وصفنا كيفية إنشاء نموذج جراحي مستخدم على نطاق واسع لإصابة نقص التروية المعوية (IRI) في القوارض. يتضمن الإجراء انسداد الشريان المساريقي العلوي متبوعا باستعادة تدفق الدم. هذا النموذج مفيد للدراسات التي تبحث في أسباب انسداد IRI المعوي في كل من الطب البيطري والبشري.

ترتبط إصابة نقص التروية المعوية (IRI) بعدد لا يحصى من الحالات في كل من الطب البيطري والبشري. لوحظت حالات IRI المعوية ، مثل توسع المعدة (GDV) ، والتواء المساريق ، والمغص ، في مثل والخيول. يؤدي الانقطاع الأولي لتدفق الدم إلى إصابة الأنسجة بنقص تروية. على الرغم من أنه ضروري لإنقاذ الأنسجة القابلة للحياة ، إلا أن إعادة التروية اللاحقة يمكن أن تؤدي إلى مزيد من الإصابة. الآلية الرئيسية المسؤولة عن IRI هي تكوين الجذور الحرة عند إعادة التروية وإعادة إدخال الأكسجين في الأنسجة التالفة ، ولكن هناك العديد من المكونات الأخرى المعنية. غالبا ما تضفي الآثار المحلية والنظامية الناتجة تشخيصا سيئا.

كان IRI المعوي موضوع بحث مكثف على مدى السنوات ال 50 الماضية. يعد نموذج القوارض في الجسم الحي الذي يتم فيه ربط قاعدة الشريان المساريقي العلوي (SMA) مؤقتا هو الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة IRI المعوي. هنا ، نصف نموذجا ل IRI المعوي باستخدام تخدير الأيزوفلوران في 21٪ O₂ الهواء الطبي الذي ينتج عنه إصابة قابلة للتكرار ، كما يتضح من التشريح المرضي المتسق للأمعاء الدقيقة. كما تم تقييم إصابة الأنسجة في القولون والكبد والكلى.

يمكن أن تحدث إصابة نقص التروية (IRI) في أي عضو وتتضمن مكونين متسلسلين. يؤدي التوقف الأولي لتدفق الدم إلى أن تصبح الأنسجة المصابة إقفارية ثم يؤدي إعادة التروية اللاحقة إلى مزيد من إصابة الخلايا. غالبا ما يتجاوز الضرر الناجم عن إعادة التروية الضرر الناجم عن نقص التروية¹. تتضمن الفيزيولوجيا المرضية ل IRI سلسلة معقدة من الأحداث ، وأبرزها تكوين الجذور الحرة عند إعادة إدخال الأكسجين ، والذي يحدث أثناء إعادة التروية². يلعب تنشيط الخلايا الالتهابية والسيتوكينات أيضا دورا². في حالات IRI المعوية ، يمكن أن يؤدي الانتقال البكتيري إلى مجرى الدم بعد تلف البطانة إلى متلازمة الاستجابة الالتهابية الجهازية². إذا كان الضرر الناجم عن IRI شديدا بدرجة كافية ، يمكن أن تؤدي التأثيرات الجهازية الناتجة إلى فشل متعدد الأعضاء³.

ترتبط حالات IRI المعوية بارتفاع معدلات المراضة والوفيات^4،5،6. يرتبط IRI المعوي بالعديد من الحالات المرضية والإجراءات الجراحية في كل من الطب البيطري والبشري. في الطب البيطري ، تكون معرضة بشكل خاص لظروف IRI المعوية ، مثل توسع المعدة (GDV) ، والتواء المساريق ، والمغص ^7,8. في البشر ، يعد IRI مشكلة رئيسية ومتكررة الحدوث في جراحة تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني ، والفتق الخانق ، ونقص التروية المساريقي الحاد ، والانفتال ، والصدمات ، والصدمة ، والتهاب الأمعاء والقولون الناخر الوليدي ، واستئصال الأمعاء الدقيقة أو زرعها⁹.

تتضمن معظم دراسات القوارض في الجسم الحي ل IRI المعوي انسداد قاعدة الشريان المساريقي العلوي (SMA) ، وهو فرع الشريان الأورطي البطني الذي يمد الدم إلى غالبية الأمعاء الدقيقة والجزء القريب من الأمعاء الغليظة^10،11،12. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لهذا النموذج والبساطة النسبية ، لم يتم نشر بروتوكول مفصل يستخدم التخدير المستنشق في 21٪ O₂ من الهواء الطبي. يشكل عدم وجود بروتوكول قياسي صعوبة للباحثين الذين ليسوا على دراية بالإجراء ويمنع الاتساق عبر الدراسات. نوضح الخطوات اللازمة لإجراء النموذج الجراحي ل IRI المعوي في ذكور وإناث الفئران السويسرية Webster البالغة من العمر 8-14 أسبوعا. ينتج عن هذا النموذج من IRI المعوي إصابة قابلة للتكرار ، كما يتضح من التشريح المرضي المتسق.

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام التابعة للمعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعاهد الوطنية للصحة وتتوافق مع السياسات الموضحة في سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر ، وقانون رعاية ، ودليل رعاية واستخدام المختبر.

1. الإعداد الجراحي

1. اتبع الإجراءات المعقمة. ارتد قناعا وغطاء شعر وبذلة نظيفة / معطف مختبر / دعك جراحي.
2. قم بإعداد المواد المعقمة التالية: الأدوات الجراحية (انظر جدول المواد) ، والمحلول الملحي الدافئ ، ومسحات القطن ، والشاش ، والدبابيس الجراحية ، والستائر الجراحية ، والقفازات. أيضا الحصول على الشريط الجراحي ، والتي لا تحتاج إلى تعقيمها. تعقيم المواد إما باستخدام تقنيات تعقيم الأوتوكلاف أو أكسيد الإيثيلين.
3. ضع بطانية مائية ساخنة في منطقة الجراحة وقم بتغطيتها بمنشفة أو ستارة معقمة.
4. استخدم مبخر إيزوفلوران دقيق ، وهواء طبي مضغوط (21٪ O₂) ، ودائرة Bain غير قابلة لإعادة التنفس مع مخروط أنف مصمم للفئران لتوفير التخدير الجراحي.

2. إعداد

1. تخدير الفأر في غرفة الحث عن طريق توصيل 2٪ -4٪ إيزوفلوران مع 21٪ O₂ هواء طبي بمعدل 0.5 لتر / دقيقة لكل لتر من حجم الغرفة.
   ملاحظة: يفضل استخدام 21٪ O₂ هواء طبي أكثر من 100٪ O₂ لهذا النموذج المعين ، لأن تشبع الدم ب O₂ قد يتداخل مع IRI.
2. أخرج الماوس من الحجرة وانقله إلى سطح نظيف منفصل عن منطقة الجراحة. قم بتركيبه مع مخروط الأنف الذي يوفر 1.5٪ إيزوفلوران مع 21٪ O₂ هواء طبي.
3. حقن 1 ملغ/كغ من البوبرينورفين تحت الجلد في منطقة عنق الرحم الظهرية.
4. حقن 200-600 وحدة دولية / كجم من الهيبارين داخل الصفاق لمنع تكون الجلطة خلال فترة الانسداد.
5. ضع مرهم العيون على العينين لمنع تلف القرنية.
6. إزالة الشعر من البطن البطني باستخدام كليبرز .
7. حرك الماوس على بطانية الماء الساخن في منطقة الجراحة. مرة أخرى ، قم بتركيبه مع مخروط الأنف الذي يوفر 1.5٪ إيزوفلوران مع 21٪ O₂ هواء طبي لتحقيق مستوى جراحي للتخدير.
8. ضع الماوس في راقد ظهري وثبت الأطراف على الطاولة بشريط جراحي.
9. راقب درجة حرارة جسم عن طريق المستقيم باستخدام مقياس حرارة خاص بالقوارض. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية طوال مدة الجراحة.
10. تطهير البطن البطني باستخدام شاش معقم منقوع إما في فرك الكلورهيكسيدين أو فرك البوفيدون اليود ، تليها 70 ٪ من الكحول. كرر هذا التسلسل ثلاث مرات ، بالتناوب بين المقشر والكحول. يجب استخدام مجموعة جديدة من الدعك وشاش الكحول في كل مرة.
    1. ضع المقشر والكحول بحركة دائرية ، بدءا من دوائر صغيرة في وسط موقع الجراحة والعمل تدريجيا نحو الحواف عن طريق زيادة حجم الدوائر. تخلص من الشاش بمجرد الوصول إلى حافة موقع الجراحة. لا تفرك للخلف من الحافة إلى المركز.
11. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم (منعكس الدواسة) لضمان تخدير بالكامل.
12. ارتداء قفازات معقمة. ثني موقع الجراحة بشكل معقم.

3. الجراحة ونقص التروية

1. قم بعمل شق بطني في البطن بطول 3-5 سم في الجلد باستخدام شفرة مشرط # 15 ، وقم بتشريحه خاليا من اللفافة العضلية الأساسية ، واعكسه بشكل جانبي. استمر في شق جدار البطن على طول خط ألبا باستخدام مقص تشريح دقيق أو مقص دقيق محمل بنابض وضع المبتعد في موضعه.
2. ضع وسادات شاش معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم دافئ حول منطقة العملية.
3. قم بإزالة الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن ، اقلبها بشكل قحفي وإلى يسار ، وضعها على الفوط المبللة. ضع ضمادة شاش مبللة أخرى على الأنسجة لمنع الجفاف. بالتنقيط بشكل دوري محلول ملحي معقم دافئ على الشاش للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
4. عزل SMA ، الذي يقع البطني إلى الوريد الأجوف السفلي ، الذيلية إلى الشريان الاضطرابات الهضمية ، والجمجمة إلى الشريان الكلوي.
   ملاحظة: يوضح الشكل 1 موقع ضمور العضلات الشوكي حيث يتم عزله أثناء الجراحة. عادة ما يقع ضمور العضلات الشوكي بطنيا إلى الوريد الأجوف السفلي ويمتد نحو اليمين. عندما تكون الأمعاء خارجية وتنقلب إلى اليسار أثناء الجراحة ، تقع ضمور العضلات الشوكي على يسار الوريد الأجوف السفلي.
5. ضع مشبكا للأوعية الدموية الدقيقة الرضحية عبر قاعدة ضمور العضلات الشوكي حيث يتفرع من الشريان الأورطي البطني ، مما يضمن أن المشبك لا يسد الوريد المساريقي العلوي.
6. تحقق من نقص تروية الأمعاء الدقيقة من خلال ملاحظة تغير اللون من اللون الوردي إلى الأبيض الباهت وفقدان النبض المساريقي.
7. أعد الأحشاء إلى موضعها الأصلي داخل تجويف البطن طوال فترة نقص تروية. إزالة المبعدة وتغطية شق مع الشاش الرطب. أضف محلول ملحي معقم دافئ بشكل دوري إلى الشاش لمنع الجفاف والحفاظ على درجة حرارة الجسم.
8. بعد فترة 45 دقيقة من نقص التروية (يتم تمييز بدايتها بالتطبيق الأولي للمقطع) ، قم بإزالة مقطع الانسداد. تحقق من استعادة تدفق الدم من خلال مراقبة النبض المساريقي واللون المتدفق.
9. ضع محلول ملحي معقم دافئ داخل الصفاق قبل الإغلاق النهائي مباشرة للحفاظ على الترطيب المناسب.
10. أغلق عضلات البطن بخياطة polyglactin 910 6-0. يجب تطبيق بوبيفاكايين (حتى 2 ملغ/كغ) على طول خط شق العضلات لتخفيف الألم. أغلق الجلد باستخدام الدبابيس الجراحية أو مشابك الجرح.

4. الانتعاش وإعادة التروية

1. أعد الماوس إلى غرفة دافئة أو قفص على بطانية مائية متداولة أو جهاز تدفئة يدوي أو مصدر حرارة مناسب آخر. قم بتوصيل 21٪ O₂ بمعدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة لكل لتر من حجم الغرفة. دع الماوس يتعافى هنا لمدة 90 دقيقة. راقب الماوس كل 5-10 دقائق بحثا عن علامات الألم أو الضيق ، مثل وضعية الانحناء والتحديق والإحجام عن الحركة.

5. القتل الرحيم وجمع الدم

1. في نهاية فترة التعافي البالغة 90 دقيقة ، أعد الماوس إلى غرفة الحث وقم بتوصيل 2٪ -4٪ إيزوفلوران مع 21٪ O₂ بمعدل 0.5 لتر / دقيقة من حجم الغرفة لإعادة التخدير الكامل.
2. نقل مرة أخرى إلى منطقة الجراحة وتناسبه مع مخروط الأنف تسليم 2٪ -4٪ إيزوفلوران مع 21٪ O₂ لتحقيق التخدير العميق.
   ملاحظة: CO₂ ليست طريقة مناسبة للقتل الرحيم لهذا الإجراء ، لأنه يحفز التغيرات الفسيولوجية التي قد تتداخل مع الإصابة الإقفارية أو تحليل الأنسجة¹³.
3. أعد فتح شق خط الوسط البطني وقم بإجراء نزيف طرفي عن طريق جمع أكبر قدر ممكن من الدم من الوريد الأجوف البطني باستخدام إبرة وحقنة 23 جرام. توقع جمع ما بين 0.3-0.5 مل من الدم (أقل في الفئران التي خضعت ل IRI ، وأكثر في أولئك الذين تلقوا بضع البطن الوهمي).
   ملاحظة: الغرض من النزيف النهائي هو المساعدة في القتل الرحيم الإنساني وجمع الدم والحفاظ عليه للاختبار المستقبلي (أي كيمياء المصل ، PCR ، ELISA).
4. بعد جمع الدم ، يتم قطع الشريان الأورطي البطني للسماح بالاستنزاف الكامل.
5. إجراء إما خلع عنق الرحم أو بضع الصدر كإجراء ثانوي لضمان القتل الرحيم الناجح.

6. معالجة الأنسجة للأنسجة

1. بعد القتل الرحيم ، اجمع الأنسجة المطلوبة. تأكد من أن معالجة الأنسجة تتم على الفور ، حيث يبدأ التحلل الذاتي فور الوفاة^14,15.
   1. الأمعاء: جمع كامل طول الأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة. تخلص من الأعور.
   2. الكبد: اجمع الفصوص المتوسطة اليسرى واليسرى المتوسطة واليمنى.
   3. الكلى: جمع كلتا الكليتين. حسب الاتفاقية ، يتم قطع الكلية اليسرى طوليا ، ويتم قطع اليمين كمقطع عرضي في وقت التشريح.
      ملاحظة: يمكن استخدام القولون والكبد والكلى لتقييم فشل الأعضاء المتعددة أو الآثار الجهازية الأخرى لل IRI. تستخدم الأمعاء الدقيقة لتقييم الإصابة الأولية. ليس من الضروري تتبع الأقسام الفردية من فص الكبد والكلى ، حيث سيتم تحليل كل عضو وتسجيله كوحدة واحدة. ومع ذلك ، يجب أن تبقى الأجزاء المعوية منفصلة ثم يتم تصنيفها وتسجيلها بشكل فردي.
2. قسم الأمعاء إلى أربعة أقسام: الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون. تأكد من أن الأجزاء المعوية الثلاثة الصغيرة متساوية في الطول. قم بذلك عن طريق طي الأمعاء الدقيقة في شكل "Z" ، حيث الخط العلوي هو الاثني عشر ، والخط الأوسط هو الصائم ، والخط السفلي هو الدقاق. من المهم تتبع النهاية القريبة مقابل النهاية البعيدة.
3. اغسل تجويف الأجزاء المعوية بالمحلول الملحي باستخدام حقنة سعة 10 مل ملصقة بقسطرة وعائية 20 جرام.
4. قبل عمل الأقسام ، ضع كل جزء معوي مسطحا بحيث يكون الجانب اللمعي متجها لأعلى. باستخدام حقنة 3 مل مثبتة بإبرة 27 جم وتطبيق بسخاء 10٪ من الفورمالين المخزن بالتنقيط لتغطية كامل طول الغشاء المخاطي. بعد ذلك ، لف كل جزء من الأمعاء على حدة وضعه في أشرطة أنسجة منفصلة تحمل ملصقات.
   1. للتدحرج ، ضع كل جزء بشكل مسطح بحيث يكون الجانب اللمعي متجها لأعلى ، ثم لفه بشكل محيطي حول عود أسنان. يجب أن يشكل الجزء القريب الجزء الداخلي من اللفة. يجب أن يواجه التجويف الداخل / المركز. حاول أن تتدحرج برفق قدر الإمكان لتجنب ضغط الزغب.
   2. عند لفها ، يجب أن تبدو الأمعاء مثل لفة سويسرية. ضع اللفة السويسرية الحلزونية ووجهها لأعلى داخل الكاسيت.
5. ضع المناديل في قوارير تحمل علامات مملوءة بنسبة 10٪ من الفورمالين المخزن لتثبيتها في درجة حرارة الغرفة. الإفراط في الإصلاح أفضل من الإصلاح الناقص. يجب أن تكون القوارير كبيرة مع الكثير من الفورمالين - على الأقل 20x أكثر تثبيتا من الأنسجة.
   1. الأمعاء: ضع الكاسيتات الأربعة معا في كوب عينة. إصلاح لمدة 24-48 ساعة.
   2. الكبد: ضع فصوص الكبد معا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إصلاح لمدة 24-48 ساعة.
   3. الكلى: ضع الكلى معا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. إصلاح لمدة 48-72 ساعة.
      ملاحظة: تستغرق الكلى غير المشذبة وقتا أطول للإصلاح من الكلى المشذبة. لتقصير وقت التثبيت إلى 24-48 ساعة ، يمكن قطع الكلى على طول المستوى المتوسط ، طوليا (الكلية اليسرى) وبشكل عرضي (الكلية اليمنى) ، ووضعها في أشرطة قبل إيداعها في الفورمالين.
6. بعد تثبيت الأنسجة في الفورمالين للوقت المحدد ، اشطفها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو ماء مقطر وانقله إلى قوارير ملصقة مملوءة بنسبة 70٪ EtOH. يمكن تخزين الأنسجة في EtOH إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة أثناء انتظار الأنسجة.
   1. الأمعاء: ضع الكاسيتات الأربعة معا في كوب عينة.
   2. الكبد: ضع فصوص الكبد معا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   3. الكلى: ضع الكلى معا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
7. عندما تكون جاهزا ، قم بمعالجة الأنسجة على شرائح زجاجية باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). تقليم الأنسجة المثبتة بالفورمالين ثم تضمينها في البارافين. قم بتركيب أقسام بخمسة ميكرون على الشرائح وصمة عار باستخدام H&E.

7. تسجيل الأنسجة

1. يفضل أن يتم تسجيل الأنسجة من قبل موظفين ذوي خبرة أعمى عن مجموعات العينة.
2. يتم تسجيل نقص التروية المعوية باستخدام نظام تسجيل Chiu / Park¹⁷.
3. يتم تسجيل تلف الكلى باستخدام نظام تسجيل Jablonski^18,19.
4. يتم تسجيل تلف الكبد باستخدام نظام تسجيل سوزوكي^20,21.
   ملاحظة: هناك العديد من أنظمة التسجيل المستخدمة حاليا لتقييم تلف الأنسجة في نماذج القوارض من IRI المعوية. تم اختيار أنظمة التسجيل المستخدمة في هذه الدراسة لتقليل التقدير التعسفي وتعظيم التقييم النوعي المتعمد (الجدول 1).

أظهرنا نموذجا من IRI المعوي في الفئران التي أسفرت عن نتائج متسقة وقابلة للتكرار. تم تقسيم الأمعاء الدقيقة والقولون القريب والكلى والكبد وتلطيخها ب H&E. قام أخصائي علم الأمراض البيطري بتصنيف إصابة الأنسجة باستخدام أنظمة التسجيل المذكورة سابقا (الجدول 1). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل عامل واحد للتباين (ANOVA) متبوعا بتحليل توكي اللاحق مع المقارنات الزوجية ، والتي حددت ما إذا كان هناك اختلاف كبير في البيانات داخل المجموعات وفيما بينها أم لا. واعتبرت القيمة الاحتمالية الأقل من أو التي تساوي 0.05 هي الحد الفاصل لإثبات الدلالة الإحصائية. تم إجراء جميع الاختبارات الإحصائية والرسوم البيانية في برنامج جداول البيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) مع الوظيفة الإضافية Real Statistics Resource Pack. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).

زادت درجات الآفات المجهرية للأجزاء المعوية الدقيقة الثلاثة (الاثني عشر والصائم والدقاق) بشكل كبير بالنسبة للحيوانات التي تعاني من إصابة نقص التروية المعوية (IRI; N = 7) مقابل أولئك الذين خضعوا لبضع البطن الوهمي (الشام ؛ ن = 6) (الشكل 2 والشكل 3). كان الخطأ المعياري لهذه البيانات ضيقا ، مما يدل على اتساق النتائج داخل المجموعات وفيما بينها. أسفرت كل شريحة معوية في مجموعة الشام عن نفس متوسط درجة بارك / تشيو البالغ 0.83. كان SEM للاثني عشر والصائم والدقاق في مجموعة الشام 0.31 و 0.40 و 0.31 على التوالي. كان متوسط درجات بارك / تشيو للاثني عشر والصائم والدقاق في مجموعة IRI 4.07 ± 0.44 و 4.14 ± 0.46 و 5.14 ± 0.40 على التوالي.

في هذه الدراسة ، توفي 50٪ (3/6) من الفئران الأولية التي خضعت لنقص التروية لمدة 60 دقيقة و 120 دقيقة من إعادة التروية (مجموعة 60/120). تم تقديم اثنين من الفئران الثلاثة للتشريح. كان لدى كلا الفئران نخر ظهاري واحتقان ونزيف في الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، كان لدى الفئران انحلال اللمفاويات ، وهو تغيير غير محدد مرتبط بالإجهاد الفسيولوجي. لم يكن لدى أي من الفأرين آفات في القلب أو الرئة أو الكبد أو الكلى. أدى تقصير الأوقات إلى 45 دقيقة من نقص التروية و 90 دقيقة من التروية وإضافة 400 وحدة دولية / كجم من الهيبارين (مجموعة 45/90 / ساعة) إلى خفض معدل الوفيات إلى 20٪ (1/5) دون تغيير درجات الإصابة المعوية (الشكل 4). كان متوسط درجة بارك / تشيو لمجموعة 60/120 4.56 ± 0.38 (N = 3) ، وكان متوسط النتيجة لمجموعة 45/90 / H 4.375 ± 0.38 (N = 4).

لم تظهر النتائج المجهرية التي تشير إلى إصابة في القولون القريب والكبد والكلى في الفئران 60/120 أو الفئران 45/90 / H.

الجدول 1: أنظمة تسجيل الأمعاء والكلى والكبد. تم تصنيف الضرر المعوي باستخدام نظام Chiu / Park¹⁷. تم تصنيف تلف الكلى باستخدام نظام تسجيل Jablonski^18,19. تم تصنيف تلف الكبد باستخدام نظام تسجيل سوزوكي^20,21. تم تكييف هذا الجدول مع أذونات من أنظمة التسجيل المقدمة في Quaedackers et ^al.17 و Du et ^al.19 و Behrends et ^al.21. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل 1: موقع الشريان المساريقي العلوي (SMA) وعزله. (أ) عادة ما يقع ضمور العضلات الشوكي بطنيا إلى الوريد الأجوف السفلي ويمتد نحو يمين. وهي تقع بين الشريان البطني والشريان الكلوي. تم تكييف هذا الرقم بإذن من تشريح فأر المختبر بواسطة مارغريت كوك (1965) ²². (ب) في هذا الإجراء، تكون الأمعاء خارجية وتقلب إلى اليسار (مغطاة بشاش مبلل في هذه الصورة)، ومن ثم تقع ضمور العضلات الشوكي (السهم الأصفر) على يسار الوريد الأجوف السفلي (السهم الأزرق). الاختصارات: RK = الكلية اليمنى. D = الاثني عشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: شرائح معوية دقيقة ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين. ظهرت مقاطع من الصائم (A) والدقاق (B) من الفئران في مجموعة الشام الزغابات التي كانت طويلة ورقيقة دون تشويه. ظهرت أقسام الصائم (C) والدقاق (D) من الفئران في مجموعة IRI مناطق نخر (علامات نجمية) ونزيف مع تقشير وتشويه الزغابات المتبقية (الأسهم). الصور مأخوذة من الفئران التي خضعت لنقص التروية لمدة 45 دقيقة و 90 دقيقة من التروية وتلقت 400 وحدة دولية / كجم من الهيبارين. تم التقاط الصور بتكبير 20x مع تكبير 10٪. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: درجات بارك / تشيو للقطاعات المعوية الصغيرة. زاد الضرر المجهري لجميع الأجزاء المعوية الثلاثة (الاثني عشر ، الصائم ، والدقاقي) للحيوانات التي تخضع لإصابة نقص التروية المعوية (IRI) بشكل كبير مقارنة بتلك التي خضعت لبضع البطن الوهمي (الشام). * p < 0.05 ل IRI مقابل الشام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: درجات بارك / تشيو للأمعاء الدقيقة التي تخضع لنقص التروية لمدة 60 دقيقة و 120 إعادة تروية مقابل 45 دقيقة من نقص التروية و 90 دقيقة من التروية مع 400 وحدة دولية / كجم من الهيبارين. إن تقليل الأوقات من 60 دقيقة من نقص التروية و 120 دقيقة من التروية (60/120) إلى 45 دقيقة من نقص التروية و 90 دقيقة من التروية مع 400 وحدة دولية / كجم من الهيبارين (45/90 / ساعة) لم يخلق فرقا ذا دلالة إحصائية في درجات إصابة بارك / تشيو للأمعاء الدقيقة للفئران في مجموعة IRI. ومع ذلك ، فقد خفضت معدل الوفيات من 50٪ إلى 20٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لنموذج IRI المعوي هذا ، إلا أنه لا يخلو من قيوده. على سبيل المثال ، لا يؤدي الانسداد الوحيد لقاعدة ضمور العضلات الشوكي فقط إلى إعاقة تدفق الدم إلى الأمعاء تماما. من المحتمل أن يكون هذا بسبب الدورة الدموية الجانبية الواسعة في المساريق ، والتي يمكن أن تسحب الدم من الفروع المجاورة للشريان الأورطي البطني. في إحدى الدراسات التي أجريت على القطط ، أدى انسداد ضمور العضلات الشوكي إلى انخفاض تدفق الدم بنسبة 35٪ في الاثني عشر القريب ، و 61٪ في الاثني عشر البعيد ، و 71٪ في الصائم والدقاق ، و 63٪ في القولون القريب. لم ينخفض تدفق الدم في القولون الأوسط والبعيد ، الذي يتلقى الكثير من الدورة الدموية من الشريان المساريقي السفلي²³. في القوارض ، غالبا ما يشار إلى الصائم والدقاق على أنهما الأجزاء المعوية التي تتعرض لأهم إصابة في الأنسجة بعد انسداد ضمور العضلات الشوكي⁹.

تم الاستشهاد بمجموعة واسعة من أوقات نقص التروية بعد انسداد ضمور العضلات الشوكي في الأدبيات ، من 1 إلى 90 دقيقة أو أكثر. تؤدي الأوقات الإقفارية المختلفة إلى مستويات مختلفة من إصابة التروية. لاحظ Park et al. إصابة التروية عندما كان الفاصل الإقفاري بين 40 و 60 دقيقة ، ولكن ليس عندما كان الفاصل الإقفاري أقصر أو أطول²⁴. تشير هذه النتائج إلى أن الأوقات الأقصر لا تنتج ما يكفي من نقص التروية للتحريض على إصابة التروية ، في حين أن الأوقات الأطول تلحق الضرر بالأنسجة بشدة بحيث يستحيل إثبات إصابة التروية التي تليها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأوقات الإقفارية الأطول تحمل خطر زيادة معدل الوفيات. كما رأينا في دراستنا ، توفي 50٪ (3/6) من الفئران الأولية التي خضعت لنقص التروية لمدة 60 دقيقة بعد 90 دقيقة فقط من إعادة التروية. أدى تقصير وقت نقص التروية إلى 45 دقيقة إلى خفض معدل الوفيات إلى 20٪ (1/5) دون تغيير درجات إصابة الأنسجة. بناء على دراستنا ، يبدو أنه يمكن تحقيق النافذة المثالية للتلف الإقفاري عن طريق انسداد ضمور العضلات الشوكي لمدة 45 دقيقة تقريبا.

متغير آخر هو وقت إعادة التروية قبل جمع الأنسجة. كما هو الحال مع أوقات نقص التروية ، تختلف أوقات إعادة التروية بشكل كبير عبر الدراسات ، من 60 دقيقة إلى أكثر من 24 ساعة. ذكرت العديد من الأوراق أن الغشاء المخاطي في الأمعاء يتكبد أقصى ضرر مورفولوجي عند 2 إلى 3 ساعات من التروية ، مع تحقيق إصلاح كامل في 24 ساعة^25،26،27. إن جمع الأنسجة قبل هذه النافذة التي تتراوح مدتها من 2 إلى 3 ساعات يخاطر بعدم التقاط المدى الكامل لإصابة التروية ، في حين أن الأنسجة التي يتم حصادها بالقرب من 24 ساعة ستكون قد بدأت بالفعل عملية الإصلاح. اخترنا في البداية وقت إعادة ضخ 120 دقيقة ، ولكن بعد ذلك تغير إلى 90 دقيقة في محاولة لخفض معدل الوفيات. لم يغير هذا التغيير نتائج إصابة الأنسجة ، مما يشير إلى أن انحراف 30 دقيقة عن نافذة 2 إلى 3 ساعات مقبول.

تركيز الأكسجين هو أيضا متغير مهم في تطوير IRI. وجد Wilding et al. أنه بالمقارنة مع الفئران التي تتلقى 21٪ O₂ ، فإن أولئك الذين تم تخديرهم بالإيزوفلوران الذين تم تسليمهم بنسبة 100٪ O₂ عانوا من عدم تطابق التهوية والتروية بسبب انخماص. في نفس الدراسة ، أصيبت الفئران التي تتلقى 100٪ O₂ بالحماض التنفسي الحاد وارتفاع متوسط الضغط الشرياني²⁸. من الأفضل تجنب مثل هذه التغيرات الفسيولوجية عند إحداث إصابة مثل IRI ، والتي يشارك فيها عدد من العوامل الجهازية. وبالتالي ، يبدو أن 21٪ O₂ أكثر ملاءمة من 100٪ O₂ كغاز ناقل لتوصيل الأيزوفلوران.

استخدام الهيبارين في هذا البروتوكول مفتوح للنقاش. من المعروف أن الهيبارين له تأثيرات مضادة للتخثر ومضادة للالتهابات²⁹. وجدنا أن التغيير من نقص التروية لمدة 60 دقيقة و 120 دقيقة من التروية إلى نقص التروية لمدة 45 دقيقة و 90 دقيقة من التروية مع 400 وحدة دولية / كجم من الهيبارين لم يغير الإصابة المعوية المجهرية ولكنه أدى إلى انخفاض معدل الوفيات. أحد التفسيرات المحتملة هو أن الهيبارين منع الجلطات الدموية القاتلة للأعضاء البعيدة مثل الرئتين والدماغ ، ومع ذلك لم نجد دليلا على ذلك على التشريح عن طريق الفحص الإجمالي أو المجهري للفئران الأوليين اللذين ماتا. قد يكون استخدام أوقات نقص التروية وإعادة التروية الأقصر بدون الهيبارين بنفس الفعالية في تقليل الوفيات. إذا كان الأمر كذلك ، فسيكون من الحكمة التخلي عن استخدام الهيبارين لتقليل التداخل مع IRI. ومع ذلك ، قد يكون تضمين الهيبارين في البروتوكول مناسبا لأولئك الذين يرغبون في نمذجة الأسباب الجراحية لل IRI ، حيث أن مرضى الجراحة غالبا ما يتلقون الهيبارين في الفترة المحيطة بالجراحة.

ثبت أن الإيزوفلوران له تأثيرات وقائية للأنسجة في حالات التهاب الأمعاء ونقص التروية ، وقد يتداخل استخدامه مع نموذج IRI ذي الصلة سريريا^30،31،32. ومع ذلك ، فإن المستنشقات العضوية الفلورية (أي الأيزوفلوران ، سيفوفلوران) تستخدم عادة في التخدير في كل من الطب البيطري والبشري. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مدة التخدير المطلوبة لهذا البروتوكول تتجاوز 120 دقيقة ، وبالتالي فإن المستنشق أكثر ملاءمة من الحقن قصير المفعول الذي يحتاج إلى إعادة الجرعة.

لم تكن هناك آفات مجهرية موجودة في القولون القريب أو الكبد أو الكلى. ربما كان عدم وجود تغييرات مجهرية بسبب وقت إعادة التروية القصير نسبيا من 90 إلى 120 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي القولون القريب على إمدادات دموية من الشريان المساريقي السفلي. ومع ذلك ، فإن عدم وجود ضرر مرئي لا يستبعد الإصابة الجهازية. من المحتمل أن يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) منهجية أفضل لإثبات الإصابة الجهازية عن طريق قياس السيتوكينات الالتهابية مثل TNF-α.

تم تطوير العديد من الاختلافات في نموذج IRI المعوي هذا على مر السنين. في عام 1990 ، أظهر Megison et al. أن انسداد الأوعية الجانبية بالإضافة إلى ضمور العضلات الشوكي أنتج انخفاضا أكثر اتساقا في تدفق الدم المساريقي ولكن زيادة في معدل الوفيات³³. أظهرت دراسة أحدث أنه بدلا من انسداد ضمور العضلات الشوكي في قاعدته ، فإن ربط فروعه المحيطية والجانبية للحث على نقص التروية في الدقاق البعيد أدى إلى إصابة قابلة للتكاثر دون وفيات³⁴. يضمن انسداد الفروع الشريانية المحلية نقص التروية الأقصى وقد يعالج مشكلة التخفيضات القطاعية متعددة البؤر لتدفق الدم التي تظهر مع ربط ضمور العضلات الشوكي في قاعدته مباشرة. في حين أن هذه الطريقة البديلة لنمذجة IRI المعوية لها تطبيق للبحث في تأثيرات الأنسجة المحلية لل IRI المعوي ، فمن غير المعروف ما إذا كان بإمكانها نمذجة الالتهاب الجهازي والفشل متعدد الأعضاء بدقة والذي يمكن أن يرتبط بإصابة الأمعاء.

انسداد ضمور العضلات الشوكي ليس نموذجا مناسبا لجميع أنواع IRI المعوية. على سبيل المثال ، يتميز نقص التروية المساريقي غير الانسدادي بنقص التروية البلانشية الناجم عن انخفاض النتاج القلبي. لذلك ، لن تكون هذه التقنية مثالية لدراسة IRI المعوي الناجم عن احتشاء عضلة القلب أو قصور القلب الاحتقاني أو قصور الأبهر أو أمراض الكلى أو الكبد³⁵. أفاد كوزار وآخرون أن انسداد ضمور العضلات الشوكي هو ، مع ذلك ، نموذج مناسب سريريا ل IRI المعوي الناجم عن الصدمة³⁶. على الرغم من أنه أقل اقتصادا ، إلا أن استخدام الأنواع الأخرى مثل الخنازير قد يكون له فوائد على القوارض لنمذجة بعض حالات الإصابة المعوية. تصف مراجعة شاملة أجراها Gonzalez et al. في عام 2014 النماذج الحيوانية المستخدمة حاليا للتحقيق في IRI^{المعوي 9}.

على الرغم من قيودها ، تظل تقنية انسداد ضمور العضلات الشوكي في قاعدتها واحدة من أكثر نماذج القوارض شيوعا لنقص التروية^{المعوية 9}. نظرا لأنها لا تتطلب سوى مشبك وعائي واحد وإعداد أساسي ، فإن الجراحة نفسها بسيطة للغاية. كما أنه يؤدي إلى إصابة قابلة للتكرار ، كما يتضح من البيانات المقدمة هنا. يمكن أن يؤدي انسداد ضمور العضلات الشوكي في القوارض إلى نمذجة الأسباب الانسدادية ل IRI المعوي بشكل موثوق ويمكن أن يكون له تطبيق عملي في كل من الطب البيطري والبشري. وعلى هذا النحو، من المهم أن تنفذ الإجراءات التي حددناها هنا باتساق.

ليس لدى مؤلفي هذه الورقة أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل قسم البحوث الداخلية للمعهد الوطني للقلب والرئة والدم ، المعاهد الوطنية للصحة.

نود أن نشكر الدكتور جيمس هوكينز على إرشاده ودعمه. كما نشكر الدكتور ميهاي أولتين وروبرت لينفورد على مساعدتهما في تحديد موقع الشريان المساريقي العلوي. نود أن نعرب عن شكرنا للدكاترة باتريشيا كارفاليو عبيد إلريش وكلاوديو كوريا ناتاليني وجورج هاول الثالث على تقديم خبراتهم أثناء تطوير هذا البروتوكول. أخيرا ، نود أن نشكر ستيفن وينكوفيتش على مساعدته في الحصول على الصور المجهرية الجميلة الواردة في هذه الورقة والدكتورة أليسيا أوليفييه لمساعدتها في وضع العلامات وتقديم الأرقام النهائية.