعرض لها الدماغ كله بما في ذلك الورم الحاملة المخيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن مخيخات من البالغين الأصحاء عرض محددة جيدا نصفي الكرة الأرضية ودودة ، ومخيخات من الفئران الحاملة للورم وغالبا ما تكون موسعة ، غير متبلور مع سطح أملس والأوعية الدموية واضح. باستخدام تقنيات عقيمة ، استرداد ورم مخيخي باستخدام الملقط ومكان في الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 +. </li></ol></li></ol> ملاحظة : يتم تطهير جميع الصكوك في الإيثانول 95 ٪ وتعقيمها بالبخار قبل الاستخدام. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكك نسيج الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنسجة الورم من برنامج تلفزيوني لAccutase 50 ٪ (المخفف في PBS) التي هي على وشك حجم 4 مرات من نسيج الورم ، واللحم المفروم مع النسيج المقص الغرامة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، وبعد ذلك يخضع الأنسجة pipeting المتكررة مع Pipetman 1 مل ل3 دقائق إضافية. هذا الأسلوب يجب أن يسفر عن خليط من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق الخلوية 3 أضعاف مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000xg لخلايا بيليه. (وقد وصفت الإجراءات المذكورة أعلاه في &quot;تخصيب اليورانيوم ، والعزلة وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي&quot; ، إن الرب في الصحافة) </li></ol></li></ol> Resuspend الكرية في الخلية العصبية الجذعية الطازجة المتوسطة التي تتكون من خلية متوسطة Neurobasal مع الجلوتامين ، البنسلين الستربتوميسين ، N2 ، B27 ، EGF الإنسان (25 نانوغرام / مل) ، وجمعية جيل المستقبل الأساسية (25 نانوغرام / مل). حساب كثافة خلية من الحل وجعل مزيد من التخفيفات المناسبة مع الجذعية العصبية إضافية المتوسطة الخلية بحيث يمكن للمرء أن تحميل 4 ميكرولتر من حل مع عدد مناسب من الخلايا السرطانية فصلها ، على سبيل المثال 5x10 5 ، في حقنة شطبة ذات الرؤوس 10μL العقيمة. وينبغي تحديد العدد الدقيق للتلقيح الخلايا المراد من قبل الباحث وفقا لمتطلبات معينة التجريبية. يبقي الحل الخلية في أنبوب microcentrifuge 200μL مصغرة (PCR أنبوب) على الجليد. 2. إجراءات لتخدير الفئران مستلم لإجراء العملية الجراحية ، وهناك حاجة لتطهير منطقة مخصصة لجراحة القوارض لمدة الإجراء. من الناحية المثالية ، التي أنشئت مقعد طويل مع المناطق المجاورة ولكن منفصلة لإعداد الحيوان ، مجال التشغيل والاسترداد الحيوانية. مطلوبة القفازات الجراحية ، والقفازات الامتحان لا ، لعملية جراحية. يتم الاحتفاظ تقنية العقيم التي تشابكت أيديهما القفاز فوق الخصر وتستخدم فقط للتعامل مع الكائنات العقيمة من سطح معقمة جافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم استخدام مزيج من الكيتامين (100 ملغ في الكيتامين 1 كيلوغرام من وزن الفأر) وزيلازين (10 ملغ لكل 1 زيلازين كيلوغرام من وزن الفأر) لتخدير. إدارة intraperitoneally التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق عادة 3-5 دقائق لاتخاذ تأثير التخدير الكامل. تحديد ما إذا كان الفأر هو تخدير كامل من أخمص القدمين / ذيل قرصة. ضع كمية صغيرة من مرهم عيني على العيون من الفأرة. جعل الماوس تخدير كامل لمنطقة التشغيل ، ورصد مستمر للتأكد من أن الماوس يتنفس بشكل طبيعي. </li></ol> 3. التطعيم داخل القحف من الخلايا السرطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس المنطقة الظهرية الخلفي من الماوس ، وذلك باستخدام المقص الشعر ، لتكشف الجمجمة الخلفي فوق المخ الأوسط والمخيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الحل على فروة الرأس Betadine يتعرض باستخدام قضيب غيض من القطن ، تليها المسح مع منصة الكحول. كرر هذه الخطوات اثنين تعقيم مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق ربع بوصة في فروة الرأس الخلفية باستخدام مشرط معقم. حفر حفرة 0.5 ملم 2 ملم لدغ إلى اليمين و 2 مم الخلفي لامدا استخدام حفر الأسنان معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على إطار المجسم بواسطة تركيب القواطع والخمسين على قبضة الإطار. تنحدر بعناية وموقف شطبة 10 المحاقن ذات الرؤوس ميكرولتر محملة 4 ميكرولتر من محلول الخلية السرطانية في الحفرة لدغ. مرة واحدة في شطبة من السورىنجى الإبرة تحت سطح الجمجمة وينزل لمدة 3 ملم ثم يصعد ل0.5 مم. حقن ببطء المبلغ المطلوب من الخلايا السرطانية ، مع قوة ثابتة في إطار زمني 30 ثانية ، في المخيخ للمتلقي. ترك الإبرة في مكانها بعد الانتهاء من الحقن لدقيقتين إضافية. ثم إزالة الإبر والمحاقن. مقطع الجرح باستخدام autoclip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس على بطانية الاحترار بعد الجراحة للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم. وسيتبع أنماط التنقل والجهاز التنفسي بشكل مستمر. مرة واحدة على الماوس يتعافى من التخدير ، وضعه مرة أخرى في قفص السكن العقيمة. رصد يومي للأغذية واستهلاك المياه ، والسلوك ، والاستمالة ، وتلطيخ أحمر العينين. تفتيش بحثا عن علامات على العدوى في موقع شق. إزالة autoclips حول جراحة يوم آخر 7. الحفاظ على الفئران لمدة متوسطها 2-6 أشهر ، وتضحية أولئك الذين تظهر عليهم اعراض نخاعي نموذجية لإجراء المزيد من الدراسات. </li></ol> 4. ممثل النتائج medulloblastomas الثانوية في الفئران المتقدمة للغاية تشبه تلك المستفيدة من الأورام الابتدائية. كانت تحمل مخيخات أورام ثانوية في كثير من الأحيان الموسع ، غير متبلور مع الأوعية الدموية خارج الرحم واضحة عندما ينظر اليها ككل ، يتصاعد. وكشفت التحاليل المناعى من نسيج الورم الثانوي أن الخلايا السرطانية والتكاثري للغاية ، أعرب قوية SmoM2 - YFP وعلامات من الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية ، مثل Math1 وPax6. عندما ينفصل وباستخدام طرق تربيتها وذكرت (&quot;العزل ، والإثراء وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي&quot; ، إن الرب في الصحافة) ، ويمكن توسيع ورم نخاعي الثانوية الخلايا بسرعة ، وأعرب عن الخلايا الجذعية متعددة علامات ، هي مولد الرمع ويمكن الشروع في تشكيل المزيد من ورم عند زرع إضافية إلى المتلقين المناعة. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نموذجي كامل تحميل وجهات النظر لقطاعات النسيج نخاعي الثانوية وضع مثالا نموذجيا للنسيج نخاعي الثانوية بعد 26 يوما من حقن خلايا 5x10 5 الورم الرئيسي. تلوين الهيماتوكسيلين يكشف التشكل الخلوي للنخاعي نموذجية ، بما في ذلك نسبة النووية / هيولي العالية وتعدد الأشكال النووية. هذه الخلايا السرطانية الثانوية التكاثري للغاية كما هو مبين من قبل Ki67 التعبير وأنها أيضا تعبير بقوة الغشائي SmoM2 - YFP. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. يمكن تربيتها خلايا نخاعي الثانوي وتوسعت في المختبر باستخدام بروتوكول وصف الأولية للخلايا نخاعي الماوس (&quot;العزل ، والإثراء وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي&quot; ، إن الرب في الصحافة) ، ويمكن أن تكون هذه الخلايا المستزرعة نخاعي الثانوية وتوسيع نطاقها لمقاطع متعددة. صورة يظهر ورم الممثل نفسه مستعمرة مثقف في 4 أيام و 14 يوما. الخلايا السرطانية مثقف وبين القطبين ، ممدود مع السيتوبلازم شحيحة وتشع في كثير من الأحيان من نواة كثيفة من إجمالي الخلوية. انهم لا يحمل إعاقة النمو للإتصال به. خلايا صغيرة مستديرة هي خلايا الدم الحمراء.

<ol>
	<li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma.">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li><li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma.">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li><li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma.">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li><li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1.">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

عدة عوامل حاسمة لضمان نجاح خلية نخاعي allografting أن ينتج تشكيل الورم الثانوية هي على النحو التالي : أولا ، استخدم 50 ٪ فقط Accutase لتفارق الأنسجة وليس الإفراط في هضم الأنسجة والعلاج لفترات طويلة انزيم يؤدي إلى انخفاض كبير في بقاء الخلية. أيضا استخدام فقط Pipetman حجم 1 مل وأصغر نصائح يمكن أن تولد أيضا الأضرار المادية للفصل الخلايا. لا بأس أن يكون خليطا من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة لallografting. الثانية ، ومزيج يوازن الحل خلية الورم في كل مرة قبل تحميل حقنة هاملتون. لا تستخدم أكثر من 4 لكل ميكرولتر الحقن باعتبارها أكبر حجم من شأنه أن يولد الضغط داخل القحف بكثير جدا والمقاومة. الماضي ، من المهم الانتظار لدقائق إضافية 2 السماح للحقن محلول تتبدد في النسيج الدماغي بعد كل حقنة. ووصف الإجراءات هنا تسمح لتحديد نوع الخلية ملحوظ وراثيا (ق) التي يمكن أن تستحدث ونشر الأورام. هذا البروتوكول ينطبق أيضا على الحالات التي لم يتم اشتقاق الخلايا ليتم حقنه مباشرة من نسيج الورم الرئيسي ، ولكن من إنشاء خطوط الخلايا المستزرعة يمكن للمرء أن يعد العدد المناسب من الخلايا بواسطة انزيم الهضم وإما / أو pipetting المتكررة ، ونبدأ من الخطوة 2 من هذا البروتوكول. لذا ، يمكننا أيضا اختبار وظائف الجينات مرشح وتأثير مثبط من المركبات الكيميائية مع قراءات في الورم للنمو الجسم الحي.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hEGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0311</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0023</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502048</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>B27(-RA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12587010</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Accutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1110501</td>
<td>50% </td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030081</td>
<td>2mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereotaxic instrument</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foredom flexible shaft drill, hang-up style</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>58650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Large probe holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;L syringe, 26 ga., bevel tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting </td>
<td>51105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Drill bit .75mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51455-3</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intracranial orthotopic allografting of medulloblastoma cells in immunocompromised mice

هو ورم نخاعي الأكثر شيوعا عند الأطفال في الجهاز العصبي. وركزت مجموعة كبيرة من الدراسات على الحيوانات على الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية (CGNPs) ك خلية المنشأ من أجل نخاعي 1-4. ومع ذلك ، فإن العروض المتنوعة السريرية للمرضى في نخاعي فرعية الإنسان (عقيدية ، صلدة ، الكلاسيكية والكبيرة خلية / كشمي) ، وحقيقة أن وجدت في نخاعي مجموعة فرعية من المرضى من البشر مع عدم وجود حمل خارج الرحم من التعبير علامة CGNP 5 ، تشير إلى أن أصول الخلوية والجزيئية لنخاعي هي أكثر تعقيدا وأبعد من أن يفهمها تماما. وبالتالي ، فمن الضروري تحديد ما إذا كان هناك ورم نخاعي بديلة خلية المنشأ على أساس من نوع الخلية التي يمكن تطويرها علاجيا محددة. تحقيقا لهذه الغاية ، سوف مثلي داخل القحف allografting ملحوظ من أنواع الخلايا السرطانية وراثيا تليها تحليلات لاحقة من تطور الورم الثانوي في متلقي تسمح بتحديد منشأ الخلوي للخلايا السرطانية البدء. نحن هنا وصف بروتوكول تجريبي لمثلي داخل القحف allografting من الخلايا المشتقة من نخاعي الأنسجة الورم الرئيسي ، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الإجراء لزرع خلايا من خطوط الخلايا المحددة.

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice at JoVE.com

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

هذا البروتوكول وصف العزلة وتفكك النسيج نخاعي الماوس ، واللاحقة allografting من الخلايا السرطانية في الفئران المناعة المستفيدة من أجل الشروع في نخاعي الثانوية.

مثلي Allografting داخل الجمجمة من خلايا المناعة لدى الفئران نخاعي

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron ...

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  Vanderbilt University. هذا البروتوكول وصف العزلة وتفكك النسيج نخاعي الماوس ، واللاحقة allografting من الخلايا السرطانية في الفئران المناعة المستفيدة من أجل الشروع في نخاعي الثانوية.

Video: Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

طريقة بسيطة وغير مكلفة لتحديد الباردة الحساسية والتكيف في الفئران

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Intracranial Pharmacotherapy and Pain Assays in Rodents

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the development of effective therapeutics. Intracranial pharmacology presents an important tool for understanding the molecular and cellular mechanisms of pain in the brain, as well as for novel treatments. Here we present a protocol that integrates intracranial pharmacology with pain behavior testing. Specifically, we show how to infuse analgesic drugs into a select brain region, which may be responsible for pain modulation. Furthermore, to determine the effect of the candidate drug in the central nerve system, pain assays are performed after intracranial treatment. Our results demonstrate that intracranial administration of analgesic drugs in a targeted region can provide relief of pain in rodents. Thus, our protocol successfully demonstrates that intracranial pharmacology, combined with pain behavior testing, can be a powerful tool for the study of pain mechanisms in the brain.

Here we present a protocol to perform intracranial pharmacological experiments followed by pain behavior assays in rodents. This protocol allows researchers to deliver molecular and cellular targets in the brain, for pharmacologic agents in the treatment of pain.

العلاج الصيدلاني داخل الجمجمة وفحوصات الألم في القوارض

Pain is a salient sensory experience with affective and cognitive dimensions. However, central mechanisms for pain remain poorly understood, hindering the ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

القياس الكمي للبروتينات التركيبية داخل الفئران

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

التسجيل الكهربائي لمناطق القشرة الدماغية التي تم التلاعب بها باستخدام فيروس مرتبط بال أدينو يستهدف كوفلين في الفئران

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.