الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

The two most reliable methods of identifying radiation-induced inter-chromosomal stable aberrations are multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH), which allows the painting of two or more chromosomes simultaneously, and spectral karyotyping (SKY), which imparts a distinct color to each homologous chromosome pair in the genome. Unlike unstable aberrations, stable aberrations are persistent in nature and may be propagated for several generations in irradiated populations¹, and are regarded as critical molecular "signatures" of radiation-induced cytogenetic lesions². Studies by various groups have shown that stable aberrations are associated with the pathogenesis and development of a number of diseases, including cancer³. Before the era of chromosome painting (also referred as molecular cytogenetics), the conventional G-banding technique was the only method for detecting stable chromosomal aberrations. However, chromosome banding is a challenge to cytogeneticists because the resolution is limited, reproducibility is uncertain, it is a labor-intensive procedure, and it requires highly skilled and experienced cytogeneticists for reliable data interpretation⁴. Moreover, the classic banding technique does not allow detection of complex chromosomal rearrangements, which involve the interaction of three or more breaks distributed among two or more chromosomes, a common outcome of radiation damage. Complex aberrations may persist in individuals many years after radiation exposure, making them useful for retrospective biodosimetry⁵. Therefore, an alternate approach was required to overcome the limitations of conventional banding techniques to detect stable chromosomal rearrangements.

In the late 1960s, the pioneering work of Gall and Pardue (1969) on molecular hybridization using nucleic acid probes labeled with radioactive material commenced a new era in the field of cytogenetics, which allowed detection of a specific DNA sequence on chromosomes⁶. However, the use of radioactive probes for molecular hybridization had several drawbacks: radioactive probes are relatively unstable, probe activity depends on radioactive decay of the isotope used, hybridization takes a longer time, the resolution is limited, the probes are relatively costly, and the radioactive materials are a health hazardous. Thus, it became necessary to develop and design non-radioactive probes. The introduction of fluorescent tagged nucleic acid probes in the 1980s and 1990s overcame the limitations of radioactive probes and greatly enhanced the safety, sensitivity, and specificity of the hybridization technique^7-10. Fluorescent probes give rise to extremely bright signals when observed under fluorescence microscopes equipped with the appropriate excitation and emission filters. Any loss, gain, or rearrangement of fluorescent labeled chromosome/s or a part of the chromosome is easily identifiable with this FISH technique.

Analysis of chromosomal aberrations by FISH painting has led to marked progress in cytogenetic research over the years. Designing fluorescent labeled probes for specific applications ranging from locus-specific probes to whole-chromosome painting probes has advanced the field significantly; this has also facilitated the detection of submicroscopic ("cryptic") rearrangement, which was not possible by conventional chromosome banding. Chromosome painting by mFISH and SKY have proven to be valuable tools for the identification of simple and complex inter-chromosomal rearrangements. The basic principles for both techniques are similar, but the method of detection and discrimination of fluorescent signal after in situ hybridization and the process of image acquisition are different. In mFISH, separate images of each of the four fluorochromes are captured by using narrow bandpass microscope filters; dedicated software is then used to combine the images. While in SKY, image acquirement is based on a combination of epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging, and Fourier spectroscopy, which allows the measurement of the entire emission spectrum with a single exposure at all image points. In both mFISH and SKY, monochrome images are captured independently, then merged, and finally, unique pseudo-colors are assigned to the chromosomes in monochromatic images based on the specific dye attached to each fluorochrome probe.

The contribution of mFISH and SKY analysis in the radiation biology field is remarkable, particularly for retrospective dose estimation of human exposure to IR (radiation biodosimetry)^11-14, radiation carcinogenesis risk assessment¹⁵, as well as detection and risk estimation of radiotherapy-related secondary cancer¹⁶. A recent study on mice has shown that a FISH-based chromosome painting technique is also an important tool for evaluating the efficacy of radiation countermeasure¹⁷. In the present study, the effect of total body radiation exposure on the induction of stable chromosomal aberrations in the bone marrow cells of mice has been demonstrated using mFISH and SKY techniques.

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقا صارم مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة أركنساس للعلوم الطبية. تم إيواء جميع الحيوانات تحت منشأة الحيوان القياسية مكيفة الهواء في 20 ± 2 درجة مئوية مع 10-15 دورات ساعة من الهواء النقي وحرية الوصول إلى المواد الغذائية القوارض القياسية والمياه. ولدى وصوله، عقدت الفئران في الحجر الصحي لمدة 1 أسبوع، وقدم شهادة طعام القوارض.

التعرض 1.Radiation وفي فيفو اعتقال خلايا الطورية

1. الفئران فضح برنامج الأمم المتحدة للتخدير إلى 2 غراي إشعاع كامل الجسم في غرفة التشعيع. خلال التشعيع والفئران مكان في الغرفة عقد جيد التهوية للتأكد من أنها لا تتحرك بحرية والحصول على جرعة موحدة.
2. ضخ 100 ميكرولتر من 0.05٪ محلول الكولشيسين (جمسحوق olchicine الذائبة في الكالسيوم والمغنيسيوم خالية PBS) البريتونى باستخدام إبرة 25 G المرفقة مع 1 مل حقنة واحدة. تجنب حقن مباشرة في أي جهاز.
3. ترك الحيوان في قفص لمدة 2 ساعة قبل الحصاد خلية نخاع العظام. مراقبة الحيوانات لأي علامات الألم أو الضيق.

2. نخاع العظم خلية الحصاد وعزل خلايا نخاع العظم وحيدات النوى التي كتبها التدرج الكثافة الطرد المركزي

1. الموت ببطء الماوس عن طريق CO ₂ الخنق.
2. رذاذ الايثانول 70٪ على ظهري وبطني الجانب.
3. جعل شق 2 سم على جلد البطن مع مقص حاد. فهم الجلد على جانبي الشق مع ملاقط حادة وسحب بلطف فتح عضلات البطن.
4. قطع كل من رجليه الخلفيتين مع مقص والمكان على الفور لهم في قبل المبردة برنامج تلفزيوني مع 4٪ FBS.
5. بعناية تنظيف جميع العضلات التي تعلق على أطرافه الخلفية مع حادة razorblade والشاش والقطن ضمادة.
6. فصل الساق من عظم الفخذ. تقليم كل من النصائح من كل العظام مع razorblade.
7. مسح محتويات نخاع العظام مع 3 مل برنامج تلفزيوني (مع 4٪ FBS) باستخدام إبرة 23 G تعلق على حقنة مل 3 وجمع المحتوى في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمرير تعليق الخلية لا يقل عن 10 مرات من خلال إبرة لجعل التعليق خلية واحدة.
8. بعناية تراكب تعليق الخلية على حجم مساو من متوسطة فصل الخلايا اللمفاوية (3 مل) من دون إزعاج واجهة بين تعليق خلية والمتوسطة فصل الخلايا اللمفاوية. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. جمع معطف الشهباء بعناية من دون إزعاج طبقات ونقل أخرى في 15 أنبوب جديد للطرد المركزي مل.

3. إعداد ينتشر خلية الطورية

1. إضافة 10 مل PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على معطف الشهباء.
2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. إزالة بعناية طاف. ثم تفريق رانه الخلية بيليه مع التنصت لطيف وإضافة 10 مل برنامج تلفزيوني.
4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية، تفريق بيليه، وإضافة 4 مل من محلول كلوريد البوتاسيوم 0.075 M منخفض التوتر قبل تحسنت. إضافة قطرة محلول منخفض التوتر قطرة مع الهز المستمر لطيف.
6. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
7. بعد العلاج ناقص التوتر، إضافة حجم مساو (4 مل) من تثبيتي (الميثانول: حمض الخليك الجليدي، 3: 1 ت / ت) في أنبوب 15 مل وتخلط بلطف بواسطة أنبوب للقلب.
8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
9. تفريق بيليه الخلية مع البزل تليها دوامة طيف لبضع ثوان، وإضافة 3 مل من تثبيتي انخفاض حل قطرة مع الهز المستمر.
10. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
11. إزالة طاف وتفتيت الخلية بيليه مع جنتلو التنصت، وإضافة 3 مل مثبت الطازجة.
12. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. تفريق بيليه الخلية مع التنصت لطيف، وإضافة جديدة 3 مل مثبت.
13. كرر الخطوة 3.12 مرتين أكثر.
14. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية. ثم إضافة 400-600 ميكرولتر تثبيتي، وتخلط جيدا مع pipetting ل.
15. إسقاط 30 ميكرولتر خلايا ثابتة على الشرائح قبل تنظيفها والرطب يميل بزاوية 45 درجة، والسماح للشرائح في الهواء الجاف تماما بين عشية وضحاها.

4. ماوس كروموسوم الطلاء بواسطة mFISH

1. كروموسوم تمسخ
   1. ضع الشريحة التي تحتوي على هوامش خلية الطورية في 2X SSC لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. يذوى الشرائح عن طريق غسل الايثانول التسلسلي لمدة 2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 80٪، و 100٪. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
   3. سخن 40 مل تمسخ الحل (70٪ الفورماميد / 2X SSجيم؛ درجة الحموضة 7.0) إلى 70 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة. تفسد الكروموسومات التي يحتضنها الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت 1 - 1.5 دقيقة.
   4. إخماد الانزلاق على الفور في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب. ثم جفف عن طريق الغسيل مع 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة. تكرار غسل الإيثانول مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة. تماما تجف الشريحة في درجة حرارة الغرفة.
2. تمسخ وتهجين دقق خليط
   1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط التحقيق الموردة من قبل الشركة المصنعة، ونقل 10 ميكرولتر من خليط التحقيق في 500 ميكرولتر المفاجئة غطاء أنبوب الطرد المركزي، وتفسد من الحضانة عند 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) في حمام مائي لمدة 7 دقائق.
   2. وضع أنبوب الطرد المركزي مع خليط التحقيق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. ضعي الخليط التحقيق التشويه والتحريف على الشريحة مع chromoso التشويه والتحريفزارة التربية والعلم.
   4. تغطية بعناية المنطقة مع 18 مم × 18 مم غطاء زجاجي زلة والقضاء على أي فقاعات الهواء مرئية عن طريق الضغط بلطف جدا زلة غطاء على الشريحة. اغلاق جميع الجوانب الأربعة من زلة غطاء مع الاسمنت والمطاط واحتضان لمدة 12 ساعة إلى 16 ساعة في الظلام عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب لتهجين.
3. آخر التهجين الغسيل وكشف
   1. إزالة بعناية الاسمنت والمطاط وانزلاق الغطاء.
   2. الشرائح مكان في SSC 0.4x قبل تحسنت في 74 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
   3. غسل الشريحة في غسل حل ثانيا (4X SSC / 0.1٪ توين 20) لمدة 2 دقيقة.
   4. ضع 20 ميكرولتر من مكافحة تتلاشى المتوسطة المتزايدة مع دابي مباين (1.5 ميكروغرام / مل)، وتغطي مع ساترة الزجاج. اضغط برفق على ساترة مع الأنسجة مختبر لإزالة فقاعات الهواء وحل تصاعد الزائد. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر.
   5. عرض الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت مزودة بمرشحات المناسبة.

5. الطيفي تنميط نووي (سكاى) من الكروموسومات ماوس

1. كروموسوم والتحقيق تمسخ
   1. يوازن الشرائح في 2X SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، دون أن تهتز.
   2. يذوى الشرائح في سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، والإيثانول بنسبة 100٪) لمدة 2 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. الهواء الجاف الشريحة لإزالة الايثانول تماما.
   3. دافئ 40 مل من محلول تمسخ (70٪ الفورماميد / 2X SSC، 7.0 درجة الحموضة) في جرة Coplin زجاج لمدة 30 دقيقة.
   4. احتضان الشريحة في حل تمسخ قبل تحسنت ل 1 إلى 1.5 دقيقة.
   5. على الفور تزج الشريحة في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 2 دقيقة لوقف عملية تمسخ، وكذلك لمنع الكروموسومات التشويه والتحريف من إعادة الصلب.
   6. يذوى الشرائح عن طريق وضعها في 80٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة ثم إلى 100٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   7. تفسد التحقيق SKY (قارورة رقم 1 التي توفرها الشركة المصنعة) في حمام مائي تعيين إلى 80 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية)لمدة 7 دقائق، ثم وضع على الفور في حمام مائي مجموعة مختلفة إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
2. مسبار التهجين
   1. إضافة 10 ميكرولتر من التحقيق SKY التشويه والتحريف على الكروموسومات التشويه والتحريف.
   2. وضع بعناية على 18 ملم × 18 ملم ساترة الزجاج على التحقيق SKY بحيث محاصرون جود فقاعات الهواء تحت ساترة.
   3. ختم حواف ساترة مع الاسمنت والمطاط.
   4. ضع الشريحة في غرفة lightproof ترطيب واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 36 ساعة.
3. الغسل بعد التهجين وكشف الإسفار
   1. إزالة الاسمنت والمطاط بعناية فائقة من دون إزعاج ساترة.
   2. ضع الشريحة في قبل تحسنت حل الغسيل السريع (0.4x SSC) عند 72 درجة مئوية (± 2 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق مع الهز المستمر. تزج الشريحة في غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان لمدة 1 دقيقة في حين تهتز.
   3. اختياري: إضافة 80 ميكرولتر من عرقلة كاشف(قارورة رقم 2 التي توفرها الشركة المصنعة) على مجال التهجين، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة ترطيب.
   4. إزالة بلطف ساترة البلاستيك وغسل الشريحة مع ما قبل تحسنت (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث لمدة 5 دقائق.
   5. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 3 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
   6. تراجع الشريحة في وعاء زجاجي Coplin يحتوي قبل حرارة (45 درجة مئوية) غسل حل ثالثا (4X SSC / 0.1٪ توين 20)، واحتضان عند 45 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز. كرر هذه الخطوة غسل 3 مرات.
   7. تطبيق 80 ميكرولتر من Cy5.5 تلطيخ كاشف (قارورة رقم 4 التي توفرها الشركة المصنعة)، وضع 24 ملم × 60 ملم ساترة البلاستيك، واحتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 40 دقيقة في غرفة ترطيب.
   8. غسل الشريحة 3 مرات مع قبل حرارة (45 درجة مئوية) حل غسل الثالث.
   9. عقد الشريحة في موقف يميل ضد منشفة ورقية لتجفيف السوائل الزائدة. إضافة 20 ميكرولتر مكافحة تتلاشى دابي كاشف (قارورة رقم 5 المقدمة من قبل الشركة المصنعة) ووضع بعناية 24 ملم × 60 ملم ساترة الزجاج دون إدخال أي فقاعات الهواء. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر ونلاحظ مع المجهر epifluorescence مجهزة لالتقاط الصور SKY.

إجمالي إشعاع الجسم يدفع العديد من الانحرافات الكروموسومية في خلايا نخاع العظام من الفئران المعرضة للإشعاع. تم تحسين البروتوكول الحالي في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من خلايا نخاع العظام بعد التعرض للإشعاع، والحصاد من خلايا نخاع العظام من رجليه الخلفيتين من الفئران المعرضة للإشعاع وعزل خلايا نخاع العظام وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج، وإعداد ينتشر خلية الطورية، وبعدها الكشف عن التشوهات الكروموسومية مستقرة الإشعاع الناجم بواسطة تقنيات mFISH وSKY. كروموسوم اللوحة باستخدام هذه التقنيات يمكن أن تستخدم لكشف وتقييم مخاطر مختلف الظروف المرضية.

ويبين الشكل 1 ينتشر خلية الطورية التمثيلية العادية والشاذة كروموسوم الماوس أزواج-1، -2، و -3. ويبين الشكل 2 تنميط نووي الطيفي من الكروموسومات الماوس الطورية العادية وغير العادية.وتشير هذه النتائج إلى أن الإشعاع المؤين يدفع بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة في الخلايا المتكاثرة الفئران نخاع العظام، والتي تتألف أساسا من الجذعية والسلف الخلايا التي هي المسؤولة عن تجديد الذات والتمايز إلى أنواع الخلايا المختلفة. وقد ثبت أن التعديلات الوراثية الخلوية في الخلايا الجذعية والسلف لربط مع مختلف الأمراض السريرية، بما في ذلك السرطان، وتعتبر أن تكون أقوى تنبئ عن خطورة المرض والبقاء على قيد الحياة. ولذلك، فمن المنطقي أن نستنتج أن المؤينة مستقرة الانحرافات الناجمة عن الإشعاع بين الكروموسومات قد يسبب زيادة خطر تطور مرض السرطان.

الشكل 1: تأثير الإشعاع على الخلايا نخاع العظم من الفأر المشع كما كشفتها mFISH. A و B تظهر انتشار الماوس خلية الطورية مع أزواج طبيعية من الفصلromosome-1 (الحمراء)، كروموسوم 2 (الأخضر)، وكروموسوم 3 (أكوا). وcounterstained جميع الكروموسومات الأخرى مع دابي (الأزرق). C يدل على انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم-1، وقد تم دمج جزء من كروموسوم-1 في (دابي) كروموسوم غير رسمها، في حين أن جزءا آخر قد شكلت جزء لامركزي. يظهر D تم دمج جزء من جزء من الكروموسوم-2 في كروموسوم غير رسمها. يمثل E انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم 3. يظهر F انحراف مستقرة تضم جميع الكروموسومات ثلاثة رسمها. يشار إلى نقاط لكسر الارسال وتقاطعات اللون عن طريق الأسهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير الإشعاع على العظام مارخلايا آه من المشع ماوس كما كشفتها SKY. تظهر لوحة العليا لتنميط نووي الطيفي العادي (سكاى) من C57BL / 6 الماوس الإناث. تظهر لوحة المتوسطة انحراف مستقرة تنطوي على كروموسوم-4 و كروموسوم 12. وتظهر اللوحة السفلى الماوس تنميط نووي الطيفي مع انحراف الكروموسومات مستقرة تنطوي على كروموسوم 7 وكروموسوم 10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العديد من الخطوات الهامة التي تحدد نجاح mFISH وSKY. الخطوة الأولى والأكثر أهمية هو لتحسين معاملة الكولشيسين في الجسم الحي اعتقال الإنقسامية من الخلايا وحيدة النواة نخاع العظام. تركيز الكولشيسين والعلاج الوقت بمفرده أو بالتنسيق تحديد مؤشر الإنقسامية وكذلك كروموسوم التكثيف اثنين من أهم الشروط الأساسية لوحة كروموسوم فعالة. وتركيز عال الكولشيسين أو أطول وقت العلاج يؤدي إلى الكروموسومات مكثفة للغاية، والتي تتنافى لتمسخ السليم والتهجين. وعلاوة على ذلك، وتحديد دقيق لإعادة ترتيب معقدة في خلية الطورية مع انتشار الصبغيات المختصرة ليست مهمة سهلة لتحقيقه. إدارة داخل الصفاق من 100 ميكرولتر 0.05٪ الكولشيسين لمدة 2 ساعة في الفأر مع وزن الجسم بين 22 و 26 ز تنتج عدد كاف من الخلايا الطورية ينتشر مع الكروموسومات مكثفة باعتدال. الخطوة الثانية الحاسمة هي العلاج ناقص التوتر.وحدة التخزين، وقت العلاج، ودرجة حرارة ناقص التوتر الحل تأثير كروموسوم التشكل وانتشار الصبغيات على شريحة زجاجية. علاج ناقص التوتر لفترة زمنية أقصر أو في درجة حرارة دون المستوى الأمثل يمكن أن يمنع الكروموسوم المناسب الانتشار، مما أدى إلى خلية الطورية مع انتشار الصبغيات المتراكبة. كروموسوم تداخل يتداخل مع المصب في عملية التهجين الموقع، خصوصية إشارات الفلورسنت، وتحديد السليم لإعادة ترتيب.

وثالثا، تثبيت بعد ناقص التوتر هو خطوة هامة لتجنب تشكيل خلية أجمة. وينبغي أن يضاف تثبيتي ببطء أسفل الجانب من أنبوب الطرد المركزي مع ثابت لطيف تهتز للحصول على تعليق خلية واحدة. خلاف ذلك، سوف ينتشر خلية الطورية تصبح المحاصرين في كتل وستتعرض للخطر كروموسوم ينتشر. ومع ذلك، كروموسوم نشر يعتمد أيضا على نوع من الخلايا، ودرجة الحرارة، والرطوبة النسبية في رIME إسقاط تعليق الخلية على الشرائح الزجاجية. وأفادت دراسة سابقة أجراها Spurbeck أن لالخلايا الليمفاوية، والرطوبة النسبية 60٪ و 20 درجة مئوية درجة حرارة نتيجة في أعلى منطقة الطورية ^18. وبالإضافة إلى ذلك، ومدة التجفيف هو أيضا خطوة حاسمة لينتشر كروموسوم الأمثل. تنتشر الخلايا الطورية أن يجف بسرعة كبيرة جدا تنتج هوامش ضيقة مع العديد من الكروموسومات متداخلة، في حين أن النتائج تجفيف بطيئة جدا في الطورية كسر الكروموسومات ^18. ومع ذلك، أظهرت دنغ أن كروموسوم نشر في المقام الأول يعتمد على الرطوبة النسبية لمجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة ^19. في خطوة هامة الرابعة هي لتحسين كروموسوم الوقت تمسخ. وقتا أطول وأقصر تمسخ تؤثر سلبا على التحقيق التهجين. أطول تمسخ يسبب الكروموسومات "منتفخ"، في حين يعوق أقصر تمسخ التفاعل من التحقيق الى الكروموسومات. وهناك طريقة أخرى للحد من كروموسوم "الانتفاخ" هي الشرائح العمرية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة تكونخطوة تمسخ الصدارة. الشرائح لا تستخدم لطلاء كروموسوم على الفور، ويمكن تخزين إلى أجل غير مسمى في مجفف عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يحتاج الى وقت كروموسوم تمسخ لتكون موحدة مع سن الشرائح، وكمية السيتوبلازم حول ينتشر خلية الطورية، والرطوبة التي أسقطت الخلايا على الشرائح. التحقيق تمسخ وتهجين مهم لنجاح اللوحة كروموسوم أيضا. وينبغي تجنب التعرض المباشر للتحقيقات للضوء الساطع، بحيث إشارة الفلورسنت لا يفقد كثافة الإشارة.

وراسخة أن mFISH وSKY هي تقنيات قوية للكشف عن بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة. يمكن بسهولة أي إعادة ترتيب وكذلك الخسارة أو الربح من الكروموسومات رسمت تحديدها من قبل هاتين الطريقتين. ومع ذلك، والكشف عن ذراع داخل وبين الذراع التبادل الكروموسومات ليست ممكنة من هذه التقنيات. أصبحت التعرف على ذراع داخل وبين الذراع التبادل الكروموسومات الممكن الآن BECAاستخدام وتطوير، على التوالي، كروموسوم الذراع محددة تحقيقات متعدد الألوان الأسماك وmBAND تحقيقات الأسماك. وقد أظهرت دراسة سابقة على العمال نووي سابق هذا التحليل mBAND هو أداة قوية لتحديد التوقيعات فريدة من أضرار الإشعاع ^20. وعلاوة على ذلك، وتحديد تبادل chromatid الشقيقة، وهي سمة مميزة من أضرار الإشعاع ^21، ليس من الممكن عن طريق هذه التقنيات. وبالإضافة إلى ذلك، على حد سواء mFISH وSKY لها قدرة محدودة على رسم منطقة القسيم المركزي من الكروموسومات، مما قد يؤدي في التهديف الخاطئ للكروموسوم ثنائي القسيم المركزي كما النبات. التقنيات هي أيضا ليست مناسبة لتحديد توطين نقطة توقف المحدد من النبات. بالإضافة إلى ذلك، إشارات الفلورسنت لا يمكن الحفاظ عليها بشكل دائم، تنخفض كثافة إشارة مع مرور الوقت، والفلورسنت اللوحة كروموسوم غير مناسب لتحليلها من قبل نظام آلي. ومع ذلك، شدة إشارة الفلورسنت يمكن الحفاظ عليه لفترة أطول من الوقت عن طريق تخزين انزلقوفاق في الثلاجة.

وقد وضعت اثنين من أساليب محسنة من اللوحة الصبغي للتغلب على القيود المفروضة على mFISH وSKY: على التوالي، غير الفلورسنت كروموسوم اللوحة ²² و اللون الطيفي النطاقات (SCAN) ^23. وتشمل مزايا اللوحة كروموسوم غير الفلورسنت باستخدام البيروكسيديز / diaminobenzidine (DAB) على اللوحة FISH التحديد الدقيق للمنطقة القسيم المركزي، وتحديد إعادة ترتيب الكروموسومات التي كتبها المجهر مشرق الميدان، وذلك إشارة غير الفلورسنت هو الحفاظ بشكل دائم وتحليل الصور يمكن أن يكون آليا. من ناحية أخرى، فإن SCAN هو مفيد أكثر من سكاي ليتم إعداد تحقيقات SCAN من الموجات محددة تسلسل الحمض النووي الجيني لكروموسوم معين وبالتالي، يمكن أن تحدد بدقة منشأ الفرقة كروموسوم. كما يسهل SCAN تحديد المبادلات البينية الكروموسومات. النظر في فوائد تقنيات محسنة، وهذه ينبغي أن ينظر للاستخدام الروتيني طالاختبار الوراثي الخلوي ن السريري. ومع ذلك، وإعداد تحقيقات عن تسلسل الحمض النووي الجيني الموجات محددة لكل زوج الكروموسوم يمثل تحديا تقنيا ويحد من استخدامه في علم الوراثة الخلوية الجزيئية.

تحديد ما إذا كان الفرق بين مجموعات العلاج هو ذات دلالة إحصائية أم لا هو جانب هام آخر من علم الوراثة الخلوية الجزيئية. سجل المعايير، مثل عدد من الخلايا الطورية ينتشر تحصى، وعدد من الحيوانات المستخدمة في مجموعة العلاج، عدد الكروموسومات في كل خلية الطورية ينتشر خلال التحليل والتسميات المستخدمة لتصنيف الانحرافات لوحظ بعد اللوحة كروموسوم، وما إلى ذلك لعب دورا حاسما في تحديد حالة عدم اليقين الإحصائي بين مجموعات العلاج. على الرغم من المختبرات المختلفة لها معايير تسجيل الملكية، وسجل من 100-300 و 20 الطورية خلية ينتشر مع 40 الكروموسومات فصل جيدا في ما لا يقل عن 3-5 الفئران ويوصى عموما لتحديد الدلالة الإحصائية في mFISH والشرج SKYيسيس، على التوالي ^{24 و 25.} وعلاوة على ذلك، فإن اختيار التسميات المستخدمة لتصنيف الانحرافات في الكروموسومات رسمت هو معيار مهم لتقييم إحصائيا عدم اليقين. هناك نوعان من أنظمة التسميات الشعبية في استخدامها لوصف الانحرافات الكشف عنها بواسطة بأكملها تحقيقات كروموسوم اللوحة: (1) S & S طريقة التصنيف من قبل سافاج وسيمبسون ^{26 و 27} و (2) التسميات البويات تكر وآخرون. ^28. يعتمد كل نظام على متطلبات مختلفة لتصنيف التشوهات الكروموسومية الهيكلية ومزاياه وعيوبه. مؤشر S & S نظام مناسب في المقام الأول لتفسير الآلية من أصل انحراف، بينما يوفر البويات وصفا للأنماط اللوحة غير طبيعية. الدراسات التي Knehr وآخرون. على التشوهات الكروموسومية التي يسببها الإشعاع في الأسماك رسمت الكروموسومات تشير إلى أن طريقة البويات، مثل نظام S & S، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد أصل انحراف مع بعض modificatiعلى في معايير التسجيل وسيكون أكثر فائدة للتطبيق العملي ^29.

كلتا الطريقتين mFISH وSKY لها حدودها الخاصة. على سبيل المثال، يسمح mFISH التهديف السريع مع قليل من التدريب، ومع ذلك، فإنه لا يحجب كل الكروموسومات لقياس تردد انحراف ويكشف فقط جزئي تردد انحراف، وهذا يتوقف على عدد الكروموسومات رسمت المستخدمة في الدراسة. ومع ذلك، جزء من إجمالي التبادل التي لاحظها كروموسوم اللوحة كلها يمكن تقدير الصيغة المفترضة في الأصل لوكاس وآخرون. ³⁰ وكذلك تعديلها من قبل Braselmann وآخرون. ^31. وتعتبر هذه الصيغة الرياضية التبادل بين الكروموسومات رسمت وبين الكروموسومات رسمت و counterstained. على سبيل المثال، دعونا و _ص تمثل مجموع كسور من الجينوم من الكروموسومات رسمت مغطاة 1 (و ₁₎ (2)، و ₍₂₎ و 3 (و _3)، عرجإعادة و ₁ = 0.0696، و ₂ = 0.0649، وو ₃ = 0.0570، وتمثل القيم المحتوى الجيني من الكروموسومات الفردية في إناث الفئران. وبالتالي، يصبح و _ص = (و ₁ + و ₂ + و ₃₎ = 0.192 وجزء counterstained (1 - و _ص) = 0.808. يمكن بسهولة أن تحسب وتيرة التبادل التي تنطوي رسمت و counterstained الكروموسومات (F _P) من قبل المنتج عبر التوسع ذي الحدين (ع + ف) ² = ص ² + 2PQ + ف ^2، حيث ص = و _ص و q = (1 - _ع و). وهكذا، F _P = 2PQ = 2F _ص (1 - و _ص) = 0.310، وهو ما يعني 31٪ من التبادل الكروموسومات يمكن ملاحظتها بعد اللوحة كروموسوم الماوس-1، -2، و -3. لذلك، لا بد من سجل لتعادل واحد الخلايا الطورية النطاقات أو أحد الجينوم يعادل كله 1 / 0.31 = 3.23 الخلايا. وعلاوة على ذلك، على حد سواء mFISH وSKY والقدرة على specif محدودةتحديد ically الجينات التي ونقاط التوقف وتشارك في تشكيل انحراف وأيضا للكشف عن الازدواجية صغيرة، العكس، والحذف.

تطبيق mFISH وتحليل السماء لا يقتصر على البحوث الأساسية. بشكل منتظم يجري استخدامها على حد سواء في الدراسات السريرية. كما تم تطبيق هذه التقنيات لمرحلة ما قبل الولادة وبعد الولادة تشخيص وتقييم المخاطر، وتحديد أنواع مختلفة من السرطان. وعلاوة على ذلك، فإن كلا من التقنيات يمكن أن تستخدم لطلاء الكروموسومات البيني. تستخدم سوكولوفا mFISH لرسم الصبغيات البيني لأول مرة ^32. وتستخدم هذه التقنيات أيضا لتقدير الجرعة بعد التشعيع وتقييم المخاطر في البشر بعد التعرض العرضي أو المتعمد للإشعاع ^{11، 33} المؤينة. لذلك، تحليل الجينوم جزئي أو كامل من قبل mFISH أو SKY، على التوالي، هي أدوات مفيدة لكشف ما بين الكروموسومات الانحرافات مستقرة للدراسات مختلفة.

The authors declare that they have no competing financial interests.

وأيد هذه الدراسة من قبل أركنساس الفضاء منح اتحاد والمعهد القومي للبحوث الفضاء الطبية الحيوية من خلال الإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء، يمنح NNX15AK32A (RP) وRE03701 (MH-J)، وP20 GM109005 (MH-J)، وإدارة المحاربين القدامى في الولايات المتحدة ( MH-J). نشكر كريستوفر Fettes، منسق برنامج لإدارة البيئة والصحة المهنية في جامعة أركنساس للعلوم الطبية، للمساعدة التحريرية في إعداد المخطوطة.