Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعد زراعة خلايا الحصين المنفصلة أداة تجريبية محورية في علم الأعصاب. يتم تعزيز بقاء الخلايا العصبية ووظيفتها في الثقافة عند استخدام الهياكل العظمية المرجانية كمصفوفات ، بسبب أدوارها العصبية والعصبية. وبالتالي ، فإن الخلايا العصبية التي تزرع على مصفوفة المرجان تظهر متانة أعلى ، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة للزراعة.

Abstract

تعد مزارع الخلايا العصبية والدبقية المنفصلة في الحصين نموذجا تجريبيا قيما لدراسة النمو العصبي ووظيفته من خلال توفير عزل عالي للخلايا وبيئة خاضعة للرقابة. ومع ذلك ، فإن بقاء خلايا الحصين في المختبر معرض للخطر: تموت معظم الخلايا خلال الأسبوع الأول من الثقافة. لذلك من الأهمية بمكان تحديد طرق لزيادة متانة الخلايا العصبية في الثقافة.

يمكن استخدام كربونات الكالسيوم في شكل أراغونيت بلوري مشتق من الهيكل العظمي للشعاب المرجانية كمصفوفة متفوقة ونشطة للثقافات العصبية. من خلال رعاية الخلايا الدبقية وحمايتها وتنشيطها ، يعزز الهيكل العظمي المرجاني بقاء ونمو هذه الخلايا في المختبر بشكل أفضل من المصفوفات الأخرى.

يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة خلايا الحصين على مصفوفة مرجانية. يتم إنشاء هذه المصفوفة عن طريق ربط حبيبات الهياكل العظمية المرجانية بأطباق الاستزراع والقوارير وأغطية الزجاج. تساعد الحبوب في تحسين بيئة الخلايا من خلال إدخالها إلى بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) لتنمو وتشكل هياكل تشبه الأنسجة. يمكن تحسين بيئة 3D التي أدخلها الهيكل العظمي المرجاني للخلايا عن طريق الطحن ، مما يتيح التحكم في حجم وكثافة الحبوب (أي خشونة المصفوفة) ، وهي خاصية وجد أنها تؤثر على نشاط الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الحبوب يجعل مراقبة وتحليل الثقافات أسهل ، خاصة عند استخدام المجهر الضوئي. ومن ثم ، يتضمن البروتوكول إجراءات لتوليد وتحسين مصفوفة الشعاب المرجانية كأداة لتحسين صيانة ووظائف الخلايا العصبية في المختبر.

Introduction

تعد مزارع الخلايا العصبية المنفصلة ، في هذه الحالة خلايا الحصين ، نموذجا تجريبيا قيما لدراسة النمو العصبي ووظيفته من خلال توفير عزل عالي للخلايا وإمكانية الوصولإليها 1،2،3. كثيرا ما يستخدم هذا النوع من الثقافة في علم الأعصاب ، وتطوير الأدوية ، وهندسة الأنسجة بسبب الكم الكبير من المعلومات التي يمكن جمعها ، مثل معدلات النمو والجدوى ، والسمية العصبية ، ونمو الخلايا العصبية والشبكات ، والاتصال المشبكي واللدونة ، والتعديلات المورفولوجية ، وتنظيم الخلايا العصبية والأسلاك ، إلخ.1،4،5،6،7.

على الرغم من أهمية الثقافات ، عادة ما تضطر الخلايا المزروعة إلى النمو على أغطية زجاجية في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد. تقلل هذه التعديلات البيئية الصارمة بشكل كبير من قدرة الخلايا العصبية على البقاء على قيد الحياة بمرور الوقت ، لأن أغطية الزجاج هي ركائز غير مغذية ذات قوة التصاق منخفضة ، وتظهر قدرة أقل على دعم نمو الخلايا8،9،10،11.

نظرا لأن الخلايا العصبية المزروعة تضطر إلى النمو في ظروف صعبة ، فإن النهج الأساسي لتعزيز بقائها هو تقليد بيئتها الطبيعية قدر الإمكان12,13. يمكن تحقيق ذلك باستخدام المواد الحيوية التي ستعمل كمصفوفات وتحاكي المصفوفة خارج الخلية للخلايا ، مما يمكنها من تكوين بنية تشبه الأنسجة والمساعدة في تغذيتها14.

يعد استخدام المواد الحيوية نهجا واعدا في تحسين مزارع الخلايا ، لأنها تعمل كسقالات متوافقة حيويا ، وتوفر الاستقرار الميكانيكي وتعزز مجموعة متنوعة من خصائص الخلايا ، بما في ذلك الالتصاق والبقاء والانتشار والهجرة والتشكل والتمايز15،16،17. تستخدم عدة أنواع من المواد الحيوية لتحسين ظروف الخلايا في المختبر. من بينها البوليمرات الحيوية ، أو المكونات البيولوجية التي عادة ما تكون جزءا من المصفوفة خارج الخلية للخلايا. تستخدم هذه المواد الحيوية في الغالب كشكل من أشكال عوامل الطلاء المبلمرة أو الهلاميات المائية18،19،20. من ناحية ، تمنح المصفوفات المذكورة أعلاه الخلايا بيئة 3D مألوفة للنمو فيها ، وتشجع التصاقها بالطبق ، وتمنحها الدعم الميكانيكي21,22. من ناحية أخرى ، فإن شكلها المبلمر وحصر الخلايا داخل الهلاميات المائية يزعج وصول الخلايا إلى مكونات التغذية الموجودة في وسائط النمو ويجعل متابعة الخلايا بالطرق المجهرية أكثر صعوبة23.

الهياكل الخارجية المرجانية هي مصفوفات بيولوجية بحرية المنشأ. إنها مصنوعة من كربونات الكالسيوم ، ولها استقرار ميكانيكي ، وقابلة للتحلل. أظهرت الدراسات السابقة التي تستخدم الهيكل العظمي المرجاني كمصفوفة للخلايا العصبية المتنامية في الثقافة التصاق أكبر بكثير ، مقارنة بأغطية الزجاج24,25. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا العصبية المزروعة على الهيكل العظمي المرجاني قدرتها على تناول الكالسيوم الذي يتكون منه الهيكل العظمي ، والذي يحمي الخلايا العصبية في ظروف الحرمان من المغذيات26. علاوة على ذلك ، فإن الهيكل العظمي المرجاني عبارة عن مصفوفة داعمة ورعاية تزيد من بقاء الخلايا العصبية ، وتشجع على تكوين الشبكات العصبية ، وترفع معدل الاتصال المشبكي ، وتمكن من تكوين هياكل تشبه الأنسجة27,28. أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن التضاريس السطحية لمصفوفة الهيكل العظمي المرجاني تلعب دورا حاسما في توزيع وتنشيط الخلايا الدبقية 8,29. أيضا ، الهيكل العظمي المرجاني فعال كمصفوفة لزراعة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا العظمية30،31 ، وخلايا الكبد ، وخلايا عضلة القلب في الثقافة (بيانات غير منشورة).

وبالتالي ، فإن الهيكل العظمي المرجاني هو مصفوفة واعدة لزراعة الخلايا في المختبر. وبالتالي ، يصف البروتوكول المفصل أدناه تقنية زراعة الخلايا العصبية على الهيكل العظمي المرجاني لإنتاج ثقافات عصبية أكثر استقرارا وازدهارا من تلك التي تحققها الطرق الحالية. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لزراعة الخلايا العضلية القلبية وخلايا الكبد وأنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الوطنية لرعاية واستخدام الحيوان.

ملاحظة: يجب استخدام الهياكل العظمية المرجانية الغازية الكالسيوم في الشكل البلوري للأراغونيت. أنواع المرجان التي تم اختبارها حتى الآن للمزارع العصبية هي Porites Lutea و Stylophora Pistillata و Trachyphyllia Geoffroyi. يمكن شراء الهياكل العظمية كاملة أو مطحونة.

1. تنظيف قطع الهيكل العظمي المرجاني

تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التالية في غطاء كيميائي في درجة حرارة الغرفة ، لأن المحاليل الموضحة أدناه خطرة وقد تسبب حروقا وتهيجا.

  1. استخدم مطرقة لكسر الهيكل العظمي المرجاني وتقسيمه إلى شظايا 0.5-2 سم. من أجل إذابة المخلفات العضوية وغير العضوية ، انقع شظايا الهيكل العظمي المرجاني في محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق ، ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المقطر المزدوج (DDW).
  2. لإزالة البقايا العضوية المتبقية ، انقع الشظايا في محلول 1M NaOH لمدة 5 دقائق ، ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام DDW. استمر في إزالة الرواسب العضوية عن طريق نقع الشظايا في محلول 30٪ H 2 O2لمدة 10 دقائق ، ثم اغسل الشظايا 3x باستخدام DDW.
  3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من DDW الزائد واترك شظايا المرجان في الغطاء حتى تجف (1-8 ساعات).

2. تنظيف أغطية الزجاج

  1. انقل الغطاء الزجاجي إلى طبق بتري زجاجي مقاس 100 مم. أضف 10 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بإزالة الإيثانول واغسله باستخدام DDW 3x ، وانتظر 10 دقائق بين كل غسلة. ضع الطبق على صفيحة تسخين مسبقة التسخين بدرجة حرارة 80 درجة مئوية حتى يتبخر DDW. حرك أغطية الغطاء برفق داخل الطبق عدة مرات أثناء التجفيف لمنعها من الالتصاق ببعضها البعض.
  3. الأوتوكلاف أغطية الغطاء.

3. إعداد الحبوب الهيكل العظمي المرجاني

  1. طحن شظايا الهيكل العظمي المرجاني باستخدام هاون ومدقة (طحن يدوي) حتى انهيار كامل. والنتيجة هي خليط من الحبوب بأحجام تتراوح من 20 ميكرومتر إلى 200 ميكرومتر.
  2. بدلا من ذلك ، قم بطحن شظايا الهيكل العظمي المرجاني باستخدام آلة طحن كهربائية بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية (طول الشفرة = 6 سم ؛ العرض = 0.5 سم - 1.0 سم). حجم الحبوب الناتج مشابه لنطاق الحجم الناتج عن الطحن اليدوي.

4. تنقية الحبوب من نطاق حجم معين

ملاحظة: إذا كان التحكم في حجم الحبوب في المصفوفة مطلوبا ، فاستخدم إجراء تنقية الحبوب القائم على الترشيح التالي.

  1. انقل الحبوب إلى مصفاة شبكية تصفية يدوية أو كهربائية 40 ميكرومتر.
  2. قسم الحبوب إلى نطاقين محددين عن طريق غربلة الحبوب من خلال المصفاة (في حالة استخدام مصفاة كهربائية ، يوصى بالشروط التالية: الاهتزاز = 600 سعة / دقيقة ، الارتداد = 6 / ثانية). ينتج هذا الإجراء مجموعتين من أحجام الحبوب ، واحدة <40 ميكرومتر ، والثانية >40 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن تحديد الحجمين باستخدام مصافي ذات شبكات مختلفة. إذا كنت ترغب في نطاق أكثر تقييدا ، فقم بإعادة غربلة كل مجموعة من الخطوة 4.2 من خلال مصافي ذات شبكات مختلفة.
  3. الأوتوكلاف الحبوب.

5. إعداد الأطباق المغطاة بالحبوب المرجانية أو أغطية الغطاء

  1. لطلاء القوارير أو الأطباق أو أطباق بتري
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة.
    1. أضف حبيبات الهيكل المرجاني إلى محلول بولي-د-ليسين (PDL) سعة 20 ميكروغرام / مل مذاب في محلول هانكس. التركيز الموصى به هو 5 ملغ / 10 ملغ من الحبوب لكل 1 مل من محلول PDL.
    2. يسكب المحلول في قوارير وأطباق (حوالي 2 مل / 25 سم2) ويحتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تغرق الحبوب وتعلق على القاع.
    3. في اليوم التالي ، اغسل القوارير والأطباق مرة واحدة باستخدام DDW المعقم. دع القوارير والأطباق تجف في الغطاء.
      ملاحظة: يفضل استخدام القوارير والأطباق المغلفة حديثا. يمكن استخدام القوارير والأطباق المطلية لمدة تصل إلى أسبوع بعد الطلاء إذا تم حفظها عند 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، قد تتعرض فعالية المصفوفة للخطر.
  2. أغطية زجاجية مطلية (قطر 12 مم ، سمك 0.17 مم)
    1. أضف حبيبات الهيكل العظمي المرجاني إلى DDW بأي تركيز مرغوب. الكثافات الشائعة المستخدمة للخلايا العصبية هي 5 مجم / مل و 10 مجم / مل. صب 40 ميكرولتر من محلول الحبوب على وسط الغطاء (الشكل 4).
    2. ضع أغطية الغطاء على صفيحة تسخين مسبقة إلى 80 درجة مئوية وانتظر التبخر الكامل (عادة 15 دقيقة). في ظل هذه الظروف ، تلتصق الحبوب بغطاء الغطاء. الأوتوكلاف أغطية المغلفة. تخزينها في ظروف معقمة.
    3. قبل يوم واحد من الثقافة ، ضع أغطية الغطاء على غطاء صفيحة بئر معقمة 24. أضف 100 ميكرولتر من محلول PDL 20 ميكروغرام / مل إلى كل قسيمة غطاء. استخدم الطرف للتأكد من أن السائل يغطي منطقة الحبوب بأكملها وبقية سطح الغطاء.
    4. غطي الغطاء بأسفل اللوحة. لف جوانب الألواح بفيلم البارافين. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    5. في اليوم التالي ، اغسل مرة واحدة باستخدام DDW وجفف في الغطاء.
      ملاحظة: يفضل استخدام أغطية مغلفة حديثا.

6. زراعة خلايا الحصين المنفصلة على أغطية زجاجية مغلفة بالحبوب ذات الهيكل العظمي المرجاني

ملاحظة: تم تعديل طريقة زراعة الخلايا المنفصلة الحصين من الإجراءات المنشورة سابقا24،27. يوصف إعداد الثقافة لأربعة الجراء الفئران. العائد المتوقع من كل قرن آمون هو 1 - 1.5 × 106 خلايا.

  1. اعداد
    1. تحضير طبق بتري فارغ 60 ملم. صب 2 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) في طبق بتري 60 مم وضعه على الثلج.
    2. صب 2 مل من MEM في طبق 35 مم وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5-10٪ CO2. صب 2 مل من MEM في أنبوب سعة 15 مل واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.
    3. صب 1 مل من متوسط اليوم الأول في أنبوب 15 مل وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5-10٪ CO2.
      ملاحظة: تم وصف تكوين وسيط اليوم الأول في جدول المواد.
    4. قم بإذابة 200 ميكرولتر من محلول التربسين 2.5٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية.
    5. قم بإعداد ثلاث ماصات باستور زجاجية برؤوس قطرها 0.5 مم و 0.75 مم و 1.0 مم باستخدام اللهب.
    6. قم بإعداد الأدوات الجراحية المناسبة: مقص كبير ، ومقصان صغيران ، وملقط كبير ، وأربعة ملاقط صغيرة ، ومشرط واحد.
    7. إعداد مجهر مجسم في غطاء محرك السيارة.
  2. باستخدام مقص كبير ، ضحي بجراء الفئران Sprague Dawley البالغة من العمر 0-3 أيام عن طريق فصل رؤوسهم عن أجسادهم في طبق بتري فارغ 60 مم (الخطوة 6.1.1). تخلص من الجثث.
  3. التقط الرأس عن طريق إمساكه من الفم بملقط كبير. قطع الجلد الذي يغطي الجمجمة بمقص صغير.
  4. باستخدام مقص نظيف ، أدخل أسفل الجمجمة (على جانب المخيخ) واقطع الجمجمة إلى اليمين وإلى اليسار لتمكين إزالتها. باستخدام ملقط صغير ، قشر الجمجمة من الدماغ.
  5. باستخدام ملقط نظيف ، افصل الدماغ عن الرأس وضعه في طبق بتري 60 مم يحتوي على 2 مل من MEM البارد (انظر الخطوة 6.1.2).
  6. باستخدام اثنين من ملاقط صغيرة ، تشريح الحصين تحت المجهر المجسم. انقل الحصين إلى الطبق المحضر مقاس 35 مم (من الخطوة 6.1.2) الذي يحتوي على MEM.
    ملاحظة: يجب تكرار الخطوات 6.3-6.6 لكل جرو.
  7. قطع الحصين إلى شرائح 1 مم تقريبا باستخدام مشرط. أضف 200 ميكرولتر من محلول التربسين (مخفف إلى تركيز نهائي قدره 0.25٪). تخلط بلطف وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية ، 5-10٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  8. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من MEM البارد (الخطوة 6.1.2) إلى الطبق لإلغاء تنشيط التربسين. انقل الأنسجة التربسينية إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1 مل من وسط اليوم الأول مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية (الخطوة 6.1.3) باستخدام ماصة باستور الزجاجية ذات القطر الأكبر (الخطوة 6.1.5).
    ملاحظة: أفضل نسبة متوسطة إلى الأنسجة (v: v) لمزيد من المعالجة للأنسجة هي 1 مل / 8 الحصين. تجنب نقل الوسط مع الأنسجة قدر الإمكان.
  9. سحن الأنسجة عن طريق تمريرها عبر أكبر ماصة زجاجية قطرها 10-15 مرة. ثم كرر هذه العملية باستخدام ماصة زجاجية ذات قطر متوسط. استمر في التثليث باستخدام أصغر ماصة قطر. تجنب الفقاعات لتقليل موت الخلايا.
  10. اترك قطع الأنسجة المتبقية تغرق لمدة 2-5 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب آخر سعة 15 مل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    ملاحظة: كثافة الخلايا المفضلة هي 200000-400000 خلية / مل. استخدم اليوم الأول المتوسط للتخفيف أو الطرد المركزي عند 470 × جم لتركيز الخلايا.
  11. بذر 100 ميكرولتر من الخلايا على كل غطاء زجاجي. أثناء البذر ، تأكد من تغطية غطاء الغطاء بالكامل بالخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5-10 ٪ CO2.
  12. في اليوم التالي ، أضف 500 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا العصبية إلى الآبار.
    ملاحظة: يتم وصف تكوين وسط نمو الخلايا العصبية في جدول المواد.
  13. انقل كل غطاء برفق إلى البئر المناسب له باستخدام ملقط أثناء إزالة وسيط اليوم الأول عن طريق إمالة شريحة الغطاء. شفط الوسائط المتبقية من الغطاء.
  14. احتضان في 37 درجة مئوية ، 5-10 ٪ CO2. تجنب استبدال الوسيط طوال فترة الحضانة. يمكن الحفاظ على الثقافات في ظل هذه الظروف تصل إلى 1 شهر. الشاغل الرئيسي هو الرطوبة. لذلك ، تأكد من الحفاظ على الحاضنة رطبة إلى أقصى حد.

النتائج

من أجل تحضير مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني ، تم تقسيم الهيكل العظمي المرجاني بأكمله (الشكل 1 أ) إلى شظايا 0.5-2 سم باستخدام مطرقة (الشكل 1 ب) وتنظيفها جيدا من المخلفات العضوية من خلال ثلاث خطوات (الخطوة 1 في البروتوكول) باستخدام محلول هيبوكلوريت 10٪ ، محلول 1M NaOH ، ومحلول 30٪ H 2 O2 (الشكل 1C). تم تنظيف شظايا المرجان جيدا عندما تغير لون الهيكل العظمي من البني (الشكل 1 د) إلى الأبيض (الشكل 1 ه). بعد ذلك ، تم طحن القطع النظيفة (الشكل 2 أ) باستخدام إما ملاط ومدقة (الشكل 2 ب) أو آلة طحن كهربائية (الشكل 2 ج). أسفر كلا الإجراءين عن نتائج مماثلة: خليط من الحبوب يتراوح حجمه بين 20 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (الشكل 2D-G).

تتمثل إحدى مزايا المصفوفة الحبيبية على الركائز القابلة للذوبان في أنه يمكن تعديل العديد من خصائصها الهيكلية والفيزيائية ، مما يجعلها أكثر كمية. في مصفوفة حبيبات الهيكل العظمي المرجاني هذه ، تم التلاعب باثنين من خصائص خليط الحبوب: حجم الحبوب وكثافة الحبوب. لتقليل تنوع الحجم 20 ميكرومتر - 200 ميكرومتر الناتج عن إجراء الطحن أعلاه ، تم اختيار نهج غربلة باستخدام شبكة مرشح 40 ميكرومتر. باستخدام مصافي يدوية (الشكل 3 أ - د) أو كهربائية (الشكل 3 ه) ، تم إنتاج نوعين من مخاليط الحبوب: أحدهما بحبيبات يتراوح حجمها بين 40 ميكرومتر و 200 ميكرومتر (الشكل 3 F ، H) والثاني بحجم 40 ميكرومتر أو أقل (الشكل 3G ، I). تم تحديد كثافة الحبوب التي غطت أغطية الغطاء والأطباق ببساطة عن طريق تطبيق كميات متفاوتة من الحبوب وربطها بأغطية الغطاء بالحرارة (الشكل 4C) أو على القوارير والأطباق عن طريق الجاذبية (الشكل 4H). وبهذه الطريقة ، تم إنتاج مصفوفات منخفضة (الشكل 4 D ، F ، I) وكثافات عالية (الشكل 4E ، G ، J).

يوضح الشكل 5 نتائج زراعة خلايا الحصين على أغطية مغطاة بحبيبات هيكلية مرجانية <40 ميكرومتر (10 مجم / مل). تظهر الصور المجهرية لتباين الطور أن الخلايا شكلت شبكات عصبية معقدة في غياب (الشكل 5 أ) ووجود (الشكل 5 ب) للمصفوفة. أشار تلطيخ نوى الخلية (الشكل 5C ، D) إلى أنه بعد 14 يوما من البذر ، كانت كثافة الخلية أعلى في المصفوفة منها على أغطية الغطاء غير المطلية. أظهر التلوين بالبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP2) أن شبكة عصبية وتغصنية معقدة تشكلت على المصفوفة (الشكل 5F) مقارنة بالتحكم (الشكل 5E). بالإضافة إلى ذلك ، خضعت الخلايا الدبقية التي نمت على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني المصورة باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) لتغيرات مورفولوجية كبيرة. اكتسبت مظهرا أكثر شائكة مع عمليات أطول من الخلايا الدبقية المزروعة على ركيزة التحكم ، حيث بدت أكثر استدارة وتملقا (الشكل 5G ، H).

figure-results-3323
الشكل 1: تنظيف الهيكل العظمي المرجاني. أ: الهيكل العظمي للمرجان ستيلوفورا بستيلاتا. ب: كسر شظايا الهيكل العظمي قبل التنظيف. ج: شظايا الخيار ب: بعد المعالجة بمحلول هيبوكلوريت، وهيدروكسيد الصوديوم، وبيروكسيد الهيدروجين. (د) تكبير الجزء غير النظيف الموضح في (ب). (ه) تكبير الجزء النظيف الموضح في (ج). مقياس: أ = 20 مم ؛ ب ، ج = 10 مم ؛ D ، E = 3 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4118
الشكل 2: طحن الهيكل العظمي المرجاني. (أ) شظايا الهيكل المرجاني المنظفة. (ب) الملاط والمدقة المستخدمة في الطحن اليدوي. يشير السهم الأحمر إلى الحبوب الناتجة. (ج) آلة الطحن. يشير السهم الأحمر إلى الحبوب الناتجة. د: الحبوب بعد الطحن اليدوي. ه: الحبوب بعد الطحن الميكانيكي. (و) توسيع الفقرة (د). (ز) توسيع الفقرة (ه). المقياس: أ = 15 مم ؛ D ، E = 3 مم ؛ F ، G = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4945
الشكل 3: التحكم في حجم الحبوب. (أ-د) إجراء الإجهاد اليدوي. (أ) استخدام مصفاة 40 ميكرومتر. (ب) مصفاة ذات حبيبات أرضية غير مصفاة توضع في أنبوب سعة 50 مل وتصفى باستخدام دوامة. (ج) حبيبات مصفاة <40 ميكرومتر في قاع الأنبوب سعة 50 mL. (د) حبيبات ذات حجم صغير مماثل لحجم الشبكة (>40 ميكرومتر ، سهم أصفر). (ه) مصفاة ميكانيكية تستخدم لتصفية حبيبات <40 ميكرومتر من خليط من الحبوب بحجم 20 ميكرومتر - 200 ميكرومتر. (F) عرض أحجام الحبوب المتنوعة بعد الطحن قبل الإجهاد. (ز) عرض الحبوب المصفاة <40 ميكرومتر. (ح) توسيع (F). (ط) توسيع الفقرة (ز). مقياس: F ، G = 900 ميكرومتر ؛ H ، I = 300 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6034
الشكل 4: التحكم في كثافة المصفوفة. (أ) أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع حبيبات <40 ميكرومتر مخففة إلى 10 مجم / مل مع DDW لأغطية الأغطية ، PDL للأطباق الأخرى. (ب) غطاء زجاجي بمحلول 40 ميكرولتر من محلول 10 ملغم/مل. (C) أغطية مع 40 ميكرولتر من محلول 10 مجم / مل تجف على صفيحة ساخنة مسخنة مسبقا إلى 80 درجة مئوية ، مما يمكن الحبوب من الالتصاق بغطاء الغطاء. (د) غطاء مغلف بتركيز حبيبات 5 ملغم / مل بعد تبخر DDW. (ه) غطاء مغلف بتركيز حبيبات 10 ملغم / مل بعد تبخر DDW. (و) توسيع الفقرة (د). (ز) توسيع الفقرة (ه). (H) محلول 10 ملغم/مل في دورق T-25، صفيحة 60 مم. (ط) دورق مغلف بحبيبات بتركيز 5 ملغم / مل. (ي) دورق مغلف بحبيبات بتركيز 10 ملغم/مل. مقياس: ب ، د ، ه ، ط ، ي = 3 مم ؛ F ، G = 600 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7229
الشكل 5: زراعة الخلايا العصبية الحصينية على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني. تظهر الصور خلايا مستخرجة من الحصين الجرذ الجرذ البالغ من العمر 0-3 أيام نمت في الثقافة لمدة 14 يوما وملطخة ب GFAP (الخلايا الحمراء والدبقية) ، MAP2 (الأخضر ، الأورام العصبية والتغصنات) ، DAPI (الأزرق ، نوى الخلية). (أ) صورة تباين الطور للخلايا في حالة عدم وجود المصفوفة. ب: صورة تباين الطور للخلايا المزروعة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني. ج: الخلايا المزروعة بدون مصفوفة ملطخة ب DAPI. د: خلايا نمت على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني الملطخة ب DAPI. ه: الخلايا التي نمت في غياب المصفوفة ملطخة ب MAP2 . (F) الخلايا المزروعة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني الملطخة ل MAP2 . (ز) الخلايا المزروعة بدون مصفوفة ملطخة ب GFAP. (H) الخلايا المزروعة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني الملطخة ب GFAP. (I) صورة مدمجة ل (C) و (E) و (G). (ي) صورة مدمجة ل (د) ، (و) ، (ح). مقياس = 40 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

تصف التقنية المعروضة هنا طريقة لتحسين صيانة الخلايا العصبية ووظائفها في الثقافة. يتم تحقيق ذلك من خلال لصق الخلايا بمصفوفة مصنوعة من حبيبات الهيكل العظمي المرجاني التي تغذي الخلايا وتعزز نموها ونشاطها. استخدام هذه التقنية يزيد من قدرة نموذج الثقافة العصبية على تقليد بيئة الخلايا في الدماغ.

إن إدخال المصفوفة كركيزة استزراع له العديد من المزايا مقارنة بالركائز الأخرى المستخدمة في طرق زراعة الخلايا العصبية الكلاسيكية. أولا ، يزيد من التصاق الخلايا. مزيج من الهيكل العظمي المرجاني و PDL يولد التصاق أقوى من الزجاج و PDL (غير معروض). وقد ثبت أن هذه الزيادة في الالتصاق ضرورية لبقاء الخلايا غير العائمة الملتصقة في الثقافة32. ثانيا ، تعد بلورات الكالسيوم الغازية لحبيبات الهيكل العظمي المرجاني مصدرا لأيونات الكالسيوم التي تمتصها الخلايا بالفعل. من المحتمل جدا أن يكون هذا هو سبب المتانة المحسنة وزيادة الكثافة (الشكل 5C ، D) للخلايا العصبية المعروضة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني ، مقارنة بمستوى بقائها في غيابها26.

تكمن الميزة الثالثة في حقيقة أن مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني هي في الواقع غير مستوية ، على عكس الغطاء الزجاجي. الحبوب هي 3D منظم مع بنية سطح منحنية معقدة. تختلف هذه الخصائص الهيكلية عند اعتبار أن الخلايا تواجه مجموعات الحبوب ذات الأشكال والأبعاد والكثافات المختلفة. تحاكي هذه المادة المستنبتة الخشنة وغير المستوية بيئة الخلايا في الجسم الحي بشكل أفضل من الغطاء المسطح الكلاسيكي. في الواقع ، لقد أظهرنا أن خشونة وحجم وشكل الهيكل العظمي المرجاني يؤثر على توزيع الخلايا وبقائها ونشاطها8،26،29.

علاوة على ذلك ، فإن التكوين ثلاثي الأبعاد الذي توفره مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني للخلايا كبيئة دقيقة يختلف اختلافا كبيرا عن مصفوفات الهيدروجيل التقليدية المستخدمة للنمو ثلاثي الأبعاد في المختبر. عند استخدام الهلاميات المائية ، مثل الكولاجين وحمض الهيالورونيك ، يتم تضمين الخلايا داخل الجل23. يشبه الجل المصفوفة خارج الخلية من حيث ملء الفراغ والصلابة والسمات الأخرى ، ولكن نظرا لزوجة المواد الهلامية ، تتطلب هذه الثقافات أنظمة تغذية معقدة من أجل الحفاظ على تغذية الخلايا جيدا21,22. على النقيض من ذلك ، فإن حبيبات 3D الهيكلية المرجانية تمكن الخلايا من احتلال سطحها ، وهو مفتوح تماما لوسط الاستزراع. علاوة على ذلك ، على عكس مزارع الهيدروجيل ، تتم مراقبة الخلايا الموجودة على مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني بسهولة من خلال الفحص المجهري الطوري والفلوري.

هذه التقنية لها العديد من القيود. على الرغم من المزايا المذكورة أعلاه ، فإن الهيكل العظمي المرجاني هو مادة حيوية ولا يمكن تصنيعه ولكن يتم جمعه من الشعاب المرجانية الميتة ، مما يتسبب في قيود في إمدادات المصفوفة ، على الرغم من أن بعضها متاح تجاريا. كما أن استخدام الهياكل العظمية لأنواع مرجانية متعددة قد يؤدي إلى اختلافات في خواص الاستزراع. من ناحية أخرى ، فإن حقيقة أن بلورات الهيكل العظمي المرجاني كلها مصنوعة من مادة واحدة ، أراغونيت ، وأنه يمكن التحكم في حجم الحبوب ، يزيل معظم التنوع الكيميائي والهيكلي بين المصفوفات. حبيبات جميع المواد الحيوية التي تم اختبارها كبيرة بما يكفي لإجبار الخلايا على النمو ثلاثي الأبعاد. تتسلق الخلايا على الحبوب8 ، وتنمو عن طريق الالتصاق بأطراف البلورات33 وتتقاطع بين الحبوب27. بدلا من ذلك ، فإن الأراغونيت الجيولوجي ، المصنوع من الرواسب الأحفورية وكربونات الكالسيوم الاصطناعية ، متاح تجاريا ويمكن استخدامه كمصفوفة. ومع ذلك ، قد يظهر التصاق أقل بأغطية الغطاء الزجاجي.

في ضوء استخدام أنواع مرجانية متعددة ، من المهم ملاحظة أن بعض الدراسات أظهرت أدلة على التمعدن الحيوي للشعاب المرجانية ، مما قد يؤدي إلى وجود رواسب عضوية متنوعة بين بلورات كربونات الكالسيوم. لا يمكن إزالتها باستخدام عملية التنظيف الموضحة في هذا البروتوكول33,34. هذه الحقيقة ذات أهمية حاسمة أثناء تحديد مادة حيوية للتطبيقات البيولوجية. في حالة هذه الدراسة ، تم تنفيذ عدة خطوات مسبقا لضمان أكبر قدر ممكن من تجانس السقالة. أولا ، تم اختبار ثلاثة أنواع من الشعاب المرجانية للمصفوفات: بوريتس لوتيا ، ستيلوفورا بيستيلاتا ، وتراشيفيليا جيوفروي. لم تكن هناك تغييرات كبيرة من حيث نمو وبقاء الخلايا العصبية على هذه الهياكل العظمية المرجانية. قد تشير هذه النتيجة إلى أن الرواسب العضوية المختلفة داخل الهيكل العظمي ليس لها تأثير كبير في هذه الحالة. ثانيا ، أظهر التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه للهيكل المرجاني النظيف عدم وجود بقايا عضوية29.

هناك بعض الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول التي ينبغي أخذها في الاعتبار. أولا ، أثناء غربلة الحبوب يدويا ، يوصى باستبدال المصفاة من وقت لآخر ، حيث تميل المصافي إلى الانسداد. تستخدم المصفاة الكهربائية قوة أكبر أثناء الغربلة. وبالتالي ، فإنه لا يميل إلى الانسداد بسهولة. ثانيا ، أثناء تشتيت خليط حبيبات المرجان PDL على الأطباق وأغطية الأغطية ، من المهم أن تمتص الخليط بشكل متكرر لتجنب غرق الحبوب. سيضمن ذلك تشتتا متجانسا للمحلول. من المهم الانتباه إلى عملية ربط الحبوب بأغطية الغطاء. قد تتسبب درجات حرارة التسخين غير الصحيحة أثناء التصاق الحبوب بالغطاء الزجاجي والاهتزازات وعوامل أخرى في فصل الحبوب قبل أو بعد بذر الخلية. يوصى بحل هذه المشكلة عن طريق التحكم بعناية في درجة الحرارة وتقليل الاهتزازات. علاوة على ذلك ، يفضل إجراء التجارب في وقت محدد بعد طلاء القوارير والأطباق. نوصي بطلاء الأطباق الطازجة قبل يوم من الثقافة. يمكن أن تؤدي الحضانة المطولة للأطباق مع خليط الحبوب PDL إلى تنوع في كمية الحبوب المرفقة بالطبق.

بعض التعديلات على التقنية الموضحة أعلاه ممكنة وفقا لاحتياجات الخلايا المستزرعة. بالإضافة إلى قدرتها على تحسين نمو الخلايا العصبية في الثقافة ، تدعم مصفوفات الهيكل العظمي المرجاني نمو الخلايا العظمية30,31 وخلايا الكبد وخلايا عضلة القلب (بيانات غير منشورة). لزيادة متانة الثقافة لأنواع الخلايا الأخرى ، يوصى بالتحقق من أقوى تفاعل خلوي للهياكل العظمية لأنواع الشعاب المرجانية المختلفة ، بالإضافة إلى تحسين حجم وكثافة الحبوب.

من الممكن أيضا زراعة الخلايا العصبية مباشرة على الحبوب ، دون طلاء إضافي. ومع ذلك ، فإن الطلاء المسبق للحبوب باستخدام PDL ، كما هو مذكور في هذا البروتوكول (الخطوة 5) يحسن بشكل كبير من التصاق الخلايا العصبية وبقائها ، فوق المستويات التي تم الحصول عليها باستخدام الزجاج المطلي ب PDL. من الممكن أيضا استخدام مواد طلاء أخرى وفقا لتفضيل أنواع الخلايا المختلفة.

تجدر الإشارة إلى أن حجم الحبوب في المصفوفة محدود. فوق عتبة معينة ، حوالي 200 ميكرومتر ، يصبح من الصعب ربطها بأغطية الزجاج. لذلك ، فإن خشونة سطح المصفوفة لها نطاق محدود. التجارب التي تتطلب حبيبات أكبر أو قطع من الهيكل العظمي ليست مناسبة لهذه التقنية. قد يجد المرء طريقة بديلة لربط الحبوب الكبيرة ، ربما باستخدام المواد اللاصقة أو المواد الهلامية ، ولكن هذا قد يحجب اتصال الخلية بالحبوب. الاحتمال الآخر هو زراعة الخلايا مباشرة على الهيكل العظمي ، دون طحن. تتطلب هذه الطريقة تعديل إجراء بذر الخلايا24,27. يساهم الهيكل ثلاثي الأبعاد للهيكل العظمي المرجاني غير الأرضي في بقاء الخلايا العصبية ، كما ذكرنا من قبل26. ومع ذلك ، فإن مثل هذه المصفوفة المعقدة والكثيفة تجعل عمل الفحص المجهري صعبا. يحافظ الإعداد المخترق للهيكل العظمي الأرضي على الخواص الكيميائية للهيكل العظمي ، ويتيح التحليل المجهري 2D ، وبسبب الحجم الكبير للحبوب ، يجبر الخلايا على النمو في 3D8.

علاوة على ذلك ، قد يكون فائض حبيبات الهيكل العظمي المرجاني ساما. كما ذكر أعلاه ، يتم امتصاص مكون الكالسيوم في مصفوفة الهيكل العظمي المرجاني من قبل الخلايا35. قد يكون فائض الكالسيوم الناجم عن ارتفاع كثافة الحبوب عبئا أو حتى مثبطا لبعض أنواع الخلايا ، كما في حالة الخلايا العصبية36. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى تقليل كثافة الحبوب وتحسينها لكل نوع من أنواع الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تتذكر أن توافر الهيكل العظمي المرجاني قد يكون محدودا. تنمو الشعاب المرجانية ببطء في أحواض السمك وفي بيئتها الطبيعية. ويزداد توقف نموها نتيجة للاحترار العالمي وتحمض المحيطات(37). وبالتالي ، فإن وفرة وتوافر الهياكل العظمية المرجانية محدودة.

إن تقوية الخلايا العصبية المنفصلة عند ملامستها لحبيبات الهيكل العظمي المرجاني في الثقافة يفتح آفاقا جديدة للبحث في علم الأعصاب. يمكن دراسة النمو الخلوي ، والتمديد العصبي والتشعبات ، وكذلك تكوين المشابك واللدونة المشبكية ، بكثافة معززة ومدة تجريبية طويلة.

أيضا ، يبدو أن مصفوفة المرجان تسبب زيادة في بعض الوظائف الخلوية للخلايا الدبقية ، مثل النمو والتفاعل والانتشار. لذلك من الممكن أن تزيد هذه الظروف أيضا من القدرة النجمية على إثراء وسائط الثقافة العصبية المنفصلة بعوامل غذائية مفرزة ، وهو أمر قد يكون قابلا للتطبيق على الطب التجديدي للجهاز العصبي المركزي.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج KAMIN التابع لوزارة التجارة والعمل الإسرائيلية ومن قبل شركة Qrons Inc. ، 777 Brickell Avenue Miami ، FL 33131 ، الولايات المتحدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesGreiner#60-662160
B-27Gibco#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma#A4503
D – glucoseSigma#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)Sigma#D5796
Electrical sieveAri Levy#3700
Fetal Bovine Serun (FBS)Biological Industries#04-007-1A
First Day Medium85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
FlasksGreiner#60-69016025cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridineSigma#F0503
Glass CoverslipsMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19Hazardous
Ham's F-12 Nutrient MixtureSigma#N4888
HANK'S solutionSigma#H6648
Kynurenic acidSigma#K3375
L - glutamineSigma#G7513
Manual strainer (40µm)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)Sigma#M2279
Mortar and pestleDe-Groot4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite)Sigma#425044Hazardous
NaOHSigma#S8045Hazardous
Neuronal Growth Medium45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dishGreiner#60-628160, #60-62716060mm, 35mm, respectively.
Poly D – LysineSigma#P7280
Smart Dentin GrinderKometaBio#GR101
TrypsinGibco#15-090-046
UridineSigma#U3750

References

  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved