عزل الشريان الرئوي وخلايا العضلات الملساء للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية

يمكن استكشاف الاستجابات الوعائية للدورة الدموية الرئوية الشريانية باستخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs). تصف هذه الدراسة عزل IPA بالتفصيل والبروتوكولات المستخدمة للتحقيق في استرخاء الأوعية استجابة للمحفزات الفسيولوجية.

يمكن استخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) المعزولة من رئتي الفئران لدراسة الآليات الأساسية لتضيق الأوعية واسترخاء الأوعية. بعد عزل IPA و VSMCs ، يمكن تقييم خصائص الاستجابات الوعائية في الحالات الفسيولوجية والمرضية في غياب العوامل الخارجية مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات ، إلخ. وبالتالي ، فإن IPA و VSMCs بمثابة نماذج ممتازة لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية / الفيزيولوجيا المرضية ، إلى جانب العديد من التحقيقات التجريبية ، مثل التعديل بواسطة العوامل الدوائية ، والتحليل الكهروفسيولوجي المشبك الرقعة ، وتصوير الكالسيوم ، وما إلى ذلك. هنا ، استخدمنا تقنية لعزل IPA للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية في إعداد حمام الأعضاء. تم تركيب أجزاء IPA على غرفة حمام الأعضاء عبر أسلاك داخل اللمعان وتحفيزها بواسطة عوامل دوائية مختلفة. تم تسجيل التغيرات في نغمة الأوعية الدموية IPA (أي تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية) ، باستخدام محول طاقة متساوي القياس وبرنامج تحليل البيانات الفسيولوجية. قمنا بتنفيذ العديد من البروتوكولات التجريبية ، والتي يمكن تكييفها للتحقيق في آليات استرخاء الأوعية / تضيق الأوعية لدراسة الأنشطة الدوائية للعقاقير الكيميائية النباتية أو الاصطناعية. ويمكن أيضا استخدام البروتوكولات لتقييم أدوار الأدوية في تعديل الأمراض المختلفة، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. يسمح لنا نموذج IPA بالتحقيق في منحنى التركيز والاستجابة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تقييم المعلمات الدوائية الديناميكية للأدوية.

الأوعية الدموية الرئوية هي نظام وعائي منخفض الضغط تتمثل وظيفته الرئيسية في توصيل الدم غير المؤكسج إلى منطقة تبادل الغاز في الرئتين. يتم ترتيب الشرايين الرئوية في الرئتين في فروع موازية لشجرة الشعب الهوائية ، مما يشكل في النهاية شبكة واسعة من الشعيرات الدموية المستمرة على عدة حويصلات هوائية ، وأخيرا ، تجتمع معا في الأوردة والأوردة. يتم التحكم في نغمة الأوعية الدموية للشريان الرئوي من خلال عدة عوامل، بما في ذلك التفاعل بين البطانة وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs)¹.

في هذه الدراسة ، نركز على الاسترخاء الوعائي المعتمد على البطانة والمستقلة للشريان داخل الرئة (IPA). فيما يتعلق باسترخاء الأوعية المعتمد على البطانة، يمكن للآليات المختلفة التي تحدث على سطح الخلايا البطانية أن تزيد من تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا (على سبيل المثال، يرتبط الأسيتيل كولين [ACh] بمستقبلات المسكارينية [M3])، مما يؤدي إلى تكوين أكسيد النيتريك (NO) والبروستاسيكلين (PGl₂) وعامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة (EDHF) (الشكل 1) ). NO هو عامل الاسترخاء الرئيسي المشتق من البطانة والذي يتم تصنيعه من L-arginine بواسطة سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS)² ، والذي ينفصل بعد ذلك عن الخلايا البطانية إلى VSMCs (الشكل 1) ويحفز إنزيم guanylyl cyclase (sGC) القابل للذوبان ؛ يغير هذا الإنزيم الجوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) إلى أحادي فوسفات غوانوزين دوري (cGMP) ، مما ينشط بروتين كيناز G (PKG) ويقلل من مستويات Ca²⁺ الخلوية ، مما يسبب استرخاء الأوعية (الشكل 1). يتم تصنيع PGl₂ بواسطة الخلايا البطانية عبر مسار سيكلو-أوكسيجيناز (COX) ^3,4. يرتبط بمستقبلات البروستاسيكلين (IP) على VSMCs ويحفز إنزيم أدينيل سيكلاز (AC) ، الذي يحول بعد ذلك الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري (cAMP) (الشكل 1) ^3,4. ينشط cAMP بروتين كيناز A (PKA) ، مما يقلل من مستويات Ca²⁺ الخلوية ويسبب استرخاء الأوعية⁵ (الشكل 1). يشارك مسار EDHF أيضا في استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة من خلال العديد من الوسطاء البطانيين والأحداث الكهربائية. يؤدي تنشيط مسار EDHF إلى فرط استقطاب VSMCs ، وبالتالي إغلاق قنوات Ca 2 + التي تعمل بالجهد (VOCCs) ، وتقليل مستويات Ca^{2 +} داخل الخلايا ، وتحفيز استرخاء الأوعية⁶. يحدث استرخاء الأوعية المستقل عن البطانة مباشرة على VSMCs عبر عدة آليات ، مثل تقليل مستوى Ca 2 + داخل الخلايا ، وتثبيط كيناز سلسلة ضوء الميوسين (MLCK) ، وتنشيط فوسفاتيز سلسلة ضوء الميوسين (MLCP) ، والحد من حساسية Ca^{2 +} للآلات الانقباضية ل VSMCs. في هذه الدراسة ، نركز على استرخاء الأوعية الناجم عن فتح قنوات K + المختلفة ، وحصار المركبات العضوية المتطايرة ، وتثبيط إطلاق Ca 2 + من الشبكة الساركوبلازمية⁷ ، مما يؤدي إلى تقليل مستويات Ca ^{2 +} داخل الخلايا ، وبالتالي تقليل فسفرة سلسلة ضوء VSMC myosin وربط الميوسين أكتين أو تكوين عبر الجسور ، على التوالي ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استرخاء الأوعية.

إن تقنية تقييم قياسات تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية في IPA المعزولة راسخة جيدا للقوارض ، لكن البيانات تختلف اعتمادا على البروتوكولات التجريبية. تصف هذه الدراسة الطريقة المستخدمة لتقييم التفاعلات الوعائية لمستحضرات IPA للفئران في المختبر ، والتي تم إجراؤها في غياب عوامل خارجية تعدل استجابة الأوعية الدموية في الجسم الحي ، مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات وضغط الدم ، إلخ.

استخدمنا العديد من البروتوكولات التجريبية باستخدام المستخلص النباتي كمثال لدراسة التفاعلات الوعائية ل IPA. تم استخدام حاصرات مختلفة (الشكل 1) لتحديد آليات استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة والمستقلة التي يسببها المستخلص النباتي. ومع ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكولات لتقييم استجابات الأوعية الدموية ل IPA لأي أدوية أو مستخلصات أو مواد كيميائية نباتية تستخدم لعلاج الأمراض الرئوية المختلفة.

تمت الموافقة على التجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة ناريسوان (NUACUC) ، رقم البروتوكول NU-AE620921 ، لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية.

1. تكوين الحلول الفسيولوجية

1. قم بصياغة محلول كريبس عن طريق إذابة المواد الكيميائية في الماء المقطر لتحقيق التركيزات النهائية على النحو التالي: 122 mM NaCl ، 10 mM HEPES ، 5 mM KCl ، 0.5 mM KH 2 PO 4 ، 0.5 mM NaHPO₄ ، 1 mM MgCl 2 ، 1.8 mM CaCl ₂، و 11 mM glucose⁸. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.3 مع 1 M NaOH وسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد محلول كريبس البارد بالمثل كما هو مذكور في الخطوة 1.1. لاستخدامها كوسيلة عزل ل IPA ، كما هو موضح في الخطوة 2.

2. عزل الشريان الرئوي (IPA)

1. تخدير ذكور فئران Wistar البالغة من العمر 8 أسابيع عن طريق حقن ثيوبنتال الصوديوم داخل الصفاق (100 مجم / كجم)⁹. تحقق من الفئران بحثا عن رد فعلها على المحفزات المؤلمة في النوم العميق باستخدام ملقط مثبت على أقدامها ، ثم تأكد من أن الفئران ليس لديها رد فعل سحب القدم قبل القتل الرحيم لها في الخطوة 2.2.
2. قطع فتح الصدر الأوسط من الفئران وطرف القلب مع مقص (حجم 14 سم). ثم ، حدد موقع جذر الرئة بمقص (حجم 14 سم). حصاد الرئة بأكملها عن طريق القطع بالمقص وغمرها في محلول كريبس البارد^10,11.
3. يقطع فص واحد من الرئة بمقص (مقاس 11 سم) ويوضع على طبق بتري (مقاس 9 سم) مع توجيه الجانب الإنسي / الجذر للرئة لأعلى (الشكل 2A ، B). مراقبة وتحديد محاذاة الوريد والشعب الهوائية والشريان من أعلى إلى أسفل (الشكل 2B).
4. قطع فتح الشعب الهوائية طوليا مع مقص (حجم 11 سم). ثم ، استخدم الملقط (حجم 11 سم) للاستيلاء على طرف الشعب الهوائية. تشريح بلطف وإزالة الشعب الهوائية والأوردة من الرئة. لاحظ أن IPA محاذاة دائما تشريحيا تحت الشعب الهوائية.
5. بعد ذلك ، يمكن تصور IPA الرئيسي (الشكل 2C). استخدم الملقط (مقاس 11 سم) للاستيلاء على طرف IPA وتشريحه بعناية من أنسجة الرئة باستخدام مقص (حجم 11 سم).
6. احتفظ ب IPA المعزول في محلول كريبس البارد حتى يتم إعداد مجموعة حمام الجهاز (درجة الحموضة 7.3 ودرجة الحرارة 4 درجة مئوية)1 ¹.

3. عزل خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs)

1. عزل IPA كما هو موضح سابقا في الخطوة 2. قطع الفرع الرئيسي من IPA طوليا مع مقص (حجم 11 سم) وقطع إلى شرائح صغيرة (2 ملم) (الشكل 3A).
2. اغمر شرائط IPA في وسط تفكك (DM) ^10,12 يحتوي على 110 mM NaCl و 5 mM KCl و 0.5 mM KH 2 PO 4 و 0.5 mM NaH 2 PO₄ و 10 mM NaHCO₃ و 10 mM HEPES و 0.03 mM phenol red و 10 mM taurine و 0.5 mM EDTA و 2 mM MgCl 2 و 11 mM glucose و ^0.16 mM CaCl ₂، واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع 1 M NaOH. احتضن الشرائط لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في DM تحتوي على غراء 1 ملغم / مل ، و 0.04٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 0.4 mM 1,4- dithiothreitol (DTT) ، واحتضنها مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف 1 ملغم / مل كولاجيناز من النوع 1A في DM واحتضان المزيد عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: DM هو حل يستخدم للحفاظ على صلاحية الخلية. الغراء والكولاجيناز من النوع 1A هي إنزيمات تكسر بروتينات المصفوفة خارج الخلية لعزل الخلايا المفردة. BSA هو بروتين ألبومين في المصل يستخدم لتحقيق الاستقرار في الإنزيمات أثناء التخزين والتفاعلات الأنزيمية. DTT هو عامل اختزال يستخدم لتحقيق الاستقرار وتعزيز نشاط الإنزيمات أثناء عملية عزل الخلايا. التورين هو حمض الكبريتيك الأميني المستخدم لتحقيق الاستقرار في غشاء الخلية وسلامة الخلية.
3. انقل الأنسجة إلى DM طازجة وتشتت عن طريق التتبع اللطيف باستخدام ماصة باستور الزجاجية (الشكل 3B). استمر في التتبع حتى تصبح VSMCs المعزولة مرئية في محلول الاستحمام تحت المجهر (الشكل 3C).
   ملاحظة: يمكن استخدام VSMCs المعزولة حديثا لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية / الفيزيولوجيا المرضية ، إلى جانب العديد من التحقيقات التجريبية ، مثل التعديل بواسطة العوامل الدوائية ، والتحليل الكهروفسيولوجي المشبك بالتصحيح ، وتصوير الكالسيوم ، وما إلى ذلك. ومع ذلك ، تركز هذه الدراسة فقط على استرخاء الأوعية الدموية ل IPA المعزولة باستخدام تقنية حمام الأعضاء.

4. تقنية حمام الجهاز

1. عزل IPA كما هو موضح سابقا في الخطوة 2. قطع الفرع الرئيسي من IPA إلى حلقات طولها ~ 2 مم (الشكل 2D)¹³.
2. قم بتثبيت حلقات IPA في غرف حمام الأعضاء (الشكل 4) عن طريق ربطها بسلكين من الفولاذ المقاوم للصدأ قطرهما 40 ميكرومتر (الشكل 2E)^11،13،14.
3. قم بتوصيل أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ المثبتة بحلقات IPA بمحولات القوة متساوي القياس المتصلة بجهاز الحصول على البيانات ونظام الكمبيوتر المثبت بالبرنامج الفسيولوجي المناسب لتسجيل البيانات وتحليلها ، ثم ارفع توتر حلقة IPA برفق إلى 1 جم¹¹.
4. اسمح لأجزاء السفينة بالتوازن لمدة 45 دقيقة تقريبا عند توتر الراحة البالغ 1 جم. خلال فترة التوازن ، تأكد من تغيير محلول Krebs بانتظام كل 15 دقيقة. بعد هذه الفترة من التوازن ، اختبر جدوى الأوعية عن طريق قياس تضيق الأوعية إلى محلول K ⁺ (80 mM) عالي خارج الخلية يحتوي على 47.4 mM NaCl و 80 mM KCl و 10 mM HEPES و 0.5 mM KH 2 PO 4 و 0.5 mM NaHPO₄ و 1.8 mM CaCl 2 و 1 mM MgCl₂ و 11 mM glucose^10,11.
5. قم بتقييم وجود أو عدم وجود البطانة عن طريق حساب استجابة الاسترخاء للأسيتيل كولين (1 × 10⁻⁵ م) في الحلقات المتعاقد عليها مسبقا مع فينيليفرين (PE ، 1 × ^10-5 م) (لاحظ أن تقلصات الأوعية الدموية تظل مستقرة لمدة ساعة واحدة بعد إضافة PE). ضع في اعتبارك الحلقات على أنها بطانة سليمة إذا كانت تحدد كميا للاسترخاء بنسبة تزيد عن 70٪ (الشكل 5A). إذا كان لديهم أقل من 10٪ من الاسترخاء ، ففكر في الحلقات على أنها¹³ بطانة عارية (الشكل 5B). قم بإزالة البطانة ميكانيكيا عن طريق فرك الوعاء بلطف بسلك صغير للحث على التعري.
6. مرة أخرى قم بموازنة الحلقات الشريانية لمدة 30 دقيقة قبل بدء تجارب الاختبار.

5. استجابة مرخية للأوعية الدموية للمستخلصات النباتية

1. تحقق من التأثير المرخي للمستخلص النباتي عن طريق التعاقد المسبق على حلقات IPA مع PE (1 × ^10-5 م).
2. ثم ، أضف بعناية المستخلص النباتي (1-1000 ميكروغرام / مل) بشكل تراكمي إلى حلقات البطانة السليمة والحلقات العارية للبطانة للحث على استرخاء الأوعية (الشكل 6A ، B) والحصول على منحنى استجابة يعتمد على التركيز (الشكل 6C).
3. تأكد من أن تأثير ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المستخدم كمذيب يتم تقييمه أيضا بالمثل ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي (الشكل 6C).

6. آلية استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلصات النباتية عن طريق البطانة

1. تقييم آلية عمل المستخلص النباتي عن طريق سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) ، و cyclo-oxygenase (COX)13 ، ومسارات عامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة (EDHF) عن طريق احتضان حلقات IPA السليمة للبطانة لمدة 30 دقيقة مع المثبطات التالية (الشكل 7A): 1 × 10−⁴ M NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME ، مثبط eNOS) 9 ، 1 × ¹⁰⁻⁵ M indomethacin (مثبط COX)⁹ ، أو مزيج من 1 × 10−7 M apamin (مانع قناة بوتاسيوم صغير منشط بالكالسيوم) و 1 × 10−⁷ M charybdotoxin (مانع قناة البوتاسيوم المنشط بالكالسيوم وسيط وكبير التوصيل) ، قبل إحداث تقلصات IPA مع 1 × 10⁻⁵ M PE.
2. ثم ، بعد الانقباضات إلى PE ، أضف تركيزات تراكمية (0.1-1000 ميكروغرام / مل) من المستخلص النباتي.
3. عرض آثار المستخلصات النباتية كنسبة مئوية من الاسترخاء لحلقات IPA في وجود مثبطات مقارنة باستجابة حلقات IPA بدون مثبطات (الشكل 7B-D) وبناء منحنى التركيز والاستجابة.

7. آلية استرخاء الأوعية الدموية الناجمة عن المستخلصات النباتية عبر قنوات العضلات الملساء الوعائية K ⁺

1. حلقات IPA العارية قبل احتضان البطانة لمدة 30 دقيقة مع 1 × 10−³ M 4-aminopyridine (4-AP) ، مانع لقناة البوتاسيوم ذات بوابات الجهد (K_V) (الشكل 8A) ، 1 × 10−5 M glibenclamide ، مانع لقناة البوتاسيوم الحساسة ل ATP (K_ATP) ، أو 1 × 10⁻⁷ M iberiotoxin ، مانع للتوصيل الكبير Ca 2 + قنوات K ⁺ المنشطة (K_Ca) ، قبل إحداث تقلصات IPA مع 1 × ^10-5 M PE.
2. ثم ، أضف تركيزات تراكمية من المستخلص النباتي.
3. عرض آثار المستخلصات النباتية كنسبة مئوية من الاسترخاء لحلقات IPA مع مثبط مقارنة بحلقات IPA بدون مثبط (الشكل 8B-D) وبناء منحنى التركيز والاستجابة.

8. آلية استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلصات النباتية عن طريق تثبيط تدفق الكالسيوم خارج الخلية (Ca^{2 +}) في VSMCs

1. حلقات IPA العارية بالبطانة قبل احتضانها لمدة 30 دقيقة في محلول كريبس الخالي من Ca 2⁺ الذي يحتوي على 1 mM من الإيثيلين جلايكول-مكرر (2-aminoethylether)-N,N,N',N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) (الشكل 9A).
2. بعد ذلك ، استبدل محلول الاستحمام بمحلول Ca²⁺ free-80 mM K ⁺ لمدة 10 دقائق لإزالة الاستقطاب عن VSMCs ، والتي تفتح بعد ذلك المركبات العضوية المتطايرة (الشكل 9A).
3. أضف بشكل تراكمي CaCl₂ (0.01-10 mM) للحث على تضيق الأوعية في IPA وبناء منحنى التركيز والاستجابة (الشكل 9A).
4. كرر هذا البروتوكول في نفس حلقات IPA ولكن احتضنها مسبقا بمستخلص نباتي أو 1 ميكرومتر نيكارديبين (مانع قناة Ca 2+ من النوع L) في Ca²⁺ يحتوي على محلول 80 mM K ⁺ لمدة 10 دقائق متبوعا بإضافة تراكمية ل CaCl₂⁸.
5. وأخيرا، قارن الاستجابة الانقباضية بالحد الأقصى للانكماش الذي أثارته سابقا تحديات التحكم في CaCl₂ (الشكل 9B).

9. آلية استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلصات النباتية عن طريق تثبيط الكالسيوم داخل الخلايا (Ca^{2 +}) من الشبكة الساركوبلازمية (SR)

1. تعريض حلقات IPA العارية بالبطانة إلى حل 80 mM K + لمدة 5 دقائق تقريبا ، وإزالة الاستقطاب من VSMCs ، وفتح المركبات العضوية المتطايرة ، وفي النهاية توليد تحميل Ca^{2 +} في SR (الشكل 10A).
2. استبدل محلول الاستحمام لمدة 10 دقائق بمحلول كريبس الخالي من Ca^{2 +} الذي يحتوي على 1 mM EGTA (الشكل 10A).
3. ثم ، تحدى حلقات IPA باستخدام 1 × 10⁻⁵ M PE ، مما ينشط مسار phospholipase C / IP₃ ، مما يؤدي في النهاية إلى إطلاق Ca²⁺ من SR واستحضار انكماش عابر ل IPA (الشكل 10A).
4. كرر نفس البروتوكول للتأكد من الانقباضات العابرة بالمثل إلى PE.
5. تحدى حلقات IPA مرة أخرى بمحلول 80 mM K + لمدة 5 دقائق تقريبا ، ثم استبدل محلول الاستحمام بمحلول Krebs الخالي من Ca^{2 +} الذي يحتوي على 1 mM EGTA مع أو بدون المستخلص النباتي لمدة 10 دقائق.
6. مرة أخرى ، تحدى حلقات IPA باستخدام 1 × ^10-5 M PE.
7. قارن تقلصات IPA الناجمة عن PE بين الحالة مع وبدون المستخلص النباتي (الشكل 10B).

10. التحليل الإحصائي

1. عبر عن النتائج كمتوسط ± SEM. قارن هذه القيم باستخدام اختبار t الخاص بالطالب أو قم بتحليلها عن طريق تحليل التباين (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey-Kramer اللاحق باستخدام برنامج إحصائي مناسب. ضع في اعتبارك الفروق عند p < 0.05 لتكون ذات دلالة إحصائية. هنا ، كان هناك n = 6 فئران / بروتوكول تجريبي.
   ملاحظة: يمكن تقييم تسجيل تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية باستخدام برنامج مناسب مثبت على الكمبيوتر. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 5A أنه عندما يتم تحفيز الأوعية الدموية بواسطة PE مما يسبب الانكماش ، يمكن ملاحظة ذلك من زيادة التوتر في التتبع الأصلي. سوف يستقر التتبع في 20-30 دقيقة ، والذي يعتبر انكماشا بنسبة 100٪. بعد ذلك ، يحفز ACh الأوعية الدموية ، مما يسبب الاسترخاء ، والذي يمكن ملاحظته من انخفاض التوتر في التتبع الأصلي. وبالتالي ، يتم حساب انخفاض التوتر كنسبة مئوية مقارنة بانكماش 100٪.

تم تطوير البروتوكول في هذه الدراسة لتحديد الظروف التجريبية المثلى لقياس الظواهر الفسيولوجية التي لوحظت في الاستجابات الوعائية لمستحضرات IPA المعزولة. تم إجراء التجارب التجريبية لوصف النتائج المحتملة التي تساعد على فهم التأثيرات الوعائية والأساس الميكانيكي للعمل المرخي للأوعية الدموية للمستخلص النباتي ، على النحو التالي.

تأثير Vasorelaxant من المستخلص النباتي
وكما هو مبين في الشكل 6A,B، في IPA السليم البطانة (E+)، أثار المستخلص النباتي استجابة تعتمد على التركيز من استرخاء الأوعية (EC₅₀ = 66.88 ميكروغرام/مل، الشكل 6C). أدى القضاء على البطانة (E-) إلى انخفاض عميق في استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلص النباتي (p < 0.01) ، كما يتضح من الزيادة في EC 50 بمقدار 2.2 ضعف (E-، EC₅₀ = 150.60 ميكروغرام / مل ، الشكل 6C). لم يكن للمركبة ، DMSO ، أي تأثير. وبالتالي ، أنتج المستخلص النباتي استرخاء الأوعية بشكل رئيسي عبر مسار يعتمد على البطانة وجزئيا عبر مسار مستقل عن البطانة.

آلية عمل مرخيات الأوعية للمستخلص النباتي عبر مسارات تعتمد على البطانة
كما هو موضح في الشكل 7 ، من الواضح أن استخدام L-NAME لتثبيط eNOS (الشكل 7B) والجمع بين الأبامين بالإضافة إلى charybdotoxin لمنع EDHF (الشكل 7D) قلل من استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي. أدى ذلك إلى تحويل منحنى التركيز والاستجابة إلى اليمين وزيادة EC₅₀ دون تغيير قيم E_max. على العكس من ذلك ، لم يظهر الإندوميتاسين (مثبط COX) (الشكل 7C) أي تأثير على استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي.

توصيف دور قنوات K ⁺ في عمل مرخي للأوعية من المستخلص النباتي
في حلقات IPA العارية البطانية ، قلل مانع قناة K_Ca (iberiotoxin) من استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي (الشكل 8C) ، في حين أن حاصرات قنوات K_v (4-AP) أو K_ATP (glibenclamide) لم تعدل استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلص النباتي (الشكل 8B ، D).

آلية عمل مرخيات الأوعية للمستخلص النباتي عن طريق تثبيط تدفق Ca ²⁺ خارج الخلية
للتحقق مما إذا كانت آلية عمل مرخيات الأوعية للمستخلص النباتي تنطوي على تثبيط تدفق Ca²⁺ خارج الخلية ، تم استثارة تضيق الأوعية لحلقات IPA العارية بالبطانة بواسطة 1 × 10^{−5-1 ×} 10⁻² M CaCl 2 في محلول Krebs الخالي من Ca₂ + المدمج مع 80 mM K ⁺ لتنشيط المركبات العضوية المتطايرة (الشكل 9A ، B). قبل الحضانة مع المستخلص النباتي (68 ميكروغرام / مل ، قيمة EC₅₀) منع الانكماش الناجم عن CaCl₂ (p < 0.001 مقابل السيارة).

آلية عمل مرخيات الأوعية من المستخلص النباتي عن طريق تثبيط إطلاق Ca^{2 +} داخل الخلايا من SR
لدراسة ما إذا كان إطلاق Ca²⁺ داخل الخلايا من SR قد لعب أي دور في تأثير مرخيات الأوعية ، تم احتضان حلقات IPA العارية بالبطانة مسبقا بمحلول Krebs الخالي من Ca^{2 +} ، متبوعا بإضافة PE (1 × 10⁻⁵ M) ، مما أدى إلى انكماش عابر (الشكل 10A). ثم ، في نفس حلقة IPA ، تم تكرار هذه التجربة في وجود إما مركبة أو مستخلص نباتي. بالمقارنة مع السيارة ، انخفض المستخلص النباتي بشكل كبير (p < 0.001) الانكماش الناجم عن PE (الشكل 10B).

الشكل 1: تنظيم نغمة الأوعية الدموية عبر مسارات تعتمد على البطانة ومستقلة. AA = حمض الأراكيدونيك ، ACh = أسيتيل كولين ، AC = أدينيل سيكلاز ، ATP = أدينوسين 5'-ثلاثي الفوسفات ، cAMP = أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري ، cGMP = أحادي فوسفات الغوانوسين الدوري ، كوكس = سيكلوأكسجيناز ، DAG = دياسيلجليسيرول ، EDHF = عامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة ، eNOS = سينثاز أكسيد النيتريك البطاني ، G q = G-protein type_q ، G s = G-protein type_s ، GTP = Guanosine triphosphate ، IP = مستقبلات البروستاسيكلين ، IP 3 = Inositol 1 ، 4 ، 5 trisphosphate ، IP₃ R = مستقبلات IP₃ ، IK Ca = الموصلية الوسيطة Ca 2 + قناة K + المنشطة ، K_V = قنوات البوتاسيوم ذات بوابات الجهد ، K ATP = قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP ، K Ca = قنوات التوصيل الكبيرة_Ca 2 + المنشطة K ⁺ ، M3 = مستقبلات Muscarinic ، MEGJ = تقاطع Gab البطاني العضلي ، NO = أكسيد النيتريك ، PE = Phenylephrine ، PGI 2 = Prostacyclin ، PG_s = Prostaglandins ،_PIP ² = فوسفاتيديلينوسيتول 4,5 ثنائي الفوسفات، PKA = بروتين كيناز A، PKG = بروتين كيناز G، PLA 2 = فوسفوليباز A 2، PLC = فوسفوليباز C، ROCCs = مستقبلات Ca 2+ تعمل، RYR = مستقبلات ريانودين، sGC = قابل للذوبان غوانيليل سيكلاز، SK Ca = توصيل صغير Ca₂ + قناة K ⁺ المنشطة، SR = شبكة ساركوبلازميك، المركبات العضوية المتطايرة = قنوات_Ca ²⁺ التي تعمل بالجهد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الخطوات الرئيسية لعزل الشريان الرئوي للفئران (IPA). (أ) تصور الصورة رئة الفئران مع IPA. (ب) تشريح الجانب الإنسي / الجذر للرئة المتجهة لأعلى. (ج) IPA الرئيسية المرئية بعد إزالة الأوردة والشعب الهوائية. (د) وكالة تشجيع الاستثمار المعزولة. (هاء) تم تركيب حلقات IPA على زوج من الأسلاك المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ لإجراء دراسة استجابة الأوعية الدموية باستخدام تقنية حمام الأعضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الخطوات الرئيسية لعزل خلايا العضلات الملساء الوعائية IPA (VSMCs). (أ) تم قطع IPA المعزول إلى شرائح صغيرة وغمره في وسط التفكك (DM). (ب) تتبع شرائط الأوعية الدموية لعزل VSMCs. (C) VSMCs المعزولة بعد التتبع اللطيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: رسم تخطيطي للمعدات المستخدمة لاختبار تفاعل الأوعية الدموية.

الشكل 5: سجل تمثيلي يبين استرخاء الأوعية الدموية لحلقات IPA المتعاقد عليها مسبقا مع 10 ميكرومتر PE × 10 ميكرومتر أستيل كولين (ACh ). (A) حلقة سليمة البطانة (E+) و (B) حلقة عارية البطانة (E-). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: الاسترخاء الوعائي ل IPA بواسطة المستخلص النباتي. (أ) سجل تمثيلي يوضح الاسترخاء الوعائي لحلقات IPA بواسطة المستخلص النباتي (1-1000 ميكروغرام / مل) المتعاقد عليه مسبقا مع 10 ميكرومتر PE في حلقات سليمة البطانة (E+) و (B) حلقات البطانة العارية (E-). (ج) منحنيات التركيز والاستجابة للاسترخاء الوعائي الناجم عن المستخلص النباتي في حلقات IPA (E+، n = 6 وE-، n = 6). يتم التعبير عن استرخاء الأوعية كنسبة مئوية من الانكماش الناجم عن PE. يتم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± SEM. **p < 0.01 ، ***p < 0.001 مقارنة بالمركبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7. آليات استرخاء الأوعية الدموية IPA الناجم عن المستخلص النباتي عبر المسار المعتمد على البطانة. (أ) سجل تمثيلي يوضح استرخاء الأوعية بواسطة المستخلص النباتي (1-1000 ميكروغرام/مل) لحلقات IPA السليمة بالبطانة (E+) المحتضنة مسبقا مع L-NAME (مثبط eNOS) والمتعاقد عليها مسبقا مع 10 ميكرومتر PE. (ب-د) منحنيات التركيز والاستجابة للاسترخاء الوعائي الناجم عن المستخلص النباتي لحلقات IPA السليمة (E+) المتعاقد عليها مسبقا مع PE والمحتضنة مسبقا مع مثبطات مسارات الإشارات البطانية المختلفة ، بما في ذلك (B) 100 μM L-NAME ، (C) 10 μM indomethacin ، أو (D) 0.1 μM apamin بالإضافة إلى 0.1 μM charybdotoxin. القيم هي وسائل ± SEM. (n = 6). **p < 0.01, ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8. تأثير حاصرات قنوات K⁺ على استرخاء الأوعية الدموية IPA الناجم عن المستخلصات النباتية. (أ) سجل تمثيلي يوضح استرخاء الأوعية بواسطة المستخلص النباتي (1-1000 ميكروغرام/مل) من حلقات IPA العارية بالبطانة (E-) المحتضنة ب 4-AP (مانع قناة K_V) والمتعاقد عليها مسبقا مع 10 ميكرومتر PE. (ب-د) منحنيات التركيز والاستجابة للاسترخاء الوعائي الناجم عن المستخلص النباتي لحلقات IPA العارية بالبطانة (E-) المتعاقد عليها مسبقا مع PE والمحتضنة مسبقا مع العديد من حاصرات قنوات K ⁺ ، بما في ذلك (B) 1 mM 4-AP ، (C) 10 μM glibenclamide ، أو (D) 30 nM iberiotoxin. القيم هي وسائل ± SEM. (n = 6). ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9. تأثير المستخلص النباتي على تدفق Ca²⁺ خارج الخلية. (أ) السجلات التمثيلية التي تبين انكماش حلقات IPA الناجم عن CaCl₂ في غياب (مراقبة) أو وجود المستخلص النباتي. تم غمر حلقات IPA في محلول Ca 2⁺ Free High K ⁺ - (80 mM) الذي يحتوي على 10 mM EGTA وتم قياس الانكماش الناجم عن التركيز التراكمي ل CaCl₂. ثم تم تكرار هذا البروتوكول بمفرده (التحكم ، n = 6) أو في وجود المستخلص النباتي (n = 6). (ب) منحنيات التركيز والاستجابة للانكماش الناجم عن CaCl₂ لحلقات IPA في غياب (تحكم) أو وجود المستخلص النباتي أو 1 ميكرومتر نيكارديبين (مانع قناة Ca²⁺ من النوع L). تم حساب الانكماش الناجم عن CaCl 2 كنسبة مئوية من الحد الأقصى للانكماش المسجل من تطبيق CaCl₂ الأول وتم التعبير عنه كمتوسط ± SEM. * p < 0.05 ، ***p < 0.001 مقارنة بالنيكارديبين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10. تأثير المستخلص النباتي على إطلاق Ca²⁺ من الشبكة الساركوبلازمية (SR). (ألف) سجل تمثيلي يبين انكماش حلقات IPA الناجم عن الفينيل فلين (PE) بواسطة Ca²⁺ من SR لحلقات IPA العارية بالبطانة في وجود DMSO (السيطرة) و 10 ميكرومتر من المستخلصات النباتية. البيانات هي نسبة الانكماش إلى 10 ميكرومتر من الانقباضات الناجمة عن PE مقارنة بالانقباضات الناتجة عن البروتوكول الأولي بدون المستخلص النباتي. القيم هي وسائل ± SEM. **p < 0.01 مقارنة بالمركبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 11: الآلية المقترحة لعمل موسع الأوعية للمستخلص النباتي على الشريان الرئوي للفئران عبر مسارات تعتمد على البطانة ومستقلة AA = حمض الأراكيدونيك ، ACh = الأسيتيل كولين ، AC = أدينيليل سيكلاز ، ATP = أدينوسين 5'-ثلاثي الفوسفات ، cAMP = أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري ، cGMP = أحادي فوسفات الغوانوسين الدوري ، COX = Cyclooxygenase ، DAG = Diacylglycerol ، EDHF = عامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة ، eNOS = سينثاز أكسيد النيتريك البطاني ، G_q = G-protein type q, G s = G-protein types_s, GTP = Guanosine triphosphate, IP = مستقبلات البروستاسيكلين, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisphosphate, IP 3 R = IP ₃ receptor, IK Ca = الموصل الوسيط Ca 2+-activated K+ channel, K_V = قنوات البوتاسيوم ذات بوابات الجهد, K ATP = قنوات البوتاسيوم الحساسة ل_ATP, K Ca = الموصل الكبير_Ca 2+-activated K⁺ القنوات, M3 = مستقبلات المسكارينية, MEGJ = تقاطع الغاب البطاني العضلي, NO = أكسيد النيتريك, PE = فينيليفرين, PGI 2 = البروستاسيكلين, PG_s = البروستاجلاندين, PIP 2 = فوسفاتيديلينوسيتول 4,5 ثنائي الفوسفات, PKA = بروتين كيناز A, PKG = بروتين كيناز G, PLA 2 = فوسفوليباز A ₂, PLC = فوسفوليباز C, ROCCs = مستقبلات Ca²⁺ تعمل, RYR = مستقبلات ريانودين, sGC = سيكلاز غوانيليل قابل للذوبان, SK Ca = التوصيل الصغير_Ca ²+ قناة K ⁺ المنشطة ، SR = شبكة Sarcoplasmic _، VOCCs = قنوات Ca²⁺ التي تعمل بالجهد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه المخطوطة ، نصف تقنية عزل IPA و VSMCs الفئران. تم استخدام العديد من البروتوكولات التجريبية للتحقيق في الاستجابة الوعائية ل IPA في المختبر ، والتي يمكن استخدامها لتوصيف التأثير الدوائي والأساس الميكانيكي ل IPA للأوعية الدموية الناجم عن المستخلصات النباتية.

فيما يتعلق بعمل موسع الأوعية المعتمد على البطانة للمستخلص النباتي ، تم استخدام حاصرات مختلفة مثل L-NAME (eNOS) ، والإندوميتاسين (COX) ، والأبامين + charybdotoxin (EDHF). أظهرت البيانات التمثيلية كلا من النتائج الإيجابية (أي الانخفاض الكبير في استجابة موسع الأوعية في وجود مثبطات eNOS أو EDHF) والنتائج السلبية (أي عدم حدوث تغيير في استجابة موسع الأوعية في وجود مثبط COX) ، مما يشير إلى أن المستخلص النباتي يعمل عبر المسارات البطانية eNOS و EDHF. تم تقييم تأثير مرخيات الأوعية المستقلة عن البطانة التي يسببها المستخلص النباتي من خلال مشاركة قنوات K + ، وتدفق Ca 2 + خارج الخلية ، وإطلاق Ca ^{2 +} من SR. أظهرت النتائج أن استرخاء الأوعية استجابة للمستخلص النباتي تم تقليله بواسطة مانع قنوات K Ca (iberiotoxin) ولكن ليس بواسطة مانع قنوات K_V (4-AP) أو مانع قنوات K_ATP (glibenclamide) ، مما يشير إلى أن المستخلص يعمل عن طريق فتح قنوات K_Ca. علاوة على ذلك ، تم تقليل تضيق الأوعية الناجم عن CaCl 2 بواسطة المستخلص النباتي ، مما يشير إلى أن آليته تنطوي على تثبيط المركبات العضوية المتطايرة على VSMCs أو التدخل في تفاعلات Ca^{2 +} مع الآلات المقلصة. وينبغي إجراء دراسات تكميلية لمواصلة تحليل عملها الميكانيكي التفصيلي. علاوة على ذلك ، تم تقليل الانكماش العابر إلى PE في كريبس الخالي من Ca 2 + ، مما يشير إلى أن المستخلص النباتي منع إطلاق Ca^{2 +} من SR ، مما أدى إلى الحد من تضيق الأوعية. يوضح الشكل 11 ملخصا للآلية المفسرة لعمل المرخيات الوعائية للمستخلص النباتي.

والبروتوكولات التجريبية المقترحة في هذه الدراسة مجدية تقنيا وتظهر قابلية جيدة للتكرار؛ ومع ذلك، فإن بعض الخطوات الحاسمة ضرورية لضمان النجاح. أولا ، يجب الحفاظ على تكوين المحلول الفسيولوجي بدقة أثناء التحضير لضمان عمل الإجراء بشكل صحيح. أيضا ، من الضروري تجنب لمس الشريان الرئوي أو تمدده أو إتلافه أثناء التحضير. يجب استبدال الوسط باستمرار كل 15 دقيقة (3 مرات) لتحقيق الاستقرار في الاختبار والتقييم بمجرد تثبيت الشريان الرئوي في غرفة حمام العضو. يجب زيادة التوتر المسبق للسفينة إلى أعلى قليلا من المستوى المطلوب ثم يتم تقليله تدريجيا حتى يتم تحقيق الأمثل (أي 1 جم).

يتم تقييم العديد من البروتوكولات التجريبية ، مثل صلاحية الأوعية الدموية ، ووجود الخلايا البطانية ، وتأثير المستخلصات النباتية على استرخاء الأوعية الدموية ، بواسطة هذه التقنية. يمكن أن يكون الإجراء الموضح لعزل الفئران IPA متناغما مع الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، الفأر والأرنب والإنسان). ومع ذلك ، قد تختلف الظروف المثلى المطلوبة لتجميع حمام الأعضاء بين النماذج الحيوانية المختلفة ويمكن تكييفها وفقا لذلك. الأهم من ذلك ، أن الظروف التجريبية ليست تكرارا دقيقا للظروف الفسيولوجية ، ولا يمكن استقراء النتائج مباشرة إلى ظاهرة الجسم الحي .

طريقة عزل IPA هذه وقياسات استجابة الأوعية الدموية هي طرق عملية لتقييم فسيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الأمراض وعلم الصيدلة. وهو يمكن الباحثين من دراسة تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية في بيئة معزولة ولكن يتم التحكم فيها جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييفه لدراسة العمل العلاجي للأدوية المستخدمة في أمراض الأوعية الدموية الرئوية ، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يود المؤلفون أن ينحبوا بالمجلس الوطني للبحوث في تايلاند ، ومركز التميز للابتكار في الكيمياء (PERCH-CIC) ، وشبكة البحوث الدولية (IRN61W0005) لتقديمهم الدعم المالي ، وقسم علم وظائف الأعضاء كلية العلوم الطبية ، جامعة ناريسوان ، لدعم مرفق البحوث.