إثراء الخلايا المنوية والبطفومنات من اختبار الماوس باستخدام معدات المختبرات القياسية

يقدم هنا بروتوكول لإثراء الخلايا المنوية البشيتين، الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية ممدود من الخصيتين الماوس الكبار باستخدام التدرج كثافة الزلال المصل البقري متقطع مع معدات المختبر القياسية.

لتوصيف كل خطوة من خطوات تكوين الحيوانات المنوية، يجب على الباحثين فصل التجمعات الفرعية المختلفة للخلايا الجرثومية عن الخصيتين. ومع ذلك، عزل مجموعات منفصلة أمر صعب، لأن الخصية الكبار يحتوي على مزيج معقد من الخلايا الجرثومية من جميع خطوات تكوين الحيوانات المنوية جنبا إلى جنب مع مجموعات معينة من الخلايا الجسدية. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطبيق تقنيات مختلفة مثل تمرة الطرد المركزي، وفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، وSTA-PUT بنجاح لعزل الخلايا الجرثومية. والعيب هو أنها جميعا تتطلب أجهزة مخصصة والتدريب المتخصص. وفقا للمبادئ التي تقوم عليها طريقة STA-PUT، تم وضع بروتوكول بسيط لعزل الخلايا المنوية البشيكيتين، والحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية ممدود من الخصيتين الماوس. بعد إعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا الخصية، يتم إثراء مجموعات خلايا محددة عن طريق ترسيب الجاذبية من خلال تدرج كثافة الزلال المصل البقري المستمر (BSA). ثم يتم جمع كسور الخلية يدويا وتحليلها مجهريًا. ويمكن تطبيق هذا التدرج الكثافة المعدلة لبروتوكول ترسب الحيوانات المنوية المستديرة (MDR) على نطاق واسع، لأنه لا يتطلب سوى معدات مختبرية قياسية. وعلاوة على ذلك، يتطلب البروتوكول الحد الأدنى من مواد البدء، مما يقلل من تكلفته واستخدام الحيوانات المختبرية.

لا يزال الكثير غير معروف عن الأحداث الجزيئية والبيولوجية التي تحدث خلال تكوين الحيوانات المنوية الثدييات، وهي عملية معقدة تتحول فيها الخلايا الجذعية المنوية إلى الحيوانات المنوية المتخصصة للغاية^1،2. يحدث تكوين الحيوانات المنوية داخل الأنابيب المنوية للالخصية. تحتوي الأنابيب على خليط من الخلايا الجرثومية من كل خطوة من خطوات التمايز، بما في ذلك الخلايا الجذعية المنوية، وتقسيم الحيوانات المنوية من الناحية الميتوتيكية، والحيوانات المنوية الميوسيتية، والحيوانات المنوية postmeiotic (التي تخضع للتمايز الهابلويد من الجولة الحيوانات المنوية إلى الحيوانات المنوية ممدود، وأخيرا إلى الحيوانات المنوية ناضجة). وتشمل الخلايا الجسدية للالخصية الخلايا السرتولية التي تختلط مع الخلايا الجرثومية داخل الأنابيب شبه الصنوبرية، والخلايا المائية حول الأنابيب التي تشكل جدران الأنابيب، وخلايا Leydig المنتجة لهرمون تستوستيرون في الفضاء الخلالي بين الأنابيب.

دراسة العمليات الجزيئية والكيميائية الحيوية أثناء تكوين الحيوانات المنوية غالبا ً ما يتطلب فصل مجموعات الخلايا الجرثومية المتميزة عن خليط معقد من خلايا الخصية. وقد وضعت العديد من الاستراتيجيات المختلفة لإثراء الخلايا. الأساليب الأكثر نجاحا هي STA-PUT سرعة الترسيب بواسطة وحدة الجاذبية^3،4،5،6،الطرد المركزي elutriation على أساس الطرد المركزي المضادة^{للتدفق 7،8،} وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) الذي يفصل الخلايا وفقًا لمحتوى الحمض النووي و/أو علامات محددة. وتستخدم هذه الأساليب عادة بين الباحثين الحيوانات المنوية وتسمح لإثراء فعال لأنواع محددة من الخلايا الجرثومية. ومع ذلك، فإن الحد من هذه التقنيات هو أنها تتطلب معدات متخصصة ومكلفة تتطلب الخبرة.

يقدم هنا بروتوكول بسيط وغير مكلفة لعزل السكان المخصب من ثلاثة مجموعات الخلايا الأكثر وفرة من الخصيتين الماوس: الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية pachytene، والحيوانات المنوية ممدود. ويشار إلى هذا البروتوكول باسم تدرج الكثافة المعدلة للنطافة المستديرة (MDR)، لأنه يعمل بشكل جيد بشكل خاص لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة. وتستند طريقة MDR إلى نفس المبادئ التي تستند إليها الترسيب السريع STA-PUT، ومع ذلك فهي لا تتطلب سوى معدات مختبر ية قياسية. يسمح للخلايا الحية بالرواسب من خلال تدرج كثافة الزلال المصل البقري (BSA) المعد يدويًا داخل أنبوب قياسي بمساحة 50 مل تحت مجال الجاذبية في الأرض. تتحرك الخلايا الأكبر بشكل أسرع من خلال التدرج، الذي يفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا الجرثومية. بعد الترسيب، يتم جمع الكسور المخصب من أنواع الخلايا الثلاثة يدوياً. ونقاء هذه التجمعات من الخلايا الغنية مماثل لتلك التي حصلت عليها STA-PUT وelutriation الطرد المركزي.

وبالإضافة إلى تغطية بناء واستخدام تدرج BSA للترسب السريع، يصف البروتوكول أيضًا طريقة الهضم لإطلاق خلايا الخصية من الأنابيب شبه الصنوبرية. تم تعديل البروتوكول من تلك التي وضعتها Romrell وآخرون^{وآخرون 9} ويشمل الهضم المتسلسل مع الكولاجين الرابع وتريبسين. وقد ثبت الهضم المتسلسل جنبا إلى جنب مع استخدام العازلة بيكربونات (أي حل كريبس) لتعزيز كبير في فصل وصلاحية الخلايا الجرثومية⁹.

أثناء إثراء MDR، تنفق الخلايا حوالي 4 ساعة معًا خارج بيئة الأنابيب شبه الصنوبرية ولا تخضع للقوى الميكانيكية المجهدة، مما يسمح بجمع كسور خلوية قابلة للحياة للغاية لتحليل المصب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بروتوكول MDR، على غرار التلهون الطرد المركزي وSTA-PUT، لا يتطلب أي معالجة كيميائية أو وسم للخلايا، مما يساعد أيضاً على الحفاظ على صلاحيتها. الأهم من ذلك، أقل قدر اثنين من الخصيتين الماوس الكبار كافية لعزل MDR، وبالتالي، يوفر ماوس واحد الكبار ما يكفي من الخلايا المخصبلكل من الحمض النووي الريبي وتحليل البروتين. معيار STA-PUT بروتوكول يوصي باستخدام ما يصل إلى 12 الفئران الكبار لعزل الخلية⁶; على الرغم من أنه، استناداً إلى الخبرة السابقة، فمن المعروف أن العزلة الناجحة يمكن أن يتم من ثلاثة إلى أربعة فئران بالغة. أقل كمية من المواد الأولية التي أبلغ عن أنها كافية لelutriation الطرد المركزي هو ستة الخصية الماوس (ثلاثة فئران)⁸. ولذلك، وإلى جانب القضاء على الحاجة إلى معدات متخصصة باهظة الثمن، فإن بروتوكول MDR يقلل من عدد الحيوانات المختبرية المطلوبة.

وقد أجريت صيانة فئران المختبرات وجميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. المعدات والكاشف الإعداد

1. تعيين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية.
2. تعيين حاضنة ثقافة الخلية إلى 34 درجة مئوية، 5٪ CO_2،95٪ الرطوبة. وضع الدوار أنبوب داخل الحاضنة.
   ملاحظة: الحاضنات تتطلب وقتا طويلا لتغيير درجة الحرارة الداخلية. إذا كانت الحاضنة التي تم تعيينها باستمرار عند درجة حرارة 34 درجة مئوية غير متوفرة، قم بإعداد واحد قبل يوم واحد من التجربة.
3. إعداد وتسمية الكمية المناسبة من الشرائح الزجاجية المجهرية. رسم حلقة من ~ 1 سم في القطر مع قلم الشحوم والسماح للالشحوم الجافة.
4. إعداد 1X كريبس العازلة، pH 7.8(الجدول 1). ضع أنبوبين مخروطيين بـ 50 مل من 1x كريبس إلى 34 درجة مئوية إلى درجة حرارة مسبقة للخطوات 2.5−2.8. تخزين بقية كريبس 1X في 4 درجة مئوية أو على الجليد.
5. إعداد حلول BSA. أولا إعداد 25 مل من 10٪ (ث / الخامس) BSA الحل في كريبس عن طريق حل 2.5 غرام من BSA في 1X كريبس العازلة إلى حجم نهائي من 25 مل. تمييع محلول BSA 10٪ مع 1X كريبس العازلة للحصول على تركيزات BSA مختلفة(الجدول 2). حافظ على جميع حلول BSA عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: إعداد الحلول في نفس اليوم من الإجراء وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. إعداد إنزيمات الهضم عن طريق وزن الكمية الصحيحة من التربسين والكولاجين إلى 50 مل أنابيب مخروطية(الجدول 3).

2. تشريح الحيوان وإعداد تعليق الخلايا الجرثومية

ملاحظة: هذا يستغرق ما يقرب من 1 ساعة لإكمال.

1. التضحية بفأر ذكر بالغ (عمره 7 أسابيع أو أكثر، ووزن الخصية 80-120 ملغ اعتماداً على الإجهاد والعمر) عن طريق خلع عنق الرحم أو خنق_ثاني أكسيد الكربون 2.
2. رش البطن البطني للماوس مع الإيثانول 70٪. فتح تجويف abdominopelvic باستخدام مقص، مما يجعل فتح على شكل V.
3. سحب على وسادة الدهون البربخ مع ملقط، وتحديد موقع الخصيتين وإزالتها مع مقص. تجنب إزعاج التونيكا البوجينيا. ضع الخصيتي على طبق بيتري 6 سم يحتوي على 1x كريبس.
4. قم بإزالة الخصيتين وتجاهل البوجينيا التونيكا. تفريق قليلا الأنابيب seminiferous عن طريق إغاظة بلطف لهم بصرف النظر مع ملقط.
5. استخدام ملقط لنقل الأنابيب شبه الصنوبرية في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 2 مل من محلول الكولاجين الطازجة(الجدول 3).
6. احتضان الأنابيب في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   ملاحظة: يجب أن تحدث الأنابيب العائمة بحرية في غضون 3 دقائق بسبب إزالة الخلايا الخلالية. درجة الحرارة الفسيولوجية لخلايا الخصية هي 34 درجة مئوية. لذلك، عادة ما يتم الهضم طويلة في هذه درجة الحرارة. ومع ذلك، يمكن إجراء عملية الهضم القصيرة 3 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية (درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة). لاحظ أنه إذا تم استخدام 34 درجة مئوية، يجب إعادة تحسين وقت الهضم.
7. إضافة ما لا يقل عن 40 مل من كريبس 1X الدافئة والسماح للأنابيب إلى الرواسب (~ 1 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة supernatant وكرر 1X.
8. أضف 25 مل من محلول التربسين المعد حديثًا(الجدول 3)،ضع الأنبوب على الدوار الأنبوبي داخل حاضنة 34 درجة مئوية، واحتضنلمدة 15-20 دقيقة (~15 دورة في الدقيقة). تحقق بشكل متقطع من حالة الأنابيب. بمجرد أن يصبح الحل غائما وأجزاء صغيرة فقط من الأنابيب تبقى، وضع الأنبوب على الجليد والمضي قدما على الفور إلى الخطوة التالية.
   ملاحظة: لتجنب عسر الهضم وليونة الخلية، انتقل بسرعة إلى خطوات الغسيل التالية. وتشمل بعض البروتوكولات تعطيل التربسين عن طريق مصل البقر الجنيني (FBS). في هذا البروتوكول، يتم حذف العلاج FBS، وبدلا من ذلك، تتم إزالة التربسين عن طريق الطرد المركزي الفوري والغابات اللاحقة مع كريبس الباردة 1X كريبس.
9. تصفية الحل من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 50 مل على الجليد.
10. الطرد المركزي 600 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية لبيليه الخلايا.
    ملاحظة: الطرد المركزي مع قوة قوية جدا قد تضر الخلايا.
11. إزالة supernatant عن طريق صب بعناية بها.
12. اضغط على بيليه الخلية لإعادة تعليق الخلايا في ما تبقى من كريبس 1X.
13. إضافة ما لا يقل عن 40 مل من الباردة 1X كريبس إلى الخلايا التي تم تعليقها.
14. كرر الخطوتين 2.10 و 2.11.
15. اضغط على الأنبوب مع بيليه الخلية لإعادة تعليق الخلايا. إضافة 1 مل من 0.5٪ BSA في 1X كريبس ومع طرف ماصة قطع إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب الحل صعودا وهبوطا. تجنب صنع فقاعات.
16. وأخيراً، أضف 1-3 مل من 0.5% BSA في 1x كريبس بحيث يكون الحجم النهائي حوالي 3 مل. قم بتفريغ تعليق الخلايا الجرثومية من خلال مصفاة خلية بـ 40 ميكرومتر، ثم انتقل على الفور إلى تحميل الخلايا على تدرج BSA.

3. فصل الخلايا الجرثومية من خلال التدرج BSA متقطعة

ملاحظة: يستغرق هذا القسم حوالي 2 ساعة لإكمال. ابدأ في إعداد تدرج BSA غير المستمر أثناء خطوات الغسيل (الخطوات 2.10−2.14) لتحميل الخلايا بمجرد أن تكون المعالجة المسبقة جاهزة.

1. استيعاب أنبوب 50 مل عموديا على الجليد بحيث أنه من الممكن أن نرى جانب واحد من الأنبوب. بدلا من ذلك، تشغيل البروتوكول في غرفة باردة في 4 درجة مئوية، وفي هذه الحالة لا حاجة إلى الجليد.
2. قطع طرف ماصة مصلية سعة 10 مل حوالي 5-10 مم من الطرف للحصول على فتحة أكبر(الشكل 1A)،وقم بتركيبها على وحدة تحكم الماصة(الشكل 1C).
   ملاحظة: وهذا سوف يقلل من سرعة أثناء الأنابيب، مما يسهل التراص من حلول BSA مختلفة. بدلا من ذلك، استخدم ماصة ميكانيكية 1 مل مع مكبس أملس وقطع نصائح ماصة مع فتحة من حوالي 3 ملم في القطر(الشكل 1B).
3. تبدأ من الأنابيب 5 مل من 5٪ BSA الحل إلى الجزء السفلي من أنبوب 50 مل.
4. ببطء pipet 5 مل من 4٪ BSA الحل على رأس الحل 5٪. ابدأ بلمس سطح الحل بنسبة 5% برفق مع طرف الماصة وطبقة الحلين مع الحفاظ بعناية على الاتصال بالسطح، مما يضمن عدم السماح لطرف الأنابيب بأن يصبح مغمورًا.
   ملاحظة: يجب أن يكون خط واضح مرئي بين الطبقتين في نهاية هذه الخطوة.
5. كرر الخطوة 3.4 مع حلول BSA الأخرى الحصول على تدرج متقطع من 5٪ تصل إلى 1٪(الشكل 1D).
6. قم بتحميل نظام التعليق أحادي الخلية بعناية فوق التدرج دون إزعاج. السماح للخلايا الرواسب من خلال التدرج لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجة مئوية أو على الجليد.

4. جمع كسور الخلايا الجرثومية المخصب

ملاحظة: يستغرق هذا القسم حوالي 30 دقيقة لإكمال.

1. جبل 1 مل تلميح ماصة على ماصة ميكانيكية 1 مل وقطع غيض بحيث الفتحة هو ~ 3 ملم في القطر(الشكل 1B).
2. جمع بعناية ~ 1 الكسور مل في أنابيب منفصلة 1.5 مل، بدءا من الجزء العلوي من التدرج BSA، وتخزينها على الجليد. عدد الأنابيب في نفس الترتيب كما سيتم جمع الكسور.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يكون هناك سلسلة من أنابيب ~ 28 التي تحتوي على تعليق الخلية. استخدام ماصة ميكانيكية 1 مل مع مكبس على نحو سلس وقطع نصائح ماصة للحد من خطر إزعاج التدرج BSA.
3. طرد مركزي كسور الخلايا الجرثومية في 600 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية.
4. الحرص على عدم إزعاج بيليه، وتجاهل معظم supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق النقر على الأنبوب. إضافة 1 مل من الجليد الباردة 1X كريبس العازلة إلى كل أنبوب وتكرار الطرد المركزي.
   ملاحظة: كرر خطوة الغسيل إذا تداخل BSA مع تحليل المصب.
5. تخلص من معظم الـ supernatant ولكن اترك حوالي 100 ميكرولتر بعد الغسيل النهائي. إعادة تعليق بيليه الخلية بعناية.
   ملاحظة: إعادة تعليق الخلايا بعناية يضمن أن العينة المأخوذة من هذا الحل تمثل كافة خلايا الكسر المحدد. الحفاظ على تعليق الخلية على الجليد أثناء إعداد الشرائح.

5. تحليل كسور الخلايا

ملاحظة: التحليل يستغرق 2 ساعة لإكمال.

1. واحد في كل مرة، pipet 20 €L من 4٪ paraformaldehyde (PFA) داخل كل حلقة القلم الشحوم على شريحة مجهرية مرقمة.
2. على الفور إضافة 2 درجة مئوية من تعليق الخلية المعاد تعليقها من الكسر المقابل. كرر لكل كسر.
   ملاحظة: أثناء إعداد الشرائح، والحفاظ على جميع تعليق الخلية على الجليد.
3. تجفيف الشرائح في RT لمدة 1 ساعة إلى ليلة وضحاها (O / N).
   ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، بعد أخذ عينة من كل كسر، يمكن معالجة الخلايا للتحليلات النهائية أو التخزين (القسم 6).
4. شطف الشرائح مرة واحدة مع 1X PBS وجبل مع تصاعد المتوسطة مع 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI)(جدول المواد).
5. تحليل الشرائح تحت المجهر الفلوري لتقدير أي نوع معين من الخلايا الجرثومية المخصب في كل كسر.
   ملاحظة: يمكن التعرف على أنواع الخلايا المختلفة من خلال مورفولوجيا النووية المميزة التي تصورها تلطيخ DAPI. الشكل 2 يظهر الكسور التمثيلية المخصب في الحيوانات المنوية ممدود، الحيوانات المنوية المستديرة والحيوانات المنوية pachytene. النواة المنوية المستديرة صغيرة (6-7 ميكرومتر في القطر) ومستديرة(الشكل 2ألف). كما تتميز النوى المنوية جولة الماوس من قبل واحد، جولة هيكل heterochromatin يسمى الكروموسنتر. النوى من الحيوانات المنوية ممدود لها شكل ممدود نموذجي ة حجم نووي منخفض بسبب التكثيف الكروماتين(الشكل 2A). النوى الحيوانات المنوية Pachytene هي أكبر بكثير (قطرأكثر من 10 ميكرومتر) وأكثر غير منتظمة في الشكل، مع مناطق من الكروماتين معبأة بكثافة موزعة في جميع أنحاء(الشكل 2A).
6. إذا لزم الأمر، قم بتلطيخ المناعة بالإضافة إلى تلطيخ DAPI لدعم التعرف على أنواع الخلايا المختلفة.
   1. في هذه الحالة، انتشار 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 20 ميكرولتر من محلول تحديد (4٪ PFA و 0.1٪ السطحي غير الأيونية في PBS) داخل حلقة القلم الشحوم. بعد تجفيف الشرائح، postfix الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة في RT.
   2. شطف مع PBS، ثم permeabilize مع 0.1٪ السطحي غير الأيونية في PBS لمدة 5 دقائق شطف مع PBS وتعطيل أي PFA المتبقية عن طريق احتضان الشرائح في 100 mM NH₄Cl لمدة 5 دقائق.
   3. شطف مع PBS والمضي قدما إلى بروتوكول الفلورة المناعية القياسية التي تتكون من حجب والحضانة مع الأجسام المضادة الأولية محددة والأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية. جبل الشرائح مع جبل antifade مع DAPI(جدول المواد)والسماح لهم لتعيين لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: أمثلة على علامات مفيدة لحاضنات الأجسام المضادة الأولية تشمل agglutinin الفول السوداني (السلطة الوطنية الفلسطينية؛ 1:2000 في حل حظر) أن البقع acrosome في الحيوانات المنوية جولة وممدود، المضادة لDDX4 الأجسام المضادة (1:200 في حل حظر) أن تسميات واحدة حبيبات السيتوبلازمية في الحيوانات المنوية المستديرة، والأجسام المضادة للγH2AX (1:100 في حل حظر) التي تعترف الهيئات الجنسية في الحيوانات المنوية pachytene. انظر النتائج التمثيلية والشكل 2C,D للاطلاع على أمثلة لتحليل الفلورة المناعية للكسور.

6. معالجة العينات المتبقية للتخزين

ملاحظة: القسم 6 يستغرق حوالي 20 دقيقة لإكمال.

1. بمجرد أخذ عينة من كل كسر لشريحة الفحص المجهري، أضف 1 مل من الكريب 1x الباردة على الجليد إلى كل كسر وطارد الجهر بالخلايا لأسفل عند 600−13,000 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: يؤدي الطرد المركزي منخفض السرعة إلى بيليه فضفاض، مما يجعل من الصعب إزالة 1X كريبس تماما، في حين أن الطرد المركزي عالي السرعة قد يضر الخلايا. اختيار سرعة الطرد المركزي وفقا لمتطلبات محددة من بروتوكول المصب.
2. إزالة وتجاهل supernatant والاستمرار في تحليل المصب المفضل.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن تكون الخلايا المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -70 درجة مئوية. مرة واحدة مألوفة مع هذه التقنية، فمن الممكن الاستمرار في بروتوكول المصب من تفضيل مباشرة، ولكن من المستحسن دائما أن تأخذ عينة وضمان نقاء كل كسر. يمكن استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي، وتحديده كمياً، وتحليله بطرق مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (PCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا إعداد مستخلصات البروتين الإجمالية التي يمكن من خلالها إجراء الترسيب المناعي أو تحليل النشاف الغربي(الشكل 3).

عادة ما يعتبر الإثراء الكافي لنوع الخلية الجرثومية أكثر من 80٪⁶. يعمل بروتوكول MDR بشكل جيد بشكل خاص لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة. يمكن الحصول على عدد كبير من الحيوانات المنوية المستديرة النقية بنسبة 70% بشكل روتيني باستخدام هذه التقنية. يتم إثراء الكسور المثلى من الخلايا المنوية البشيكيتين والحيوانات المنوية ممدود إلى ~ 75٪ و ~ 80٪، على التوالي. تميل الحيوانات المنوية الممدودإلى البقاء على قمة التدرج ويتم جمعها مع الكسر الأول. في المثال المبين، يحتوي الكسر 1 على حوالي 80% من الحيوانات المنوية الممتدة(الشكل 2B). معظم الحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها مع هذه التقنية قد مكثف النوى، في حين أن الحيوانات المنوية استطالة في وقت مبكر دون مكثف نادرة(الشكل 2A). تحتوي الكسور التالية على الحيوانات المنوية المستديرة المخصبة. في المثال، كان إثراء الحيوانات المنوية المستديرة أكثر من 90٪ في الكسور 2 و 3 و 4، وشوهد الإثراء فوق 80٪ تماما في سبعة كسور (2-8)(الشكل 2B). بسبب حجمها الكبير، البشيتاتات البشيتات الرواسب أسرع ويتم جمعها مشاركة. وفي مثال التنقية، كان التخصيب حوالي 75 في المائة في الكسور 14 و 15(الشكل 2باء).

في حين أن المورفولوجيا النووية، التي تصورها تلطيخ DAPI، عادة ما يكفي للاعتراف بالخلايا، يمكن إجراء تحليل الفلورة المناعية لدعم التحليل. تلطخ السلطة الوطنية الفلسطينية الأوكروسومات النامية للنطافة المستديرة والممتدة، ويمكن استغلال المظهر الأكروسوللي لزيادة تصنيف الحيوانات المنوية المستديرة في الخطوات 1-8 من التمايز¹⁰. التمييز بين السلطة الوطنية الفلسطينية ملطخة ممدود وجولة الحيوانات المنوية يعتمد على الاختلافات في شكلها النووي(الشكل 2C،لوحة اليسار). الأجسام المضادة لDDX4 هو علامة مفيدة للكسور الحيوانات المنوية جولة لأنه يصور واحد واحد DDX4 إيجابية الحبيبية حول النووية، والجسم الكروماتويد (CB)، في السيتوبلازم من كل الحيوانات المنوية جولة. هذا تلطيخ CB محددة من السهل التمييز من تلطيخ السيتوبلازمية الموزعة على نطاق أوسع في الحيوانات المنوية(الشكل 2C،لوحة الأوسط). يمكن التعرف على الحيوانات المنوية Pachytene من قبل الأجسام المضادة للγH2AX التي تصف الجسم الجنسي النووي التي تظهر على وجه التحديد في مرحلة pachytene من القسم meiotic الأول(الشكل 2C،لوحة الحق). في هذه التنقية، كشفت السلطة الوطنية الفلسطينية تلطيخ أن MDR المخصب أجزاء الحيوانات المنوية جولة تحتوي على خليط من الحيوانات المنوية جولة في خطوات مختلفة من التمايز، وكلها تحتوي على هيكل التوقيع، وDDX4 إيجابية CB(الشكل 2D، RS كسر). المضادة لγH2AX مزيد من التحقق من صحة الحيوانات المنوية البشيكيتين الإثراء في جزء 16(الشكل 2D،كسر PSPC).

كشف عد الخلايا أن عدد الخلايا في الكسور الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية المستديرة كافية لمختلف التحليلات المصب. تحتوي الكسور المنوية المستديرة (5-8) على حوالي 2.5 × 10⁶ خلايا. لذلك، عن طريق تجميع هذه الكسور، فمن الممكن الحصول على أكثر من 10 مليون خلية. عادة ما تحتوي كسور الحيوانات المنوية البشيكيتين (14 و 15) على خلايا أقل إلى حد ما. في هذه العزلة، تم حساب حوالي 1.5−2.0 × 10⁶ 6 خلية لكل كسر. الكسر الأول يحتوي 0.75 × 10⁶ الحيوانات المنوية ممدود.

وكما هو مبين في الشكل 3ألف،تراوح إجمالي كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من غالبية الكسور بين 0.5 و2.5 ميكروغرام، وهو ما يكفي لتحليل الحمض النووي الريبي في المصب مثل PCR النسخ العكسي، أو تسلسل الحمض النووي الريبي، أو تصور الحمض النووي الريبي على هلام. تتراوح كمية البروتين التي يتم الحصول عليها من كل كسر عادة من 20-140 ميكروغرام(الشكل 3B)،وهو ما يكفي لعدة بقع غربية. تم إعداد lysates الخلية بأكملها من الكسور التي تم جمعها، وتم إجراء تحليل وصمة عار الغربية باستخدام الأجسام المضادة الكشف عن DDX4، PIWIL1، وPIWIL2، والتي يتم التعبير عنها جميعا بشكل كبير في الحيوانات المنوية pachytene والحيوانات المنوية المستديرة، فضلا عن في كل مكان وأعرب غليسيرالدهايد 3-الفوسفات dehydrogenase (GAPDH).

في هذا البروتوكول، كان 10٪ من lysates البروتين المستمدة من كسور واحدة كافية للكشف بوضوح عن جميع هذه البروتينات على إعداد وصمة عار الغربية القياسية(الشكل 3C). كما تبين أن كمية البروتين في جزء واحد كافية لهطول الأمطار المناعية باستخدام جسم مضاد ضد PIWIL1، وكذلك للكشف عن PIWIL2 المناعة المشتركة(الشكل 3D). وعلاوة على ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للحصول على كسور المخصب من الحيوانات المنوية pachytene والحيوانات المنوية المستديرة من السيطرة والفئران المعدلة وراثيا لتطبيقات المصب مثل النسخ العكسي الكمي PCR¹¹ وارتفاع الإنتاجية تسلسل RNA¹².

الشكل 1: إعداد تدرج متقطع لـ BSA. (أ)طرف ماصة مصلية بقوة 5 مل لإعداد التدرج. (ب)طرف ماصة 1 مل لإعداد التدرج وجمع كسور الخلايا الجرثومية بعد الترسيب. (ج)المعدات اللازمة لإعداد التدرج. (D)عرض جانبي لتدرج كثافة BSA المتقطع من 5٪ (أسفل) إلى 1٪ (أعلى) BSA الحل؛ حلول BSA 2٪ و 4٪ هي زرقاء اللون للحصول على تصور أفضل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الصور التمثيلية لكسور الخلايا التي تم جمعها وتحليل التخصيب. (أ)خلايا الخصية الملطخة DAPI. يظهر الصف العلوي خلايا الخصية في ظهارة seminiferous سليمة من قسم الخصية المثبتة PFA، البارافين جزءا جزءا لا يتجزأ (يسار) أو في تعليق (يمين). يظهر الصف السفلي كسورًا من الحيوانات المنوية المُثرة (ES)، أو الحيوانات المنوية المستديرة (RS)، أو الخلايا المنوية البشيكية (PSpc). أشرطة مقياس = 20 ميكرومتر للصف العلوي و 10 ميكرومتر لinsets من الصف السفلي. (ب)التحديد الكمي النسبي لأنواع الخلايا الجرثومية المختلفة في كل كسر. تم حساب الخلايا يدويا باستخدام برنامج ImageJ وتصنيفها في RS، ES، PSPC، خلايا Sertoli، وخلايا أخرى. تتم الإشارة إلى أرقام الكسور والنسب المئوية لكل من BSA في التدرج على المحور س. (ج)تحليل الفلورة المناعية لخلايا الخصية. اللوحة اليسرى: بقع السلطة الوطنية الفلسطينية التي تحمل علامة رودامين في كل من ES (السهم الأصفر) وRS (السهم الأبيض). اللوحة الوسطى: يلطّخ الأجسام المضادة DDX4 حبيبات واحدة حول النووية في جمهورية صربسكا، والتي من السهل تمييزها عن إشارة السيتوبلازمية الأكثر انتشاراً في الخلايا المنوية (السهم الأزرق). لم يتم الكشف عن إشارة DDX4 في ES (السهم البرتقالي). اللوحة اليمنى: يتعرف الجسم المضاد γH2AX على جسم الجنس النووي المميز الموجود فقط في الخلايا المنوية البشيكية (الخلايا السلبية γH2AX التي تتميز بعلامة نجمية بيضاء). تم وضع علامة على قضبان المقياس = 10 ميكرومتر(D)تم وضع علامة على كسور الخلايا الغنية بـ MDR مع السلطة الوطنية الفلسطينية (كسر RS) وAnti-DDX4 (RS fraction) وanti-γH2AX (كسر PSPC) لمزيد من التحقق من صحة إثراء الخلايا في كل كسر. قضبان مقياس = 10 درجة.

الشكل 3: التحليلات النهائية بعد إثراء خلايا MDR. (أ)تم استخراج الحمض النووي الريبي من كل كسر بعد إثراء خلية MDR ممثل وكميا. تتم الإشارة إلى أرقام الكسور والنسب المئوية لكل من BSA في التدرج على المحور س. (B)تم استخراج البروتينات من كل كسر عن طريق lysing بيليه الخلية في اختبار الاشعاعالمناعي (RIPA) العازلة ثم كميا. (C)تم إعداد مقتطفات بروتين الخلية الكاملة وتحليلها من قبل النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ضد DDX4، PIWIL1، PIWIL2، وGAPDH. تم تحميل 10٪ من lysate من كل كسر المشار إليه. (د)تم إجراء الترسيب المناعي من الكسور المشار إليها باستخدام المضادة لPIWIL1 تليها النشاف الغربية مع الأجسام المضادة لPIWIL1 والمضادة للPIWIL2. وتشمل عينة الإدخال خليطا من lysates البروتين من كسور مختلفة، والتحكم المناعي (IP) باستخدام أرنب IgG كان أيضا تنفيذ من lysate مختلطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التمثيل التخطيطي لبروتوكول MDR والوقت اللازم لإكمال كل خطوة. تتكون المواد الابتدائية من اثنين من الخصيتين من فأر بالغ. يشار إلى متوسط عدد الخلايا وكمية الحمض النووي الريبي والبروتين التي تم الحصول عليها من كسر واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: إعداد المخزن المؤقت كريبس.

الجدول 2: إعداد حلول جيش صرب البوسنة.

الجدول 3: إعداد إنزيمات الهضم.

يقدم هنا بروتوكول بسيط وغير مكلف لعزل السكان المخصب من الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية البشيكية، والحيوانات المنوية ممدود باستخدام معدات المختبر القياسية (نظرة عامة على البروتوكول المبين في الشكل 4). على الرغم من عدم الحاجة إلى الخبرة أو الآلات باهظة الثمن، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب النظر فيها أثناء هضم الأنسجة، وبناء التدرج، وتحميل تعليق الخلية على التدرج.

يتم تحرير الخلايا الجرثومية من الأنابيب شبه الصنوبرية من قبل اثنين من الهضم الأنزيمي على التوالي. أول الهضم مع الكولاجين الرابع يفصل الأنابيب شبه الصنوبرية عن طريق إزالة الخلايا الخلالية. قد يؤدي وقت الهضم لفترات طويلة إلى تلف الأنابيب ويؤدي إلى فقدان الحيوانات المنوية، كما لو تم إطلاقها من الأنابيب خلال هذه الخطوة) سيتم التخلص منها في الخطوات التالية. خطوة الهضم الثانية مع التربسين تطلق الخلايا الجرثومية من الأنابيب شبه الصنوبرية. قد يكون هناك تحليل الخلايا في بعض الأحيان وعادة ما تشكل بعض كتل بسبب الحمض النووي الجينومي المفرج عنه. لا ينصح تجاوز المدة المقترحة أو درجة حرارة الهضم، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى ضعف الجدوى، وزيادة اللداء الخلوي، وتكتل. إذا حدث تكتل خفيف، يمكن تجاهل الكتل. ومع ذلك، في حالات التكتل كبيرة وفقدان الخلايا، ينبغي تقليل وقت الهضم التربسين أو التركيز. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن النشاط الأنزيمي للتريبسين قد تختلف بين دفعات وخلال فترات طويلة من التخزين. كمية DNase الأول أثناء هضم التربسين يمكن أيضا زيادة لإزالة كتل الزائدة، ولكن هذا ينبغي أن يعتبر حلا ثانويا. من المهم الحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة في نهاية مرحلة ما قبل المعالجة، لأن الخلايا الكتلية سوف الرواسب أسرع، وتلوث الكسور وتعطيل التدرج.

قد يتطلب إنشاء التدرج بعض الممارسة. إذا كان هناك عدم الراحة باستخدام طرف ماصة 5 مل مع وحدة تحكم ماصة، فمن المستحسن استخدام ماصة ميكانيكية عادية 1 مل مع مكبس أملس على نحو سلس ثم قطع نصائح ماصة إلى فتحة من ~ 3 ملم في القطر(الشكل 1B). ومن شأن توسيع الفتحة والتحميل السلس لحلول BSA أن يقلل من خطر خلط التدرج. عند إعدادها بشكل صحيح، فمن الممكن أن نرى الحدود بين حلول BSA المجاورة بسبب مؤشرات الانكسار المختلفة. وينبغي أن ينتج التدرج مباشرة قبل الاستخدام. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن أي اهتزاز صغير أو اهتزاز قد يزعج التدرج، لذلك ينبغي تعيين التدرج في بيئة لا يزعجها.

يجب أن يتم تحميل تعليق الخلية على التدرج بعناية فائقة. بعد التحميل، يجب أن يبقى تعليق الخلية على رأس التدرج، والتي تبدأ الخلايا ببطء إلى الرواسب من خلال الطبقة الأولى. إذا شوهدت مجموعات كبيرة من الخلايا تتحرك بسرعة من خلال التدرج، فمن المرجح أن الخلايا لم يتم إعادة تعليقها بعناية أو هناك تكتل زائد. إذا كانت الخلايا لا تبقى على الجزء العلوي من التدرج BSA متقطع عند التحميل ولكن تغرق على الفور بين طبقات BSA 1٪ و 2٪ (الخطوة 3.6)، تعليق الخلية من المرجح أن تكون كثيفة جدا. وقد تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام اختبارين لمواس بالغ (80-120 ملغ/تسيس) كمادة بداية؛ على الرغم من أنه تم تنفيذ عمليات العزل الناجحة باستخدام كميات أقل من مواد البداية. وللارتقّيّر البروتوكول والحصول على خلايا جرثومية أكثر إثراءً من أعداد أعلى من الخصيتين، ينبغي إدخال المزيد من أنابيب 50 مل مع التدرج.

تم تطوير البروتوكول في البداية وتحسينه لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة من الخصيتين الفأرة الكبار، ومن المتوقع أن يكون نقاء الكسور المنوية المستديرة أكثر من 90٪. بالإضافة إلى الكسور المنوية المستديرة النقية للغاية، تم الحصول على نتائج مرضية لإثراء الخلايا المنوية البشيكية والحيوانات المنوية الممتدة. وتجدر الإشارة إلى أن كريات الدم الحمراء قد تلوث الكسور المنوية التي تمد، وينبغي اتخاذ مزيد من الخطوات للقضاء عليها إذا كان من المتوقع أن يتداخل وجودها مع التحليلات النهائية. لم نتمكن من إثراء أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا المابية أو الخلايا المتوسطة المبكرة (قبل مرحلة البشيكيتين) من الفئران البالغة باستخدام بروتوكول MDR.

بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الترسيب STA-PUT بنجاح للحصول على كسور غنية من الحيوانات المنوية أو الصرع، اللبتوتين، والحيوانات المنوية zygotene باستخدام الخصيتين الأحداث التي تم جمعها في نقاط زمنية معينة بعد الولادة¹³. يستفيد هذا النهج من ظهور هذه الأنواع من الخلايا خلال الموجة الأولى من تكوين الحيوانات المنوية. ومن المرجح أن يطبق نفس النهج على إثراء جمهورية إيران رَّابرالالديمقراطية، ولكنه لم يجر اختباره بعد من الناحية العملية. طريقة أخرى هي خيار جيد لتنقية الخلايا المابيوتيكية وmeiotic في مراحل محددة من التمايز هو FACS، الذي لديه ميزة هامة للسماح لعزل أنواع خلايا محددة على أساس وجود علامات محددة^{14 ،15،16،17}.

وعموماً، فإن ترسب سرعة MDR هو طريقة مفيدة لإثراء الخلايا الجرثومية. وفي حين أن هذه الطريقة ليست متفوقة على الأساليب الراسخة الأخرى من حيث نقاء أو كمية الخلايا المخصبة، فإن مزاياها الواضحة هي بساطتها وانخفاض تكاليف الإعداد. هذا، جنبا إلى جنب مع كمية منخفضة من المواد الأولية المطلوبة، وجعل هذا البروتوكول خيارا كبيرا للباحثين في مجال تكوين الحيوانات المنوية وأولئك في مجالات أخرى الذين قد لا ترغب في الاستثمار في الأجهزة المتخصصة أو مجموعات كبيرة من الحيوانات.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كوتاجا على إسهاماتهم أثناء وضع البروتوكول، والاستخدام والاختبار الفعالين للبروتوكول في مشاريعهم البحثية. ونحن نقدر على وجه الخصوص مساهمة يان ليندستروم للمساعدة في تحسين البروتوكول. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم أكاديمية فنلندا، ومؤسسة سيغريد جوسليوس، وبرنامج توركو للدكتوراه في الطب الجزيئي.