Name: the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

حصاد نخاع العظام من Femurs وظنبوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأولى من هذا الإجراء هو الحصاد نخاع العظم من femurs وظنبوب من 6 -- 12 أسبوعا الماوس القديم (نحن نستخدم BALB / ج الفئران ولكن يمكنك أن تفعل هذا الإجراء مع أي سلالة الماوس). لتبدأ ، الموت ببطء الماوس عن طريق الاستنشاق CO 2 (لن يظهر). عظم الفخذ والظنبوب الحصاد من رجليه الخلفيتين كل منها. ثم ، مع شفرة حلاقة ، وقطع كل نهاية femurs لإزالة مفاصل الورك والركبة وكشف نقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطريقة مماثلة ، وقطع كل نهاية ظنبوب لإزالة الركبة والكاحل والمناطق المجاورة لفضح نخاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ حقنة 3 مل مع إبرة عيار 26 وملء مع RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ ، والبنسلين ، وستربتوميسين ، وبيتا المركابتويثانول - (BME = 100 أوقية). باستخدام الملقط ، وعقد على مدى عظم طبق بتري تحتوي RPMI وسائل الإعلام. إدراج إبرة حقنة في واحدة من نهاية العظام وتضغط على المكبس لطرد نخاع العظام. يمكن نقل إبرة حقنة صعودا وهبوطا داخل العظم لاخراج نخاع المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء للعظام في كل شيء ، ومن ثم المضي قدما في إنشاء الثقافات. </li></ol> إنشاء الثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء الثقافات نخاع العظام ، وماصة للنخاع العظمي مسح صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق النسيج في التعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان تصفية 70 ميكرون على رأس أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة تعليق الخلية إلى التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف طبق بيتري مرة واحدة مع RPMI ، ثم تضاف إلى تصفية شطف ميكرون 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المطاط في نهاية المكبس من المحاقن 1 مل ، طحن قطع نخاع العظام المتبقية على رأس تصفية 70 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع مرشح RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل تصفية ، أجهزة الطرد المركزي للتعليق في 1200 دورة في الدقيقة خلية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية عن طريق إعادة التعليق في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نحصل عادة ~ 90 مليون خلية من عظام one الماوس ، (اثنان زائد femurs ظنبوب اثنين). بعد عد الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي من جديد في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في كمية صغيرة من RPMI وقسامة لهم في قوارير تحتوي على ما يكفي من زراعة الأنسجة RPMI بحيث التركيز النهائي هو 1 مليون خلية لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة السيتوكينات لتعزيز تطوير نوع من الخلايا اهتمامك. في هذه الحالة ، يتم إضافة خلوى انترلوكين - 3 (IL - 3 = 10 نانوغرام / مل) لتشجيع تنمية قعدات والخلايا البدينة. للحصول على قعدات ، يحضن لمدة 10 يوما. للخلايا البدينة ، احتضان لمدة 5 اسابيع. عندما توليد الخلايا البدينة ، ينبغي أن يتم تغيير وسائل الإعلام وIL - 3 مرة واحدة في الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا نظرة على كيف يجب أن تظهر الخلايا البدينة بعد الطلاء. هذه الصورة تدل على تمايز الخلايا في نخاع الأسسة الصاري والخلايا البدينة 10 يوما بعد إضافة انترلوكين - 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم الحصول على نوع من الخلايا المطلوبة ، المضي قدما في خطوة electroporation. </li></ol> Electroporating خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الخطوة electroporation ، وتحديد عدد الخلايا في قارورة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة electroporated الخلايا في مناطق ذات كثافة من 10 مليون دولار لكل مل ، ونقل ذلك عدد الخلايا المطلوبة لأنابيب مخروطية وأنابيب الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، نضح وسائل الإعلام ، وغسل الخلايا مع 1X PBS ، ومرة ​​أخرى في أجهزة الطرد المركزي 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة بيو راد electroporation بولسير جين العازلة لجعل التعليق خلية من 10 مليون خلية لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إعادة التعليق الخلايا ، إضافة DNA البلازميد المطلوب عند تركيز النهائي من 10 إلى 20 ميكروجرام لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 150 microliters لتعليق خلية في آبار من اختيارك على طبق electroporation 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في قاعة electroporation وحة MXcell وإغلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ترنسفكأيشن من الخلايا البدينة ، يجب أن تكون مبرمجة على بروتوكول electroporation في MXcell إلا باستخدام بروتوكول مسبقا أو تخزينها. التحسين من خلال التجارب اكتشفنا أن أعلى كفاءة الخلايا البدينة ترنسفكأيشن تحدث باستخدام مربع بروتوكولات نبض الموجة. فإننا سوف تختلف الظروف electroporation على لوحة لتسليم 300V/20ms ، 350/15ms ، 350V/20ms ، والبقول 350V/10ms موجة مربع في 2000uF و 1000 أوم. مرة واحدة وقد تم تعيين البروتوكول وتحميلها على الجهاز ، اضغط على &quot;نبض&quot; لelectroporate الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال electroporation ، ونقل الخلايا إلى نسيج لوحة الثقافة. نحن عادة نقل كل electroporation ميكروليتر 150 عينة لبئر في لوحة نسيج الثقافة 48 - جيدا يحتوي على 300 microliters RPMI (تستكمل مع 10 ٪ FCS والبنسلين والستربتوميسين ، وبيتا المركابتويثانول) ب 10 نانوغرام لكل مليلتر انترلوكين - 3. يتم تحضين الخلايا ليلا 37 درجة مئوية ، ثم يعاير 24 ساعة في وقت لاحق للتعبير والقمع. </li></ol> ترانsfection النتائج يظهر صورة مجهرية الفلورسنت من الخلايا بعد electroporation ناجحة باستخدام 20 ميكروجراما لكل مل GFP البلازميد في الفيديو. ويمكن استخدام نظام الكفاءة electroporation ترنسفكأيشن MXcell من حوالي 30 ٪ يمكن الحصول عليها. نظام يسمح لك أن تختلف الظروف لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الخاص ترنسفكأيشن ، مع الحفاظ على بقاء الخلية.

كما يظهر المزيد من المعلومات الجينومية وتطوير أدوات جديدة مثل سيرنا ، أصبح استخدام الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية من أي وقت مضى إلى مزيد من فهمنا للأمراض المسالك ، وتفاعلات البروتينات والبروتين ، ونقل الإشارة. ويتم الحصول على الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة أو سوائل وزراعتها في المختبر. ويمكن التلاعب بها هذه الخلايا في عدد من الطرق ، بما في ذلك من خلال إدخال المادة الجينية الخارجية. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأساسي هو electroporation. Electroporation يعرض الخلايا لنبضات كهربائية من أجل زيادة عابر نفاذية غشاء الخلية ، مما يسمح الأحماض النووية خارجية لدخول الخلية. يمكن تحسين هذا الأسلوب من ترنسفكأيشن لاستيعاب الاختلافات بين أنواع مختلفة من الخلايا / خطوط ، وبالتالي يمكن استخدامها لtransfect الخلايا البدنية ، فضلا عن غيرها من نخاع العظم أي المستمدة من الخلية. وعلاوة على ذلك ، خلافا لفيروسي بوساطة ترنسفكأيشن ، electroporation لا تفرض قيودا على حجم الحمض النووي transfected ، ولا تتطلب تحضيرا واسعة النطاق. على النقيض من الدهون بوساطة ترنسفكأيشن ، يمكن أن تكون أقل سمية electroporation ، ولا يؤدي في محاصرة endosomal للحامض النووي transfected. وقد وضعت الحيوي راد نظام electroporation MXcell خصيصا لهذه الخلايا. ويسمح لك MXcell تختلف الظروف لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة والصلاحية الخاص ترنسفكأيشن الخلية. من أجل تحسين الكفاءة وتقليل ترنسفكأيشن موت الخلايا ، وعدد كبير من المعلمات electroporation بما في ذلك الجهد ، يمكن تعديل السعة ، والمقاومة ، وطول النبضة وتقييمها.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser MXcell Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Electroporation Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن electroporation هي الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأولية. وضعت خصيصا لجين electroporation MXcell بولسير النظام وعازلة لجين electroporation بولسير transfect الأحماض النووية في خلايا الثدييات والتي يصعب transfect الخلايا ، مثل الفيديو cells.This الابتدائي ووقف يوضح كيفية تأسيس الخلية الأولية الثقافات المكونة للدم من نخاع عظام الفئران ويعد بعد ذلك لelectroporation في النظام MXcell. نبدأ من خلال عزل عظم الفخذ والساق. ويتم حصاد ثم نخاع العظام من عظم الفخذ والساق على حد سواء ويتم تأسيس الثقافات. ثم يتم transfected مثقف خلايا نخاع العظام وتحليلها.

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

يصف هذا الإجراء كيفية تأسيس الخلية الأولية الثقافات المكونة للدم من نخاع عظام الفئران وتبعتها ترنسفكأيشن باستخدام الجينات electroporation MXCell بولسير النظام.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

<a class="grey_button" href="/video/1047">
ChineseVersion
</a>

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K Views.  Bio-Rad Laboratories, Inc.  ChineseVersion 

Video: The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genetics

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Immunology and Infection

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

لينتيفيرال CRISPR/كاس 9-بوساطة الجينوم التحرير لدراسة خلايا الدم في نماذج الامراض

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

تحسين عزل الخلايا اللحمية من الغدة الصعترية ونخاع العظام

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث المكونة للدم باستخدام عزل الخلايا اللحمية لتسلسل الخلية المفردة

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

لينتيفيرال CRISPR/كاس 9-بوساطة الجينوم التحرير لدراسة خلايا الدم في نماذج الامراض

بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة