تقنية تشريح جانبي للحبل الشوكي طفيفة التوغل وسريعة لنمذجة إصابات الحبل الشوكي المفتوحة في الفئران

هنا ، نصف تقنية جديدة وسريعة لنمذجة إصابة الحبل الشوكي المفتوحة في الفئران التي تقضي على استئصال الصفيحة الفقرية. يتم إجراء التشريح الجانبي أثناء المشاهدة من خلال المجهر. هذه التقنية متعددة الاستخدامات ويمكن استخدامها أيضا في مناطق عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر في الحبل الشوكي للحيوانات الأخرى.

تقنيات إصابات الحبل الشوكي المفتوحة التي تعرض نمذجة الإصابات الشبيهة بالتمزق تستغرق وقتا طويلا وتدخل بشكل جراحي لأنها تنطوي على استئصال الصفيحة الفقرية. تقضي هذه التقنية الجديدة على استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق إزالة عمليتين شائكتين ورفعهما ، ثم إمالة القوس الفقري الذيلي. تفتح المنطقة الجراحية دون الحاجة إلى استئصال الصفيحة الفقرية. ثم يتم إجراء التشريح الجانبي بتحكم مرئي مباشر تحت المجهر. يتم تقليل الصدمة إلى الحد الأدنى ، ولا تتطلب سوى جرح عظمي صغير.

تتميز هذه التقنية بالعديد من المزايا: فهي أسرع ، وبالتالي أقل عبئا على الحيوان ، وجرح العظام أصغر. نظرا لأنه يتم التخلص من استئصال الصفيحة الفقرية ، تقل فرصة الإصابة غير المرغوب فيها للحبل الشوكي ، ولا توجد شظايا عظمية يمكن أن تسبب مشاكل (يمكن أن تسبب شظايا العظام المضمنة في الحبل الشوكي تورما وتلفا ثانويا). القناة الفقرية لا تزال سليمة. القيد الرئيسي هو أنه لا يمكن إجراء التشريح إلا في المساحات الفقرية.

تظهر النتائج أنه يمكن إجراء هذه التقنية بشكل أسرع بكثير من النهج الجراحي التقليدي ، باستخدام استئصال الصفيحة الفقرية (11 دقيقة مقابل 35 دقيقة). يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة للباحثين الذين يعملون مع النماذج الحيوانية لإصابة الحبل الشوكي المفتوح لأنها قابلة للتكيف على نطاق واسع ولا تتطلب أي أجهزة متخصصة إضافية.

إصابات الحبل الشوكي (SCIs) هي للأسف إصابات منتشرة في البشر. يمكن أن تكون اصابات النخاع الشوكي معقدة بطرق مختلفة ، على سبيل المثال ، بسبب العدوى ، ومن المهم سريريا دراسة هذه الإصابات¹. نظرا لعدم وجود علاج واحد محدد لإصابات النخاع الشوكي ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج حيوانية لتعزيز فهم الباحثين وتطوير العلاجات الممكنة ^2,3. على الرغم من أن الإصابات المغلقة هي الأكثر شيوعا (الضغط والكدمة) ، فمن المهم سريريا فهم التمزقات ، والتي لا يمكن نمذجتها إلا في الإصابات المفتوحة⁴. يمكن استخدام نماذج الجرح المفتوح باستخدام القطع أو التشريح لإظهار توطين أكثر دقة للجرح مقارنة بنماذج الإصابة المغلقة ، نظرا لطبيعة الإصابة (الكدمة مقابل القطع الجراحي). يمكن لتجارب الجرح المفتوح أن تلقي الضوء على إصابات عصبية أكثر تحديدا بطريقة مضبوطة وموثوقة وقابلة للتكرار⁵. الاستئصال الكامل أو الجزئي للحبل الشوكي هو تقنية الجرح المفتوح المستخدمة على نطاق واسع ويمكن مشاهدتها بالتفصيل في المقالة التي كتبها براون ومارتينيز⁶.

عند دراسة إصابة الحبل الشوكي المفتوح في الفئران ، قدمت العديد من الحيوانات مشاكل نشأت عن الجراحة: أصبحت شظايا العظام من استئصال الصفيحة الفقرية جزءا لا يتجزأ من الحبل الشوكي وتسببت في تورم. احتاج الجرح العظمي الأكبر إلى وقت طويل للشفاء ؛ استغرقت الجراحة وقتا طويلا. تم تطوير تقنية جراحية بديلة للقضاء على هذه المشاكل. كان الهدف هو تطوير تقنية أسرع ألطف للحيوان. هذه التقنية المطورة حديثا أسرع بكثير من تقنيات اصابات النخاع الشوكي التقليدية. النهج الجراحي طفيف التوغل ، مما يؤدي إلى جرح عظمي أصغر مع القضاء على المشاكل الناشئة عن استئصال الصفيحة الفقرية.

تتضمن جميع تقنيات الجرح المفتوح فتح الجافية⁷. درست العديد من الدراسات الحديثة تقنيات مختلفة مطورة حديثا ، تهدف إلى تحسين الأساليب السابقة ^8,9. على الرغم من أنه لا يمكن استبعاد فتح الجافية باستخدام هذه التقنية الجديدة ، إلا أنه يسبب جرحا أصغر على الجافية بينما يقدم إصابة موثوقة ومضبوطة للحبل الشوكي. بالرجوع إلى الأدبيات المتعلقة بتقنيات إصابة الحبل الشوكي ، حاول العديد من المؤلفين تقليل وقت الجراحة من خلال تنفيذ تغييرات طفيفة على التقنية الأصلية¹⁰. يعد استئصال الصفيحة الفقرية دائما جزءا من هذه العمليات الجراحية ، على الرغم من أنه يستغرق وقتا طويلا ويتطلب جرحا عظميا أكبر⁶. يمكن أن تكون هذه التقنية الجراحية مناسبة للباحثين الذين يستخدمون نماذج إصابة الحبل الشوكي للجرح المفتوح ، وتحديدا القطع الكامل أو التشريح الجانبي الذي يتم إجراؤه في المساحات الفقرية (الشكل 1).

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي (2010/63 / EU) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة للمكتب الوطني المجري لسلامة السلسلة الغذائية (PEI / 001/2894-11/2014). تم اتباع جميع اللوائح المؤسسية والحكومية المعمول بها فيما يتعلق بالاستخدام الأخلاقي للحيوانات خلال هذه الدراسة.

1. التحضير قبل الجراحة

1. تعقيم جميع الأدوات المستخدمة أثناء الإجراء (انظر جدول المواد) وتطهير الأسطح حيث سيتم تنفيذ العمل قبل الإجراء.
2. حقن جرعة واحدة من المضادات الحيوية تحت الجلد بشكل وقائي.
   ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل جرعة المضادات الحيوية.
3. اترك الحيوانات في غرفة العمليات لمدة 1 ساعة للتأقلم معها وتقليل إجهادها قبل الجراحة.
4. تخدير الجرذ عن طريق الحقن العضلي لمزيج من الكيتامين والزيلازين (الكيتامين 80 مغ/كغ من وزن الجسم والزيلازين 8 مغ/كغ من وزن الجسم).
   ملاحظة: بالإضافة إلى التخدير ،يوفر مزيج k etamine-xylazine تسكين كاف لهذا الإجراء. يمكن تعديل نظام التسكين وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام الحيوانات.
5. حافظ على دفء الفئران أثناء العملية باستخدام طاولة ساخنة أو ضوء الأشعة تحت الحمراء والحفاظ على رطوبة العينين طوال فترة التخدير باستخدام مرهم العيون (أعد وضعه حسب الضرورة).
6. ثبت الحيوان على طاولة العمليات باستخدام شريط جراحي على الكفوف الأمامية والخلفية والذيل ، واعتمادا على موقع الإصابة ، على الرقبة أيضا. إذا لزم الأمر ، ضع الفئران في إطار تجسيمي لتثبيته أثناء الجراحة.
7. باستخدام خياطة جراحية معقمة ، ضع حلقة حول الأسنان الأمامية العلوية للفأر وقم بتثبيتها على حافة طاولة العمليات.
8. اسحب اللسان جانبيا لإدارة مجرى الهواء.
9. حلق الفراء على الظهر ، على الأقل 2 سم في كل اتجاه من حيث سيتم إجراء شق.
10. تطهير جلد المنطقة الجراحية ثلاث مرات على الأقل ، باستخدام محلول بوفيدون اليود وشاش معقم. احرص بشكل خاص على نقع الفراء المحيط بالمنطقة. تأمين موقع الجراحة مع ستارة معقمة.
11. تقييم مدى كفاية التخدير قبل وضع الشق الأول عن طريق الضغط على أصابع القدم وذيل الحيوان. استمر في مراقبة مدى كفاية التخدير أثناء الإجراء بأكمله.

2. الجراحة

1. ضع شق الجلد باستخدام شفرة مشرط 20. لفتح المنطقة الجراحية ، ضع شقا بطول 2-2.5 سم على طول العمود الفقري ، مع قطع جميع طبقات الجلد. ضع هذا الشق بالتوازي مع العمود الفقري باستخدام الفقرة L1 كنقطة منتصف ، مما يجعلها تمتد ~ 1 سم في كل من الاتجاه الجمجفي والذيلية على طول العمود الفقري.
2. حرك جوانب الجرح عن طريق قطع النسيج الضام المحيط بالعضلات.
3. ضع شقين متوازيين على طول العمود الفقري ، مخترقا السمحاق. ضع الشقوق بجوار عمليات العمود الفقري على كلا الجانبين ، وتمتد المسافة بين فقرات Th13 و L1.
4. تشريح العضلات المرتبطة بالفقرات بمساعدة raspatorium حتى تصبح جميع الأربطة الشوكية مرئية. ضع في مكانه مبسحب.
5. إزالة عمليات العمود الفقري^{للفقرة الصدرية} 13 والفقرة^{القطنية} 1 باستخدام ملقط عظام الأسنان لتصور المنطقة الجراحية بأكملها. هنا ، تحكم في الإجراء من خلال عرض صورة مجهرية مكبرة (تكبير 4x-16x).
6. استخدم شاشا معقما للسيطرة على النزيف طوال العملية ، عند الضرورة.
7. ارفع بعناية ما تبقى من عمليات العمود الفقري L1 ، وارفع القوس الفقري L1. قطع الرباط flavum للوصول إلى الحبل الشوكي. رفع عمليات العمود الفقري الذيلية أكثر ، مما يسمح بالوصول إلى الأم الجافية الشوكية ، والتي يتم قطعها أيضا. قم بطرف عمليات العمود الفقري الذيلية في اتجاه الجمجمة لتصور الأم الحنان.
8. انظر من خلال الأم الحنون للوريد المتوسط الخلفي ، مع عرض خط الوسط للعمود الفقري.
9. باستخدام الوريد كمنصف اتجاهي ، ضع شقا باستخدام مشرط جراحي مجهري مع تجنيب الوريد. ضع الشق تحت الوريد ، في المستوى المستعرض من خلال القطر الأمامي الخلفي للحبل الشوكي. اقطع نصف الحبل الشوكي عن طريق تحريك الشفرة جانبيا بعيدا عن خط الوسط.
   ملاحظة: الشق أحادي الجانب ، على الجانب الأيمن ، في^{الجزء القطني} 4.
10. حاول وضع الشق لتجنب قطع الشريان الشوكي الأمامي. تأكد من عدم تطبيق الضغط الزائد على الجسم الفقري عند قطع الحبل الشوكي لتجنيب الشريان الشوكي الأمامي على الجانب البطني من الحبل الشوكي.

الشكل 1: عمل فني يوضح خطوات تقنية اصابات النخاع الشوكي المفتوحة الجديدة في الفئران. أ: الفقرات المكشوفة. (ب) إزالة العمليات النخاعية (Th13 و L1). ج: القوس الفقري المرفوع والمائل للفقرة L1. د: إجراء التشريح النصفي على الجانب الأيمن، مع تكبير الحبل الشوكي المصاب بشكل منفصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

11. لا تغلق الأم الجافية مباشرة أثناء إغلاق الجرح. خياطة بإحكام (حجم خياطة 4-0) العضلات على طول عمليات العمود الفقري ، وإغلاق الجرح الصغير بشكل غير مباشر على الأم الجافية.
12. أغلق طبقة النسيج الضام الظهري بالغرز.
13. أخيرا ، قم بخياطة الجلد حول موقع الشق.

3. رعاية ما بعد الجراحة والمتابعة

1. اسمح للحيوانات بالاستيقاظ في أقفاصها. حافظ على دفء الحيوان (الحيوانات) باستخدام مصباح حراري بالإضافة إلى الغرفة التي يتم التحكم في درجة حرارتها. لا تترك الفئران وحدها بعد استيقاظها بعد الجراحة ، ولا تضعها مع الفئران الأخرى في نفس القفص.
2. راقب معدل تنفسهم كل 10 دقائق على الأقل حتى يستيقظوا تماما. إذا لزم الأمر ، قم بتطبيق التحفيز اللطيف (على سبيل المثال ، فرك الرأس) للمساعدة في إيقاظهم من التخدير.
3. عندما تكون الحيوانات في حالة تأهب ونشطة بشكل مناسب ، قم بنقلها بأمان إلى بيت الحيوان.
4. إبقاء الفئران تحت المراقبة الدقيقة لأول 24 ساعة بعد الجراحة. بعد أول 24 ساعة بعد الجراحة ، تحقق من الحيوانات مرتين على الأقل يوميا حتى نهاية التجربة ، ومراقبة علامات الضيق.
5. قم بتقييمهم بدقة مرة واحدة يوميا بحثا عن علامات الضيق باستخدام بروتوكول رعاية الحيوان المؤسسي ذي الصلة واحرص بشكل خاص على فحص جروحهم بحثا عن علامات العدوى والالتهاب.
   ملاحظة: يؤثر الإجهاد والعدوى على رفاهية الحيوانات ونتائج التجارب.
6. إدارة المضادات الحيوية تحت الجلد كل يوم حتى نهاية التجارب. احتفظ بالحيوانات في أقفاص معقمة ، واحد لكل قفص ، وقدم الطعام والماء حسب الطلب ، كما كان من قبل. في نهاية التجارب (أو إذا لوحظ أي رد فعل سلبي خطير خلال الإطار الزمني للتجربة) ، القتل الرحيم للحيوانات بشكل إنساني ، وفقا لبروتوكول رعاية الحيوان المؤسسي ذي الصلة.
   ملاحظة: هنا ، تم القتل الرحيم للحيوانات (في نوم عميق ناتج عن مزيج من الكيتامين - زيلازين) عن طريق إعطاء تروية ملحية فسيولوجية أولا (1/3 مل / غرام من وزن الجسم) تليها نضح بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ (1 مل / غرام من وزن الجسم).

بعد التشريح ، تظهر الفئران شللا في الطرف الخلفي المماثل (في الجسم الحي دليل على نجاح التشريح). لا يمكن إجراء تقييم شامل للعينة إلا بعد إزالة الحبل الشوكي (انظر الشكل 2 ، حيث يمكن رؤية الحبل الشوكي الذي تمت إزالته من كلا الجانبين البطني والظهري).

الشكل 2: المناظر البطنية والظهرية للحبل الشوكي الذي تمت إزالته بعد التشريح. يظهر الحبل الشوكي الذي تمت إزالته بالكامل من الجانب البطني (A) والجانب الظهري (B) جنبا إلى جنب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أولا ، يتم تحليل الحبل الشوكي الذي تمت إزالته بالكامل تحت المجهر باستخدام تكبير 4x-16x (لتقييم درجة ودقة الإصابة). ثم يتم تحليل العينة بشكل أكبر باستخدام الأنسجة ، حيث يمكن رؤية موقع الإصابة بمزيد من التفصيل. تم استخدام صبغة الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لإعداد العينات (الشكل 3).

الشكل 3: عينة نسيجية تظهر التشريح. عينة نسيجية ملطخة باستخدام الهيماتوكسيلين ويوسين ، تظهر التشريح ، ينظر إليها تحت المجهر (تكبير 16x). شريط المقياس = 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 2 والشكل 3 أن الشق مقبول تماما في الطول والموضع. كانت جودة العينات جيدة على الأقل مثل تلك التي تم الحصول عليها من الحيوانات التي تم تشويه حبالها الشوكية باستخدام النهج الجراحي التقليدي مع استئصال الصفيحة الفقرية (للحصول على وصف مفصل للطريقة الجراحية التقليدية ، انظر ⁶). لا تختلف الصور نوعيا عن نتيجة أي نهج جراحي آخر ، على الرغم من أن هذه التقنية أسرع ولا يوجد استئصال الصفيحة الفقرية.

تظهر النتائج أنه يمكن إجراء هذه التقنية بشكل أسرع بكثير من النهج الجراحي التقليدي باستخدام استئصال الصفيحة الفقرية (11 دقيقة مقابل 35 دقيقة). يتعرض الحبل الشوكي لمدة 10-15 ثانية بهذه الطريقة ، مقارنة بحد أدنى 3.5 دقيقة باستخدام استئصال الصفيحة الفقرية (حتى إغلاق الجافية). في الختام ، فإن طريقة اصابات النخاع الشوكي الجديدة طفيفة التوغل هذه بدون استئصال الصفيحة الفقرية أسرع بكثير ولا تتطلب أي أجهزة متخصصة إضافية.

تم تطوير تقنية إصابة الحبل الشوكي طفيفة التوغل هذه عند دراسة الفئران المصابة بالحبل الشوكي ، وواجه الفريق مشاكل ناشئة عن الجراحة نفسها (شظايا العظام من استئصال الصفيحة الفقرية تسبب ضغطا وتلفا للحبل الشوكي ، وتستغرق الجراحة وقتا طويلا ، وبطء الشفاء لجرح عظمي كبير). من خلال القضاء على استئصال الصفيحة الفقرية ، أصبح الإجراء أسرع بكثير (11 دقيقة مقابل 35 دقيقة) ، وظل هيكل القناة الفقرية سليما ، وكان جرح العظام أصغر بكثير ، ولم تكن هناك شظايا عظمية يمكن أن تلحق الضرر بالحبل الشوكي.

لا يمكن القضاء على إزالة العمليات الشائكة لأن إزالة العملية الشائكة العلوية (الجمجمة) ضرورية لإمالة العملية الشائكة السفلية (الذيلية) للخلف. إزالة العملية الشائكة السفلية يحسن بشكل كبير من رؤية الحبل الشوكي ، مما يسهل التشريح.

التشريح هو الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول. هنا ، يتم إجراء التشريح يدويا ، على الرغم من أن هذا ليس شرطا مسبقا. يمكن استخدام أداة مجسمة بدلا من ذلك. يمكن أيضا وضع الفئران في إطار تجسيمي لتثبيت الحيوان أثناء الجراحة⁶. ستتطلب هذه الخطوة تعديلا طفيفا فقط في التقنية الموضحة هنا. يمكن أن يكون هذا مفيدا أيضا إذا كان شخص لديه خبرة قليلة يقوم بتنفيذ الإجراء.

هذه التقنية الجديدة متعددة الاستخدامات للغاية. هنا ، تم تنفيذ الإجراء في الجزء القطني L4 (فقرة L1) ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدامه في أجزاء أخرى من الحبل الشوكي مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات المحددة للتجربة الفعلية (تم استخدام هذه التقنية في مناطق الصدر وعنق الرحم أيضا). يمكن أيضا تعديله بسهولة لتنفيذ قطع كامل للحبل الشوكي بدلا من التشريح. يسمح رفع القوس الفقري بالفحص المباشر للجزء المعطى من الحبل الشوكي. وبالتالي ، يمكن أيضا إزالة قرص صغير من أنسجة الحبل الشوكي لضمان الاستئصال الكامل.

لا يقتصر استخدام هذه التقنية الجديدة على الجرذان ولكن يمكن تطبيقها أيضا على الأنواع الأخرى المستخدمة لنمذجة إصابات الحبل الشوكي (مثل الفئران والخنازير والكلاب). القيد الرئيسي لهذه التقنية هو أنه نظرا لأنه لا يمكن إجراء التشريح (أو القطع) إلا في المساحات الفقرية ، فهو غير مناسب لأولئك الذين يحتاجون على وجه التحديد إلى وضع القطع في المساحات الفقرية. علاوة على ذلك ، نظرا لأنها تقنية مفتوحة الجرح ، فهي ليست مثالية لنمذجة الكدمات أو إصابات الضغط.

ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه التقنية هي الخيار المثالي لدراسة اصابات النخاع الشوكي المفتوحة ، حيث يتم تنفيذ التشريح (أو القطع) بدقة ويمكن استنساخه بسهولة. يمكن أيضا دراسة مسارات العمود الفقري باستخدام عدد أقل من القطع الأثرية حيث تظل القناة الفقرية سليمة. يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند دراسة الأساليب العلاجية طفيفة التوغل. باستخدام هذه التقنية ، يمكن أن يكون تركيز الاهتمام فقط على العلاج بدلا من الآثار الجانبية المحتملة للجراحة¹¹.

في الختام ، لا تتطلب هذه التقنية الجديدة طفيفة التوغل معدات جديدة ولا إعدادات باهظة الثمن حيث يتم استخدام المعدات المتاحة بسهولة في المختبرات التي تعمل مع الحيوانات فقط. يمكن تكييفه بسهولة مع الاحتياجات المحددة لدراسة معينة (موقع الإصابة ؛ hemi- أو transection ؛ نوع الحيوان). كما أنه سهل التعلم. لذلك ، قد يكون هذا التعديل ذا أهمية للباحثين الذين يعملون مع نماذج اصابات النخاع الشوكي المفتوحة.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

يود المؤلفون أن يشكروا Gergely Ángyán على العمل الفني الأصلي. تم تمويل هذا العمل البحثي من قبل جامعة Semmelweis ، بودابست ، المجر. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل البرنامج التشغيلي لتنمية الموارد البشرية الهنغارية (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). تم تلقي دعم إضافي من برنامج التميز المواضيعي (2020-4.1.1.-TKP2020) التابع لوزارة الابتكار والتكنولوجيا في المجر ، في إطار البرنامج المواضيعي للعلاج بجامعة Semmelweis.