JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول ويصف خطوات عزل وتشريح وزراعة وتلطيخ نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من فأر بالغ. هذه الطريقة مفيدة كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية المختلفة في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري.

Abstract

أحد التحديات في أبحاث شبكية العين هو دراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. إن عزل الخلايا العصبية الشبكية وزراعتها والحفاظ عليها في المختبر لها قيود تقنية وبيولوجية. قد تتغلب زراعة نباتات الشبكية على هذه القيود وتقدم نموذجا فريدا خارج الجسم الحي لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مع معلمات كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تعد زراعة الشبكية أداة فحص فعالة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة نباتات الشبكية لفترة طويلة. تعرض المخطوطة أيضا بعض المشكلات الفنية أثناء هذا الإجراء والتي قد تؤثر على النتائج المرجوة وقابلية استنساخ مزرعة زراعة الشبكية. أظهر التلوين المناعي للأوعية الشبكية والخلايا الدبقية والخلايا العصبية الشعيرات الدموية الشبكية السليمة والخلايا العصبية بعد 2 أسابيع من بداية ثقافة زراعة الشبكية. هذا يؤسس لزرع الشبكية كأداة موثوقة لدراسة التغيرات في الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في ظل ظروف تحاكي أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري.

Introduction

تم تقديم نماذج مختلفة لدراسة أمراض الشبكية ، بما في ذلك النماذج في الجسم الحي وفي المختبر. لا يزال استخدام الحيوانات في البحث مسألة نقاش أخلاقي ومتعدي مستمر1. تستخدم النماذج الحيوانية التي تنطوي على القوارض مثل الفئران أو الجرذان بشكل شائع في أبحاث شبكية العين2،3،4. ومع ذلك ، فقد نشأت مخاوف سريرية بسبب الوظائف الفسيولوجية المختلفة لشبكية العين في القوارض مقارنة بالبشر ، مثل غياب البقعة أو الاختلافات في رؤية الألوان5. كما أن استخدام عيون ما بعد الوفاة البشرية لأبحاث الشبكية له العديد من المشاكل ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاختلافات في الخلفيات الجينية للعينات الأصلية ، والتاريخ الطبي للمتبرعين ، والبيئات أو أنماط الحياة السابقة للمتبرعين6. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النماذج في المختبر في أبحاث الشبكية له بعض العيوب أيضا. تشمل نماذج زراعة الخلايا المستخدمة لدراسة أمراض الشبكية استخدام خطوط الخلايا ذات الأصل البشري أو الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية7. لقد ثبت أن نماذج زراعة الخلايا المستخدمة تعاني من مشاكل من حيث كونها ملوثة أو غير محددة بشكل خاطئ أو غير متمايزة8،9،10،11. في الآونة الأخيرة ، أظهرت تقنية الشبكية العضوية تقدما كبيرا. ومع ذلك ، فإن بناء شبكية العين المعقدة للغاية في المختبر له العديد من القيود. على سبيل المثال ، لا تتمتع عضويات الشبكية بنفس الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الناضجة في شبكية العين الحية. للتغلب على هذا القيد ، يجب أن تدمج تقنية الشبكية العضوية المزيد من الميزات البيولوجية والخلوية ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والخلايا المناعية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة12،13،14،15.

ظهرت نباتات الشبكية العضوية كأداة موثوقة لدراسة أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية16،17،18،19. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الموجودة ، فإن استخدام نباتات الشبكية يدعم كلا من مزارع خلايا الشبكية في المختبر وكذلك النماذج الحيوانية الحالية في الجسم الحي عن طريق إضافة ميزة فريدة لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة تحت نفس المعلمات البيوكيميائية ومستقلة عن المتغيرات الجهازية. تسمح مزارع explant بالاحتفاظ بخلايا شبكية مختلفة معا في نفس البيئة ، مما يسمح بالحفاظ على تفاعلات شبكية العين بين الخلايا20،21،22. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن نباتات الشبكية كانت قادرة على الحفاظ على البنية المورفولوجية ووظائف خلايا الشبكية المستزرعة23. وبالتالي ، يمكن أن توفر نباتات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية24،25،26. توفر مزارع زراعة الشبكية تقنية يمكن التحكم فيها وهي بديل مرن للغاية لل mothods الموجودة التي تسمح بالعديد من التلاعب الدوائي ويمكن أن تكشف عن العديد من الآليات الجزيئية27.

الهدف العام من هذه الورقة هو تقديم تقنية زراعة الشبكية كنظام نموذج وسيط معقول بين مزارع الخلايا في المختبر والنماذج الحيوانية في الجسم الحي . يمكن لهذه التقنية محاكاة وظائف الشبكية بطريقة أفضل من الخلايا المنفصلة. نظرا لأن طبقات الشبكية المختلفة تظل سليمة ، يمكن تقييم التفاعلات بين الخلايا في الشبكية في المختبر في ظل ظروف كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن عمل نظام الأوعية الدموية28.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة أوكلاند ، روتشستر ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.

1. إعداد الحيوانات

  1. حافظ على الحيوانات تحت درجة حرارة ثابتة في بيئة يتم التحكم فيها بالضوء. يجب أن تتبع إعدادات درجة الحرارة لغرفة سكن الحيوانات الإرشادات المنصوص عليها في "دليل رعاية واستخدام المختبر". تتراوح درجة حرارة الفئران بين 18 درجة مئوية و 26 درجة مئوية. حافظ على مستويات الرطوبة التي يتم التحكم فيها وضبطها على حوالي 42٪.
  2. لهذه التجربة ، استخدم ذكور الفئران C57BL / 6J (تحقق من جدول المواد للحصول على التفاصيل) التي يزيد عمرها عن 12 أسبوعا (تم استخدام فأر بالغ لهذا البروتوكول).
    ملاحظة: تم استخدام سلالة من النوع البري في هذا البروتوكول للعرض التوضيحي ، حيث لم يكن لديها أي تشوهات وراثية تؤثر على شبكية العين. ومع ذلك ، يمكن للمرء استخدام سلالات أخرى ، بما في ذلك السلالات التي تم التلاعب بها وراثيا ، لثقافة زراعة الشبكية.
  3. توفير دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة عبر التحكم في الإضاءة في غرف إسكان الحيوانات.
  4. افحص كل للتأكد من صحته وتناول الطعام والماء الكافي مرتين يوميا خلال الأسبوع ومرة واحدة يوميا في عطلات نهاية الأسبوع. تأكد من تزويدهم بالطعام الطازج والمياه النظيفة.
  5. إذا كانت مستويات الطعام والماء منخفضة خلال الأسبوع ، اشطف زجاجة الماء وأعد تعبئتها. أضف الطعام الطازج عند الحاجة. تغيير الأقفاص المتسخة يوميا أو حسب الحاجة لصحة الحيوانات.
    ملاحظة: لدراسة المستقبلات الضوئية والتغيرات التي يسببها الضوء في شبكية العين ، قم بتكييف الفئران المظلمة طوال الليل في صندوق مظلم خاص يقع في غرفة مظلمة في منشأة الحيوانات.
  6. القتل الرحيم للحيوانات في قفصها المنزلي عن طريق جرعة زائدة من استنشاق CO 2 باستخدام غاز CO 2 المضغوط في اسطوانات متصلة بغرفة CO 2. إجراء تأكيد الوفاة باستخدام طريقة ثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم.
  7. بعد الانتهاء من الإجراء ، تأكد من موت الحيوان بالطريقة المناسبة ، مثل تأكيد السكتة القلبية والتنفسية أو مراقبة التلاميذ الثابتة والمتوسعة للحيوان.

2. إعداد الأنسجة

  1. بمجرد القتل الرحيم للحيوان ، قم بتنظيف المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح الجفون بيد واحدة بحيث تكون العين مرئية. قم بالضغط على الأجزاء العلوية والسفلية من المدار باليد المعاكسة باستخدام ملقط منحني حتى تبرز الكرة الأرضية.
  2. لاستئصال العين ، أغلق الملقط برفق على الجزء الخلفي من العين ، وارفعه بحركة مستمرة. باستخدام ملقط ، أمسك مقلة العين من العصب البصري. تأكد من استخدام أدوات التشريح المعقمة لجميع الخطوات والعمل في ظل ظروف معقمة كاملة.
  3. اغمر كل مقلة عين في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من HBSS المثلج مع البنسلين الستربتومايسين (10000 وحدة / مل). اغسل مقلة العين في HBSS مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. انقل مقلة العين إلى أنبوب سعة 1.5-2 مل يحتوي على وسائط كاملة (10٪ FBS ، 2٪ B27 ، 1٪ N2 ، 1٪ L-جلوتامين ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين).

3. تشريح الأنسجة

  1. تشريح الشبكية بعناية تحت مجهر التشغيل، كما هو موضح بالتتابع في الشكل 1.
    1. قم بعمل شق محيطي حول الحافة لفتح مقلة العين. إزالة القرنية عن طريق التشريح الدائري على طول حدود القرنية والشق (القزفي) ، تليها إزالة الجزء الأمامي والعدسة والجسم الزجاجي ، وترك كوب العين فارغا.
    2. من خلال إمساك منطقة رأس العصب البصري بملقط ناعم ، انزع الطبقة الخارجية للعين بلطف. انتبه جيدا أثناء إزالة الغلاف الخارجي حتى لا تجرح الشبكية العصبية ولضمان بقاء الشبكية سليمة تماما.
      ملاحظة: يجب تقشير الشبكية بعناية بعيدا عن ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) ، ويجب إجراء قطع واحد في رأس العصب البصري لفصل الشبكية عن العصب البصري. تأكد بصريا من ذلك عن طريق تحديد الثقب الذي خلفه العصب البصري (رأس العصب البصري).
    3. تشريح شبكية العين شعاعيا إلى أربع قطع متساوية الحجم.
  2. اتبع الخطوات أدناه للتعامل مع القطع الصغيرة من شبكية العين لضمان التوجيه الصحيح لثقافة الشبكية.
    1. باستخدام شفرة مقص تشريح ، افتح أسفل قطعة الشبكية مباشرة (جدول المواد).
    2. ارفع قطعة الشبكية ببطء بطرف شفرة مقص مفتوحة ، وانقلها برفق إلى لوحة الثقافة.
  3. انقل النباتات الخارجية المشتقة من الشبكية المعزولة بشكل منفصل إلى إدخالات زراعة الخلايا في صفيحة مكونة من 12 بئرا ، تحتوي كل منها على 300 ميكرولتر من وسائط زرع الشبكية ، مع توجيه جانب خلية العقدة الشبكية (الشبكية العصبية) لأعلى.
    ملاحظة: تأكد من أن الوسائط هي وسائط DMEM مع مكملات N2 و B27. أضف البنسلين الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) إلى الوسائط أيضا (جدول المواد). تتكون شبكية العين من طبقات متعددة من الخلايا العصبية المترابطة عبر نقاط الاشتباك العصبي وتدعمها من الخارج الطبقة المصطبغة من ظهارة صبغة الشبكية ، وهي الطبقة السوداء التي تمت إزالتها أثناء التشريح.
  4. إزالة أي بقايا من ظهارة مصطبغة. ومع ذلك ، يمكن أن تساعد هذه البقايا في تحديد الاتجاه الصحيح للزرع. تأكد من أن الجزء المصطبغ متجها لأسفل وأن الجزء غير المصطبغ متجها لأعلى.
  5. احتضان مزرعة زراعة الشبكية في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  6. تأكد من أن سطح الشبكية متجها لأعلى. إذا كانت قطعة الشبكية مقلوبة أو مطوية ، فحاول ضبطها برفق على الاتجاه الصحيح.
    ملاحظة: انتبه جيدا للاتجاه الصحيح لزرع الشبكية في لوحة الثقافة. تجنب أي تقليب أو طي للنبات في صفيحة المزرعة لأن ذلك سيؤدي إلى فشل النمو السليم لخلايا الشبكية في الثقافة.

4. زراعة الشبكية

  1. الحفاظ على مزارع زراعة الشبكية (المعدة في الخطوات 3.2-3.3) في حاضنات مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. تغيير نصف وسائل الإعلام من كل بئر كل يوم لمدة 2 أسابيع. افعل ذلك عن طريق سحب 150 ميكرولتر من البئر بعناية. ثم أضف 150 ميكرولتر من الوسائط الطازجة مرة أخرى إلى البئر. تجنب قلب النبات عند تغيير الوسائط.
  3. تحقق من الزرع بعناية تحت المجهر قبل إعادة لوحة الثقافة إلى الحاضنة. فحص سلامة الخلايا وبنية الشبكية تحت مجهر برايتفيلد. تأكد من أن النبات لا يزال موجها بشكل صحيح. استخدم كلا من العدسات الموضوعية 4x و 20x لفحص الزرع.
    ملاحظة: تجنب الغمر الكامل للزرع في الوسائط.

5. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

  1. بعد 2 أسابيع ، إصلاح زرع الشبكية عن طريق إزالة الوسائط. قم بذلك عن طريق الغسيل أولا مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS ثم إضافة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، إلى البئر الذي يحتوي على النبات وتركه طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة دون إزالة حشوات الثقافة من اللوحة. يمكن أيضا نقل النباتات الخارجية إلى أنبوب مخروطي سعة 500 ميكرولتر ، ويمكن إجراء الغسيل والتثبيت داخل الأنبوب.
  2. انقل النبات إلى أنبوب مخروطي سعة 500 ميكرولتر يحتوي على 300 ميكرولتر من 1x PBS-2.5٪ Triton X للغسيل.
  3. اغسل النباتات الثابتة في الأنبوب ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام سرعة متوسطة على شاكر (25 دورة في الدقيقة).
  4. منع التفاعلات غير المحددة المتوقعة عن طريق احتضان explant مع 300 ميكرولتر من 1x مانع عازلة تحتوي على 0.02٪ ثيميروسال لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة قبل حضانة الأجسام المضادة.
  5. احتضان النباتات الثابتة بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
    ملاحظة: الكشف عن الخلايا البطانية للشبكية في النبات الثابت عن طريق تلطيخها بالجسم المضاد GSL I ، BSL I (ليكتين) (7: 1000). الكشف عن الخلايا الدبقية في الشبكية عن طريق تلطيخ الجسم المضاد للبروتين الحمضي الليفي الدبقي للأرانب (GFAP) (1: 250). الكشف عن الخلايا العصبية في شبكية العين عن طريق تلطيخ explant مع الجسم المضاد NeuN الأرنب (1: 250) 29،30. احتضان s{Tual-Chalot, 2013 #117}{Tual-Chalot, 2013 #116}{Tual-Chalot, 2013 #116}ome explants مع تركيبة الليكتين، NeuN، واحتضان الآخرين مع تركيبة الليكتين، GFAP.
  6. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي من الأنابيب عن طريق الشفط باستخدام ماصة. اغسل النباتات باستخدام 1x PBS-2.5٪ Triton X ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
  7. أضف الأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضاد للأرانب IgG (1: 500) (ثانوي ل GFAP و NeuN) وتكساس الأحمر (7: 1,000) (للليكتين). احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام سرعة متوسطة على شاكر.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء ، لذا قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
  8. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الشفط ، ثم اغسلها ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS-2.5٪ Triton X.
  9. انقل النبات من الأنبوب إلى شريحة زجاجية باستخدام ماصة نقل. قم بإزالة أي سائل زائد على الشريحة، ثم أضف قطرة واحدة من وسائط التركيب باستخدام DAPI إلى الشريحة.
  10. قم بتغطية المنديل بغطاء غطاء. لا تسمح بأي فقاعات هواء بين الغطاء والمنديل.
  11. خذ الشرائح الملطخة إلى مجهر التألق ، وابدأ في التقاط الصور. من المهم تغطية الشرائح الملطخة باستخدام صندوق منزلق لأن تلطيخ التألق حساس للضوء.

النتائج

بقاء الخلايا العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في الشبكية في المزرعة خارج الجسم الحي لفترة طويلة
من خلال زراعة نبات شبكية العين باستخدام بروتوكولنا ، نجحنا في الحفاظ على خلايا شبكية مختلفة كانت قابلة للحياة لمدة تصل إلى 2 أسابيع. للتحقق من وجود خلايا شبكية مختلفة ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي لزرع الشبكية باستخدام علامة الخلايا العصبية (NeuN) ، وعلامة الخلايا الدبقية (GFAP) ، وعلامة الأوعية الدموية (isolectin-B4) (الشكل 2). أظهر التلوين خلايا عصبية شبكية جيدة التنظيم ومتطورة وخلايا دبقية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الأوعية الدموية في شبكية العين سليمة من الناحية الهيكلية ، كما يتضح من تلطيخ isolectin-B4. تشير السلامة المورفولوجية لزرع الشبكية ، كما يتضح من التلوين المناعي ، إلى أن ثقافة زراعة الشبكية كانت ناجحة في الحفاظ على خلايا شبكية قابلة للحياة يمكن استخدامها تجريبيا كنموذج. يمكن تقييم وتحليل الظروف التجريبية المختلفة التي سيتم دراستها باستخدام explant عن طريق تلطيخ التألق المناعي لعلامات خلوية متعددة باستخدام برنامج ImageJ. يسمح التلوين المناعي بقياس مستويات النشاط المناعي لكل علامة خلوية وعدد الخلايا المحددة ، مثل عدد خلايا العقدة الشبكية أو المستقبلات الضوئية ، بين المجموعات التجريبية المختلفة.

أهمية التوجيه الصحيح لنبات الشبكية في صفيحة المزرعة للنتائج التجريبية
يتم تحقيق الاتجاه الصحيح لزرع الشبكية في صفيحة الثقافة عن طريق احتضان الشبكية العصبية التي تواجه أعلى. من ناحية أخرى ، قد ينتج فشل زرع الشبكية عن قلب أو طي أنسجة الشبكية ، مما يؤدي إلى مواجهة الشبكية العصبية لأسفل. أظهر تلطيخ التألق المناعي لنبات الشبكية المستنبتة بعد أسبوعين باستخدام علامات شبكية مختلفة كما أظهرت التجربة السابقة (NeuN و GFAP و isolectin-B4) أن فشل التوجيه الصحيح للزرع يؤدي إلى فشل التطور السليم للعنصر الوعائي العصبي (الشكل 3).

figure-results-1907
الشكل 1: خطوات تشريح مقلة العين لإنشاء زرع الشبكية . (أ) تغمر مقلة العين المنزوعة النواة في الوسط فور إزالتها من الحيوان. (ب) يتم إجراء شق محيطي على طول الحافة لفتح مقلة العين. (ج) تتم إزالة القرنية عن طريق التشريح على طول شق القزحية. (د) عن طريق إمساك العصب البصري بالملقط الناعم ، يتم تقشير الطبقة الخارجية للعين بلطف. ه: إزالة العدسة، والجسم الزجاجي، والجسم الهدبي. (و) لم يتبق سوى الشبكية العصبية. (ز) يتم إجراء أربعة شقوق شعاعية في شبكية العين لتسهيل قطعها في الخطوة التالية. (ح) يمكن تقطيع الشبكية إلى قطعتين أو أربع قطع ثم نقلها إلى صفيحة زراعة الخلايا التي تحتوي على الحشوة والوسائط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2978
الشكل 2: زراعة الشبكية الناجحة مع الحفاظ على بنية الشبكية. تلطيخ المناعي من explants الشبكية التي بقيت في الثقافة لمدة 2 أسابيع. تم إصلاح النباتات الخارجية وتلطيخها ب (أ) NeuN للخلايا العصبية الشبكية (الأخضر) و isolectin-B4 للأوعية الدموية (الأحمر) ، و (ب) GFAP للخلايا الدبقية (الأخضر) و isolectin-B4 للأوعية الدموية (الأحمر). أظهر التلوين خلايا شبكية متطورة وأوعية شبكية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3757
الشكل 3: زراعة الشبكية غير الناجحة مع خلايا شبكية معيبة ومتخلفة النمو. تلطيخ المناعي لنباتات الشبكية التي بقيت في الثقافة لمدة أسبوعين. تم تثبيت النباتات الخارجية وتلطيخها ب GFAP للخلايا الدبقية (الأخضر) والإيزولكتين-B4 للأوعية الدموية (الأحمر). تظهر الصور تلطيخا معيبا وخلايا شبكية وأوعية شبكية غير متطورة. تم طي نبات الشبكية ولم يتم توجيهه بشكل صحيح في لوحة الثقافة. يجب إيلاء اهتمام كبير لضمان التوجيه الصحيح للزرع مع توجيه شبكية العين لأعلى. سيؤدي الفشل في وضع زرع الشبكية في الاتجاه الصحيح إلى فشل التطور السليم للزرع. شريط المقياس = 100 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي تعزز ضعف الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين لسنوات31،32،33،34،35،36. تعد زراعة الشبكية إحدى التقنيات التي يمكن أن تكون ذات قيمة كبيرة لاستخدامها كنموذج لدراسة أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري أو أمراض الشبكية التنكسية. إن وجود مجموعة تحكم مشتقة من نفس شبكية العين أو الحيوان مثل المجموعة أو المجموعات المعالجة يمنح هذه التقنية ميزة كبيرة من حيث توفير مقارنات أكثر موثوقية للظروف التجريبية المختلفة.

أحد التحديات الرئيسية أثناء تحضير نبات الشبكية هو طي النبات أو الاتجاه الخاطئ في صفيحة المزرعة بحيث يكون سطح الشبكية متجها لأسفل. اقترح باحثون آخرون سحب شبكية العين لأعلى ولأسفل داخل الماصة المنقولة لجعلها في الاتجاه الصحيح في اللوحة37. ومع ذلك ، في بروتوكولهم ، استخدموا شبكية العين بأكملها لزرع واحد ، ولكن في هذا البروتوكول ، تم قطع شبكية واحدة إلى قطعتين إلى أربع قطع ، مما يعني أن القطع أصغر ومن الصعب القيام بهذه المناورة للتوجيه الصحيح. يسمح قطع شبكية واحدة إلى قطعتين إلى أربع قطع بالحصول على أربع إلى ثماني قطع شبكية من نفس الحيوان يمكن استخدامها في التجربة. هذا يسمح بالتجارب التي يتم فيها اشتقاق المجموعة الضابطة والمجموعات التجريبية من نفس الحيوان.

ومع ذلك ، فإن قطع شبكية العين إلى قطع صغيرة يجعل التعامل معها أكثر صعوبة. لذلك ، قمنا بتطوير تقنية للتعامل مع قطع الشبكية الصغيرة هذه لضمان التوجيه الصحيح لثقافة الشبكية. للقيام بذلك ، يتم وضع شفرة مقص التشريح المفتوحة أسفل قطعة الشبكية مباشرة ، مع توجيه سطح الشبكية لأعلى. إذا انقلبت قطعة الشبكية أو طويت ، يتم ضبطها برفق على الاتجاه الصحيح. ببطء ، يتم رفع قطعة الشبكية بطرف شفرة مقص مفتوحة ووضعها برفق في لوحة الثقافة. تضمن هذه التقنية البسيطة أن تكون كل قطعة شبكية في الاتجاه الصحيح بحيث تكون شبكية العين متجهة لأعلى وتعزز نتائج أفضل لدراسة الأوعية الشبكية والخلايا العصبية (الشكل 2). سيؤدي الفشل في وضع نبات الشبكية في الاتجاه الصحيح بحيث تكون الشبكية العصبية متجهة لأعلى إلى فشل النمو السليم لخلايا الشبكية في المزرعة ، كما هو موضح في الشكل 3. يوصى بشدة بالتدريب المناسب لتجنب هذا الخطأ الفني.

يصف هذا البروتوكول زرع شبكية عضوي لشبكية عين فأر بالغ. ومع ذلك ، فقد تم وصف هذه التقنية سابقا لكل من شبكية عين الفئران غير الناضجة37 وشبكية العين البشرية38. في دراسة سابقة ، تم وصف مزارع الشبكية الخارجية لدراسة تطور الأوعية الدموية ، حيث أصبح التلاعب بوظيفة البطانة ممكنا خارج الجسم الحي27. كمثال على التقييم المورفولوجي لزرع الشبكية ، تم ترك نبات الشبكية في الثقافة لمدة 2 أسابيع ، ثم تم إجراء التلوين المناعي باستخدام NeuN (علامة الخلايا العصبية) ، GFAP (علامة الخلايا الدبقية) ، و isolectin-B4 (علامة الأوعية الدموية). أظهر التلوين أن خلايا الشبكية والأوعية الدموية كانت متطورة ومحفوظة جيدا في النبات (الشكل 2). ومع ذلك ، يمكن الحصول على المزيد من بيانات تلطيخ الكيمياء المناعية للتحقق من صلاحية ووظائف خلايا الشبكية الأخرى في النبات أيضا.

يمكن أن تكون ثقافة النبات نفسها مرهقة لخلايا الشبكية. ومع ذلك ، يمكن تحضين الخلايا في ظل ظروف طبيعية نسبيا بحيث يمكن مقارنة التغيرات المورفولوجية التي تحدث في ظل ظروف تجريبية مختلفة ، مثل ارتفاع السكر في الدم أو نقص الأكسجة ، بحالة خط الأساس. وبالتالي ، فإن الزرع يمثل أداة جيدة لتقييم خلايا الشبكية المختلفة واختبار استجاباتها للعوامل الدوائية المختلفة أو الأهداف العلاجية في وقت واحد في مجموعة واسعة من أمراض الشبكية.

الأوعية الدموية في شبكية العين هي علامة أساسية على اعتلال الشبكية الإقفاري ، كما هو الحال في اعتلال الشبكية الخداجي واعتلال الشبكية السكري. نحن (الشكل 2) وآخرون27،39،40،41،42 يمكن أن نلاحظ الأوعية الدموية الشبكية سليمة في النباتات المستزرعة لمدة تصل إلى أسبوعين. وهكذا ، تم استخدام نبات الشبكية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لكل من الأوعية الدموية الجديدة الطبيعية والمرضية في الشبكية 41،42،43،44،45،46،47،48،49. ومن المثير للاهتمام ، أن مجموعة بحثية سجلت تنبت الأوعية الدموية الناجم عن VEGF في نباتات شبكية العين في الفئران أثناء التحقيق في العوامل الوعائية المرتفعة في اعتلال الشبكية السكري التكاثري43. علاوة على ذلك ، تم تضمين نباتات الشبكية في هلام ثلاثي الأبعاد ، مما يسمح بدراسة تنبت الخلايا البطانية الشبكية في اتجاه زماني مكاني أكثر تفصيلا45،46،47.

بالإضافة إلى الدراسات المورفولوجية ، تستخدم نباتات الشبكية أيضا إلى حد ما لتقييم وظائف الشبكية50،51،52،53. تم إجراء تصوير مخطط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي (ERG) على نباتات شبكية العين المعزولة للفأر ، مما يسمح بدراسة الوظائف المختلفة لمجموعة متنوعة من خلايا الشبكية ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية للقضيب والمخروط54،55،56،57. ومن المثير للاهتمام ، Calbiague et al. ذكرت أنه استجابة للعلاج العالي للجلوكوز ، أظهرت مزارع زراعة الشبكية المشتقة من الفئران أو الجرذان انخفاضا متزايدا في سمك طبقات الشبكية58. ومع ذلك ، فإن خلايا الشبكية ثنائية القطب ، والتي تعد من بين أقدم الخلايا الحساسة لحالات مرض السكري ، لم تحافظ فقط على مورفولوجيتها ولكن أيضا على خصائصها الفيزيولوجية الكهربية في الثقافة لمدة تصل إلى 2 أسابيع58. باختصار ، نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون قاعدة أو نقطة انطلاق لدراسات مستقبلية إضافية لتحسين فوائد استخدام النبات في أبحاث العين.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر منحة تمويل المعهد الوطني للصحة (NIH) للمعهد الوطني للعيون (R01 EY030054) للدكتور محمد الشبراوي. نود أن نشكر كاثي ولوسيفيتش لمساعدتنا في سرد الفيديو. نود أن نشكر الدكتور كين ميتون من مختبر أبحاث شبكية الأطفال التابع لمعهد أبحاث العيون ، جامعة أوكلاند ، على مساعدته أثناء استخدام المجهر الجراحي والتسجيل. تم تحرير هذا الفيديو وإخراجه من قبل الدكتور خالد المصري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult C57Bl/6J mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA664
All-in-One Fluorescence Microscope KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.BZ-X800
B27 supplementsThermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAGibco #17504-04
Blockade blocking solution Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAB10710
DMEM F12Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAGibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAF-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USAB-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAGibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated BladesWorld Precision Instruments,FL 34240, USA Straight (503365)
N2 supplementsThermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAGibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well PlatesThermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA140652
Paraformaldehyde 4% in PBSBBP, Ashland, MA, 01721 USAC25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USAP36962
Rabbit Anti-NeuN AntibodyAbcam.,Cambridge, UKab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) AntibodyDako,Carpinteria, CA 93013, USA.Z0334
Texas RedVector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USASA-5006-1
TritonXBioRad Hercules, CA,  94547,USA1610407

References

  1. Gauthier, C., Griffin, G. Using animals in research, testing and teaching. Revue Scientifique et Technique. 24 (2), 735-745 (2005).
  2. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  3. Bertschinger, D. R., et al. A review of in vivo animal studies in retinal prosthesis research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (11), 1505-1517 (2008).
  4. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  5. Sharma, K., Krohne, T. U., Busskamp, V. The rise of retinal organoids for vision research. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8484 (2020).
  6. Fradot, M., et al. Gene therapy in ophthalmology: Validation on cultured retinal cells and explants from postmortem human eyes. Human Gene Therapy. 22 (5), 587-593 (2011).
  7. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
  8. Nardone, R. M. Curbing rampant cross-contamination and misidentification of cell lines. Biotechniques. 45 (3), 221-227 (2008).
  9. Horbach, S., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
  10. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. International Journal of Cancer. 83 (4), 555-563 (1999).
  11. Tamiya, S., Liu, L., Kaplan, H. J. Epithelial-mesenchymal transition and proliferation of retinal pigment epithelial cells initiated upon loss of cell-cell contact. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2755-2763 (2010).
  12. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  13. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 638439 (2021).
  14. Zhang, X., Wang, W., Jin, Z. B. Retinal organoids as models for development and diseases. Cell Regeneration. 10 (1), 33 (2021).
  15. Bell, C. M., Zack, D. J., Berlinicke, C. A. Human organoids for the study of retinal development and disease. Annual Reviews of Vision Science. 6, 91-114 (2020).
  16. Mills, S. A., et al. Fractalkine-induced microglial vasoregulation occurs within the retina and is altered early in diabetic retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2112561118 (2021).
  17. Louie, H. H., et al. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 202, 108384 (2021).
  18. Wu, X., Yan, N., Zhang, M. Retinal degeneration: Molecular mechanisms and therapeutic strategies. Current Medicinal Chemistry. 29 (40), 6125-6140 (2021).
  19. Armento, A., et al. Complement factor H loss in RPE cells causes retinal degeneration in a human RPE-porcine retinal explant co-culture model. Biomolecules. 11 (11), 1621 (2021).
  20. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  21. Pattamatta, U., McPherson, Z., White, A. A mouse retinal explant model for use in studying neuroprotection in glaucoma. Experimental Eye Research. 151, 38-44 (2016).
  22. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  23. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  24. Smedowski, A., et al. FluoroGold-labeled organotypic retinal explant culture for neurotoxicity screening studies. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 2487473 (2018).
  25. Bull, N. D., et al. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  26. Beeson, C., et al. Small molecules that protect mitochondrial function from metabolic stress decelerate loss of photoreceptor cells in murine retinal degeneration models. Advances in Experimental Medicine and Biology. 854, 449-454 (2016).
  27. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nature Protocols. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  28. Muller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  29. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546 (2013).
  30. Garcia-Cabezas, M. A., John, Y. J., Barbas, H., Zikopoulos, B. Distinction of neurons, glia and endothelial cells in the cerebral cortex: An algorithm based on cytological features. Frontiers in Neuroanatomy. 10, 107 (2016).
  31. Elmasry, K., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in 12/15-lipoxygenase-induced retinal microvascular dysfunction in a mouse model of diabetic retinopathy. Diabetologia. 61 (5), 1220-1232 (2018).
  32. Elmasry, K., et al. Epigenetic modifications in hyperhomocysteinemia: Potential role in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. Oncotarget. 9 (16), 12562-12590 (2018).
  33. Al-Shabrawey, M., et al. Role of NADPH oxidase and Stat3 in statin-mediated protection against diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (7), 3231-3238 (2008).
  34. Al-Shabrawey, M., et al. Increased expression and activity of 12-lipoxygenase in oxygen-induced ischemic retinopathy and proliferative diabetic retinopathy: Implications in retinal neovascularization. Diabetes. 60 (2), 614-624 (2011).
  35. Hussein, K. A., et al. Bone morphogenetic protein 2: A potential new player in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. 125, 79-88 (2014).
  36. Ibrahim, A. S., et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (3), 290-298 (2015).
  37. Belhadj, S., et al. Long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (165), e61868 (2020).
  38. Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a novel human organotypic retinal culture technique. Journal of Visualized Experiments. (172), e62046 (2021).
  39. Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
  40. Curatola, A. M., Moscatelli, D., Norris, A., Hendricks-Munoz, K. Retinal blood vessels develop in response to local VEGF-A signals in the absence of blood flow. Experimental Eye Research. 81 (2), 147-158 (2005).
  41. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  42. DeNiro, M., Alsmadi, O., Al-Mohanna, F. Modulating the hypoxia-inducible factor signaling pathway as a therapeutic modality to regulate retinal angiogenesis. Experimental Eye Research. 89 (5), 700-717 (2009).
  43. Murakami, T., et al. Time-lapse imaging of vitreoretinal angiogenesis originating from both quiescent and mature vessels in a novel ex vivo system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5529-5536 (2006).
  44. Unoki, N., et al. SDF-1/CXCR4 contributes to the activation of tip cells and microglia in retinal angiogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (7), 3362-3371 (2010).
  45. Knott, R. M., et al. A model system for the study of human retinal angiogenesis: activation of monocytes and endothelial cells and the association with the expression of the monocarboxylate transporter type 1 (MCT-1). Diabetologia. 42 (7), 870-877 (1999).
  46. Im, E., Venkatakrishnan, A., Kazlauskas, A. Cathepsin B regulates the intrinsic angiogenic threshold of endothelial cells. Molecular Biology of the Cell. 16 (8), 3488-3500 (2005).
  47. Shafiee, A., et al. Inhibition of retinal angiogenesis by peptides derived from thrombospondin-1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (8), 2378-2388 (2000).
  48. Brown, K. C., et al. MG624, an α7-nAChR antagonist, inhibits angiogenesis via the Egr-1/FGF2 pathway. Angiogenesis. 15 (1), 99-114 (2012).
  49. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  50. Liu, D., et al. Overexpression of BMP4 protects retinal ganglion cells in a mouse model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 210, 108728 (2021).
  51. Januschowski, K., et al. Ex vivo biophysical characterization of a hydrogel-based artificial vitreous substitute. PLoS One. 14 (1), 0209217 (2019).
  52. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 91 (7), 825-837 (2013).
  53. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  54. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  55. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: Performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  56. Kaikkonen, O., Turunen, T. T., Meller, A., Ahlgren, J., Koskelainen, A. Retinal temperature determination based on photopic porcine electroretinogram. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (2), 991-1002 (2022).
  57. Gospe, S. M., et al. 3rd al. Photoreceptors in a mouse model of Leigh syndrome are capable of normal light-evoked signaling. Journal of Biological Chemistry. 294 (33), 12432-12443 (2019).
  58. Calbiague, V. M., Vielma, A. H., Cadiz, B., Paquet-Durand, F., Schmachtenberg, O. Physiological assessment of high glucose neurotoxicity in mouse and rat retinal explants. Journal of Comparative Neurology. 528 (6), 989-1002 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved