قبل البدء في التحضير : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجول yhird يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HL3.1 (التعديل الدملمف الشبيهة) حل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات Sylgard تشريح (شفاف المطاط سيليكون) الذي أعد في الصغيرة (35 × 10 ملم) أطباق بتري البلاستيكية باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبابيس قطع تشريح قصيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات تحفيز كهربائي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات تسجيل حادة </li></ul> HL3 الحل : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال التشريح والتجارب الكهربية ، مغمورة في اليرقة HL3.1 الحل الذي يحتوي على 2 (مم) : 70 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 ، 10 NaHCO 3 و 5 طرهالوز ، 115 السكروز ، وHEPES 5 ، ودرجة الحموضة 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف تركيزات CaCl 2 إلى حل HL3.1 لتوفير تركيز الكالسيوم المطلوبة من خارج الخلية 2 +. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء تشريح اليرقات في كا 2 + تركيزات منخفضة (لتجنب تقلص العضلات) باستخدام HL3.1 + 0.25 ملي CaCl 2 ، يحرص على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجل عادة في التجارب الكهربية HL3.1 + 1 ملم CaCl 2 ، ولكن يمكن تعديل هذا 0،4-1 ملي كا 2 + على النحو المطلوب. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير معقمة تصفية حل HL3.1 قبل الاستخدام ، وتخزينها في 4 ˚ جيم </li></ol> إعداد وتحفيز تسجيل ماصات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم سحب تسجيل وتحفيز ماصات مع P - 2000 سوتر مجتذب micropipette الليزر القائمة على استخدام الإعدادات التالية : الحرارة = 390 ، الشعيرة = 4 = 35 السرعة ، والتأخر = 200 واسحب = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد من أقطاب تحفيز رقيقة الجدران الزجاجية البورسليكات الشعيرات الدموية مع نهايات الواسعة التي كانت أكبر قليلا من عرض محاور المحركات قطعت. وfirepolished ينتهي على شكل لإعطاء الانتهاء من سلس (باستخدام ماصة Narashiga ملمع) ، للحد من الأضرار التي لحقت العصبية. تمتلئ تحفيز كهربائي مع الحل حمام (HL3.1 + 1 ملم كا 2 +). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدون الأقطاب تسجيل من الزجاج البورسليكات 1.2mm ، والتي يتم سحبها لتشكيل ماصة حادة (30-60 mΩ) ، ومليئة بوكل 3M. </li></ol> الجزء 1 : يرقات ذبابة الفاكهة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشريح الثالثة طور مرحلي اليرقات تجول لفضح العضلات في جدار الجسم كما هو موضح سابقا 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء التشريح في HL3.1 + 0.25 ملي كا 2 + على لوحات صغيرة من السيليكون (35 × 10 ملم). يجب أن يكون الحل HL3.1 الجليد الباردة للتشريح من أجل تخدير اليرقة ، ويتم الاحتفاظ بها على الثلج قبل وأثناء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشريح اليرقات باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) ، وهذا هو تعديل للتجارب الكهربية بإضافة 0.25 ملي كا 2 + في حل تشريح HL3.1 ، واستخدام الدبابيس تشريح قصيرة (~ 2 مم في الطول) التي هي أقل من المرجح أن تصل إلى الهدف المجهر والأقطاب الكهربائية خلال التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التشريح ، وقطعت محاور المحرك من اليرقات. يتم ذلك من خلال عقد مجلس الامن القومى برفق ورفعه قليلا بحيث يمكن قطع الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات الخلفية للالعقدة بطني دون الإضرار العضلات (الشكل 1). ثم تتم إزالة المخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم غسلها إعداد اليرقات تشريح مرتين مع HL3.1 + 1 ملم كا 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تخطيطي يبين الخطوات المتبعة في قطع السيارات من المحاور اليرقات تشريح. رفع الجهاز العصبي المركزي مع ملقط وتقطع المحاور الحركية في قاعدة الدماغ. الجزء 2 : تسجيلات بين الخلايا من خلايا العضلات اليرقات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على تشريح المجهر الكهربية وغمر الإعدادية مع HL3.1 + 1.5 ملي كا 2 + والإصلاح القطب حمام بحيث يكون على تماس مع الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتجرى تجارب على جميع العضلات في غضون 6 الجزء البطن الثالثة (A3). يتم تحفيز الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات باستخدام الشفط الكهربائي 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف القطب تحفيز في أول طبق لتجنب الاهتزازات عند القطب الخلايا في مكان. مكان القطب في تحفيز منطقة قريبة من الخلايا العصبية الحركية في العضلات 6 التعصيب وتطبيق طيف الامتصاص حتى يتم قطع العصب داخل ماصة الزجاج. يجب الحرص على عدم امتداد الأعصاب عند تطبيق الشفط. رفع ماصة قليلا حتى لا يكون لمس العضلات وضعه حتى لا يكون سحب على قطع الألياف العصبية (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="الشكل 2" width="600" height="296" /> الشكل 2. تخطيطي للعضلات والخلايا العصبية الحركية التعصيب من جزء واحد في البطن من يرقة ذبابة الفاكهة. ويوضح موقف ماصة تحفيز الأعصاب وقطعت والقطب في تسجيل موقف في العضلات 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البينيةوالتسجيلات الخليوي مع microelectrodes حادة مليئة بوكل م 3. موقف القطب تسجيل فوق مركز للعضلة 6 على قطعة البطن الثالثة (A3) وضبط مدخلات يقابل ذلك فإنه يقرأ صفر من أجل حل الحمام. انخفاض ببطء الكهربائي ونهج العضلات تحت التكبير البصرية عالية حتى يلمس سطح العضلات. مشاهدة الذبذبات لتأكيد أنه تم اخترقت العضلات. ينبغي أن يستريح غشاء المحتملة على الأقل -60 بالسيارات ، أو لا ينبغي أن يكون استخدام الحيوانات. ينبغي متفرقة امكانات endplate مصغرة تكون الآن مرئية. ترك الخلية لتحقيق الاستقرار في لدقيقة واحدة قبل البدء في المحضر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الكشف عن التغييرات المحتملة في الغشاء مع رئيس أكسون المرحلة HS - 2A و 2B Axoclamp مكبر للصوت وسجلت مع v Clampex 8.2.0.235 (أكسون الآلات). و2B Axoclamp هو ربطه إلى الكمبيوتر الذي يدير برنامج pCLAMP ويعمل جنبا إلى جنب مع واجهة 1322A Digidata. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسجلت الخلايا لمدة 3 دقائق من دون أي مؤثرات لقياس ردود mEJP. وقد تم تحليل آثار البسيطة باستخدام برامج التحليل (Synaptosoft ، والخامس 6.0.3) والسعة والتردد mEJP تحديدها. </li></ol> تحفيز العصب : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحفيز نهاية المقطوعة من الخلايا العصبية الحركية مع سلسلة من نبضات الجهد مربع (0.3 مللي ثانية مدتها) على كثافة غير كافية لكل من المحاور الحركية ، لتستثير استجابات متسقة في العضلات كلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إنشاء التحفيز مع ماجستير - 8 مولد النبض ، وهو مبرمج لتوصيل نبضات مستمرة وفقا للمدة والأوقات الفاصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح لمدة خمس ثوان بين المحفزات لتحقيق الانتعاش في NMJ متشابك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تحديد قوة الحافز ، وتبدأ مع أدنى مستوى لها ، وزيادة كثافة ببطء على مدى عدة محاكمات. وينبغي أن تستخدم لشدة التحفيز النتائج في الحد الأدنى الذي أثار رد فعل في التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم التوصل إلى شدة الحوافز المناسبة ، ينبغي أن يكون هناك واحد EJP مجمع واحد تقلص العضلات التي حركها التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل ما لا يقل عن 10 من كل الامكانيات أثار العضلات وسعة المتوسط. </li></ol> الجزء 3 : النتائج الممثل <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="الشكل 3" width="600" height="358" /> الشكل 3. تسجيل الخلايا العضلية من الممثل 6 تبين أثار EJP هو استجابة لالتحفيز الكهربائي للعصب قطعي ، وإمكانات متفرقة endplate مصغرة ، أو لmEJP. EJP في العضلات سعة 6 من اليرقات من النوع البري صحية ، مثل S كانتون ، وعادة ما تكون حوالي 40 فولت وسعة mEJP بين بالسيارات 1-3.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

وصفت وسائل هنا توفر طريقة سريعة نسبيا واسعة للكشف عن تغيرات في وظيفة متشابك في NMJ. القدرة على أداء التسجيلات الكهربية باستخدام حيوانات سليمة في الجسم الحي ، وتأدية معالجات وراثية أو دوائية ، وجعل ذبابة الفاكهة نموذجا مثاليا للحيوان التحقيق في الجوانب الفسيولوجية والجينية لالعصبي. منذ خلايا عضلة كبيرة جدا ، قد يفضل البعض إضافة إلى خطوة إضافية لهذا البروتوكول لمدة تسجيل الجهد الكهربائي (TEVC) المشبك. ويمكن تنفيذ هذه اليرقات على التحضير لنفسها مع القطب الخلايا في مكان ، عن طريق وضع القطب الجاري يمر على الخلية. مرة واحدة في الخلية هو جهد كاف فرضت ، يمكن تسجيل الاستجابة الحالية. على الرغم من العضلات 6 هو الأكثر استخداما للتسجيلات الكهربية ، ويمكن أيضا العضلات 7 و 12 يمكن استخدامها. وصفت وسائل هنا تظهر أساسيات Drosophophila NMJ الكهربية -- التقنيات التي وصفت اول يناير عام 1976 ويناير ، وأصبحت منذ ذلك الحين في النظام النموذجي للبحث الفيزيولوجيا متشابك.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

في هذا الفيديو ، ونحن تصف الأساليب الكهربية لتسجيل انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) من يرقات ذبابة الفاكهة. الجهاز العصبي العضلي اليرقات هو المشبك نموذج لدراسة علم وظائف الأعضاء متشابك والعصبي ، ويشكل أداة للبحث القيم الذي عرف علم الوراثة ، ويمكن الوصول إلى التلاعب التجريبية. يمكن تشريح اليرقات لفضح الجدار العضلي الجسم والجهاز العصبي المركزي والأعصاب الطرفية. تتميز عضلات ذبابة الفاكهة ونمطها تعصيب العضلات بشكل جيد ويسهل الوصول لتسجيل داخل الخلايا. يمكن التعرف على العضلات الفردية عن طريق موقعهم والتوجيه داخل البطن 8 قطاعات ، ولكل منها 30 مرتبة في عضلات نمطا يتكرر في قطاعات A2 -- A7. يمكن تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات عضلات رقيقة والفردية وحزم من المحاور العصبية المحركة التي يمكن تصور تضوء<sup&gt; 1</sup&gt;. ويمكن استخدام البنى المعدلة وراثيا لتسمية الخلايا المستهدفة لتحديد الهوية البصرية أو لمعالجة المنتجات الجينات في أنسجة معينة. في اليرقات ، يتم إنشاء امكانات تقاطع مثير (EJPs) ردا على اطلاق سراح حويصلي من الغلوتامات من العصبونات الحركية في المشبك. اليرقات في تشريح ، يمكن تسجيل EJP في العضلات مع قطب كهربائي داخل الخلايا. يمكن امكانات العمل أثار بشكل مصطنع في الخلايا العصبية الحركية التي جرى خفض الخلفي للالعقدة البطنية تعادل في ماصة الزجاج عن طريق الشفط لطيف وحفز مع قطب كهربائي. هذه الخلايا العصبية الحركية ومتميزة عند عتبات اطلاق حفز ، وعندما يطلقون النار في وقت واحد ، فإنها تولد رد فعل في العضلات. يمكن تسجيل الاشارات المرسلة عبر المشبك NMJ في العضلات أن يعصب الخلايا العصبية الحركية. وينظر في وEJPs مصغرة امكانات تقاطع مثير (mEJPs) والتغيرات المحتملة في الغشاء. وتسجل ردود الكهربية في درجة حرارة الغرفة في حل تعديل الدملمف مثل الحد الأدنى<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3) الذي يحتوي على 5 ملغ ملي<sup&gt; 2 +</sup&gt; و 1.5 ملي كا<sup&gt; 2 +</sup&gt;. يمكن للتغيرات في مدى EJPs أثار تشير الاختلافات في وظيفة متشابك وهيكله. ويتم تحليل تسجيلات رقمية لسعة EJP ، mEJP التردد والسعة ، ومضمون كمي.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae at JoVE.com

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

نحن هنا وصف أساليب الكهربية لقياس انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية لليرقة ذبابة الفاكهة. أثار إطلاق سراح يبدأ بشكل مصطنع من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية المحاور ، ويمكن قياسها من خلال انتقال NMJ التي أثارت استجابة بعد المشبكي في العضلات.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. نحن هنا وصف أساليب الكهربية لقياس انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية لليرقة ذبابة الفاكهة. أثار إطلاق سراح يبدأ بشكل مصطنع من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية المحاور ، ويمكن قياسها من خلال انتقال NMJ التي أثارت استجابة بعد المشبكي في العضلات.

Video: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 تحفيز ساطة من الإمكانيات في متشابك ذبابة الفاكهة العضلية المفارق

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

عرض تاريخي والتظاهر في فسيولوجيا NMJ من جراد البحر العضلات فتاحة

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...