إعادة تشكيل الأساسي الميتوزى المغازل في كروية مستحلب قطرات

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

خلال الانقسام، ويتم تنظيم الكروموسومات من الجينوم تكرارها عند خط الاستواء خلية لضمان التوزيع العادل للالصبغي الشقيقة على الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا. وتوسط المواقع كروموسوم والعزل من قبل تمسكهم ميكروتثبول المغزل القادمة من اثنين جسيم مركزي معارضة. وبالإضافة إلى ضمان توزيع كروموسوم المؤمنين، واتجاه محور الدوران الإنقسامية أيضا يملي انقسام الخلايا طائرة ^1. توجه المنسق لانقسام الخلية ضروري خلال مراحل عديدة من التنمية وللتوازن الأنسجة ^2. على وجه التحديد، يمكن أن ينظم الإنقسامية المغزل المواقع يؤدي إلى التوزيع غير المتماثل المحتويات الخلوية أو حتى تنتج الخلايا الوليدة من مختلف الأحجام ^2. يبدأ الإنقسامية الجمعية المغزل والتوجيه في الطور الأول ومدبرة من قبل تفاعل معقد بين التعاون واستعداء القوى مولدات ^3،4. تتكون القوات المتولدة من بسحب ودفع القوات أوراسكوم تليكوم القابضة. هذه القوى تنبع سواء من الاتصالات المغزل مع قشرة الخلية وكذلك من داخل المغزل، ويمكن توليدها عن طريق ديناميات أنيبيب فضلا عن المحركات الجزيئية وlinkers عبر (الشكل 1).

القوى التي تدفع يمكن أن تتولد عندما تنمو الأنابيب الدقيقة ضد المنشآت جامدة مثل قشرة الخلية. اعتمادا على مجموع قوة مقاومة المتولدة داخل النظام، وهذا يمكن أن يؤدي إلى إعادة تنظيم المغزل الإنقسامية (القوات منخفضة) أو يؤدي الى التواء أنيبيب أو كارثة (قوات عالية) ^5-8. مقدار القوة التي يمكن توليدها عن طريق دفع يعتمد على طول أنيبيب، منذ مدة هو حاسما بشكل قوي في أنيبيب-يرزح ^9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأنابيب الدقيقة التي تنشأ من جسيم مركزي واحد يدفع على الجسيم المركزي الآخر، وهو الآلية التي تم اقترح أن يقود الفصل الجسيم المركزي في أوائل الطور ^3،10.

في الإعلانdition لدفع القوى التي تولدها الأنابيب الدقيقة المتزايد، أنيبيب ينتهي اتصالات مع قشرة الخلية يمكن أن توسط أيضا سحب القوات ^11. وقد أظهرت الدراسات من مختبرات متعددة النشاط تسيطر المولدات قوة القشرية مطلوب لتحديد المواقع غير المتماثلة من مغزل الإنقسامية في الجسم الحي ^1. من الضروري لهذه التجاذبات غير مترجمة القشرة داينين ​​حشوية (يشار إليها فيما يلي باسم "داينين ​​')، على حد ناقص أنيبيب موجهة البروتين السيارات ^8،12،13. على سبيل المثال، في مهدها الخميرة، والتفاعلات الجانبية للداينين ​​القشرية مع نتيجة شعرية أنيبيب في أنيبيب التي تعتمد على محرك الانزلاق على طول القشرة ^14. ومع ذلك، التجاذبات القشرية ويمكن أيضا أن تتولد عن قدرة داينين ​​لتشكيل إرفاق ملفات نهاية إلى depolymerizing الأنابيب الدقيقة ^8. الطاقة المتولدة عن انكماش أنيبيب قد تؤدي إلى القوى التي عادة ما تكون لحجم أعلى (~ 50 السندات الإذنية (مرجع ¹⁵ )) من القوى التي تولدها البروتينات الحركية الفردية (~ 7-8 السندات الإذنية (المرجع ^16)). التعلق نهاية يوم من داينين ​​القشرية إلى الأنابيب الدقيقة depolymerizing يعزز المواقع المغزل في مهدها الخميرة ¹⁷ و C. ايليجانس ^13. سواء على حد سواء انزلاق تعتمد على المحركات وأنيبيب التحلل مدفوعة التجاذبات القشرية أن تتعاون أو لا يجتمعان في الجسم الحي هو في المجهول الحالي.

بالإضافة إلى القوى التي تدفع أنيبيب والتجاذبات القشرية بوساطة داينين، يتم التحكم المواقع الجسيم المركزي من داخل المغزل الإنقسامية من قبل العديد من البروتينات الأخرى. كينيسين 5 المحركات، وعلى سبيل المثال، كما توجد tetramers التي يمكن عبور الارتباط الأنابيب الدقيقة بين القطبين التوازي، مما أدى إلى جيل من القوات انزلاق نحو الخارج ^18-20. ويلزم أعضاء الأسرة المحرك كينيسين-5 للفصل الجسيم المركزي والجمعية المغزل القطبين في جميع حقيقيات النوى درس، باستثناء C. ايليجانس (إعادة النظر في المرجع ^21).

وعلاوة على ذلك، ومن المعروف إنتشاري linkers العرضية للأسرة / PRC1 Ase1 أيضا إلى توطين لتداخل المناطق أنيبيب من الأنابيب الدقيقة بين القطبين في المجراة في المختبر ^22-27. القوى التي تولدها التوسع مدفوعة Ase1 للتداخل أنيبيب-منطقة كبيرة بما يكفي لموازنة كينيسين 14 بوساطة القوات انزلاق في المختبر ^28،29. في الخلايا، مطلوب Ase1 / PRC1 لتشكيل مستقر للتداخل المناطق أنيبيب في midzone المغزل ^25-27،30، مما يشير إلى أن القوى التي تولدها إنتشاري linkers عبر يمكن أن يساهم إلى حد كبير في تنظيم المغزل. وأخيرا، قوات من لونين الإنقسامية وkinetochores تؤثر الجمعية المغزل الإنقسامية وتحديد المواقع من خلال مختلف مسارات ^3. وبما أن هذه العناصر ليست جزءا من المقايسات إعادة الموصوفة هنا، أنها لن تناقش بالتفصيل.

1. إعداد رقائق على microfluidics

ملاحظة: للحصول على الدراسة من أسفل إلى أعلى التجمع المغزل، وتستخدم قطرات مستحلب كروية الماء في النفط. هذه هي microdroplets المائية فصلها عن المحيط مرحلة النفط أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية والسطحي. ويتم إنتاج هذه-قطرات مستحلب ضمن ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان ميكروفلويديك (PDMS) رقائق البطاطس. التغييرات في هندستها قناة ومعدلات التدفق يمكن استخدامها لحجم لحن قطرة. في تصميم ميكروفلويديك الموصوفة هنا، يتم إنشاء قطرات التي يبلغ قطرها حوالي 15 ميكرون لتقليد الحبس هندسي من خلية الإنقسامية الثدييات.

1. الضوئية الرئيسية تصميم وتصنيع القالب
   1. تصميم الضوئية الرئيسية التي تحتوي على ثلاث قنوات مدخل ^31. مدخل قناة 1 يتصل الماء المرحلة، التي تحتوي على محتويات قطرة (انظر القسم 3 "اعادة تشكيل وزهور النجمة أنيبيب الأساسية"). مدخل قناة 2 يربط إلى مرحلة النفط (انظر القسم 2.1 "الدهون / النفط فاحد ذاته إعداد "). استخدام قناة مدخل 3 لتخفيف مستحلب قطرات مع دهن إضافية / نفط مرحلة قبل المراقبة (اختياري) (الشكل 2A-ب).
      ملاحظة: يتم اتباع جميع القنوات مدخل من الغبار تصفية (متاهة من 2 ميكرون قنوات) للغبار فخ، والجسيمات PDMS و(بروتين) وحدات العمل ولمنعهم من عرقلة قنوات ميكروفلويديك (الشكل 2D). القنوات هي 75 ميكرون واسعة ويجتمع الدهون / النفط المرحلة والمرحلة المياه في 12.5 ميكرون تقاطع واسع حيث مستحلب قطرات ستشكل (الشكل 2C).
   2. النظام والحصول على photomasks المطبوعة على ركيزة الفيلم، مع قطبية سلبية (لن الضوئية الرئيسية تكون مظلمة مع الهياكل المصممة شفافة).
2. العفن تلفيق
   1. صنع قوالب التي تدور طلاء SU-8 3025 مقاوم الضوء على رقاقة السيليكون 4 بوصة باستخدام تدور المغطي (500 دورة في الدقيقة، 10 ثانية، تليها 1800 دورة في الدقيقة، 45 ثانية) في بيئة غرفة نظيفة.
   2. فضح SU-8 المغلفةرقاقة السيليكون من خلال الضوئية الرئيسية. تطوير رقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإنشاء قنوات ~ سمك 40 ميكرون.
3. صنع رقاقة ميكروفلويديك
   1. مزيج 10 أجزاء PDMS قبل البوليمر مع جزء 1 وكيل علاج (المجموع ~ 40 غرام) في وعاء يشبه القارب باستخدام ملعقة بلاستيكية. مكان PDMS تحتوي على مثل قارب السفينة في فراغ الغرفة لمدة 30 دقيقة ~. لإزالة فقاعات الهواء. لف رقائق الألومنيوم حول القالب لتشكيل الكأس مع ~ 1 سم منتصب الحواف.
   2. صب PDMS (~ 75٪ من اجمالي حجم) في القالب، وترك في فراغ الغرفة ل~ 30 دقيقة أخرى. (لإزالة فقاعات الهواء)، وعلاج لمدة 1 ساعة على 100 درجة مئوية في الفرن.
   3. تدور معطف PDMS المتبقية على الشرائح الزجاجية (5 ثانية في 200 دورة في الدقيقة تليها 30 ثانية في 4000 دورة في الدقيقة)، يليه علاج لمدة 1 ساعة عند 100 درجة مئوية. إزالة الغبار من الشرائح الزجاجية باستخدام الهواء المضغوط / N ₂ -flow والتنظيف المسبق ليست ضرورية.
      ملاحظة: PDMS المغلفة الشرائح الزجاجية ويمكن استخدامها على حد سواء لهيئة التصنيع العسكريرقاقة rofluidic وإنتاج تدفق خلايا (انظر أيضا 2.2).
   4. الشريط برفق PDMS الخروج من العفن باستخدام شفرة حلاقة ولكمة ثقوب (0.5 مم للمداخل، 0.75 مم للمخرج) .Corona-علاج رقاقة ميكروفلويديك وشريحة الزجاج المطلي PDMS-باستخدام المفاوض سطح الاكليل مختبر لبضع ثوان .
   5. وضع رقاقة ميكروفلويديك على شريحة زجاجية (قنوات لأسفل) وخبز رقائق س / ن عند 100 درجة مئوية (الشكل 3A). تخزين رقائق ميكروفلويديك لعدة أشهر في بيئة خالية من الغبار.

2. إعداد ميكروفلويديك

ملاحظة: الماء في الزيت يتم إنشاء قطرات مستحلب باستخدام الإعداد على microfluidics ورقائق ميكروفلويديك هو موضح أعلاه. يمكن أن تختلف تركيبة الدهون / النفط المرحلة اعتمادا على متطلبات التجريبية. والدهون-بالفاعلات النفط تشكيل أحادي الطبقة على واجهة النفط المياه مع هم القطبية الجماعات رئيس تواجه المياه داخل. من أجل استهداف البروتينات(على سبيل المثال داينين) إلى حدود قطرة، (biotinyl-PE) الدهون يمكن إضافة كميات قليلة من biotinyl-فسفاتيديل إيثانولامين. وهذا يسمح للتوظيف داينين ​​البيروكسيديز (انظر القسم 4.1 "داينين ​​استهداف القشرة قطرة") عن طريق multimerization بوساطة streptavidin. واستقرت قطرات بإضافة السطحي وتخزينها في خلايا تدفق PDMS المغلفة.

1. الدهون / النفط مرحلة التحضير
   1. مزيج حل الكلوروفورم 1،2-dioleoyl- sn- glycero-3-الفوسفات-L-سيرين (DOPS) والدهون biotinyl-PE في نسبة 4: 1 الرحى في أنبوب زجاجي باستخدام pipets الزجاج (شطف على نطاق واسع pipets مع الكلوروفورم قبل استعمال). إعداد ما مجموعه تقريبا 250 ميكروغرام الدهون، مما أدى إلى تركيز الدهون من ~ 0.5 ملغ / مل.
   2. بعناية يجف الخليط الدهون مع N ₂ -flow وبعد ذلك في فراغ الغرفة ل~ 1 ساعة. حل الدهون المجففة في الزيوت المعدنية و 2.5٪ السطحي إلى 0.5 ملغ / مل (جعل ~ 500 ميكرولتر).
   3. ضع عينة الدهون / النفط فيحمام بالموجات فوق الصوتية ويصوتن لمدة 30 دقيقة. في 40 كيلوهرتز إلى حل تماما الدهون.
2. إعداد تدفق الخلية
   1. PDMS تدور معطف (انظر أيضا القسم 1.3) على النظارات الغطاء (5 ثانية في 200 دورة في الدقيقة تليها 30 ثانية في 4000 دورة في الدقيقة) والشرائح الزجاجية (5 ثانية في 100 دورة في الدقيقة تليها 30 ثانية 1500 دورة في الدقيقة) من أجل لإيداع طبقة متجانسة من PDMS.
      ملاحظة: للحصول على جودة التصوير المثلى، للتأكد من استخدام النظارات غطاء بسماكة يطابق الهدف المجهر. في هذه الحالة: 1.5 (~ 0.17 مم).
   2. علاج المغلفة PDMS نظارات الغطاء والشرائح الزجاجية لمدة 1 ساعة على 100 درجة مئوية في الفرن. جعل تدفق الخلايا عن طريق تباعد عن كثب (~ 2 مم) شرائح رقيقة من فيلم الختم مختبر (~ 3 ملم في العرض) على الزجاج الشرائح المغلفة PDMS. عند تخزينها في بيئة خالية من الغبار، والقنوات التي لم يتم استخدامها يمكن استخدامها في أوقات أخرى.
   3. تغطية تدفق الخلايا مع ساترة المغلفة PDMS وختم بصهر ختم مختبر فيلم ~ 1 دقيقة. في 100 درجة مئوية، اضغطبلطف (الشكل 3C). إغلاق فيلم الختم المختبر من الزجاج-الحدود مع Valap (الشكل 3C). متجر تدفق الخلايا لعدة أشهر في بيئة خالية من الغبار.
3. إعداد كأس PDMS
   1. للتصوير على المدى الطويل، وجعل كوب PDMS، من خلال اللكم حفرة قطرها 4 مم في شريحة من PDMS (~ 3 مم)
   2. كورونا-علاج شريحة PDMS والزجاج غطاء PDMS المغلفة ووضعها على رأس كل منهما الآخر. خبز كوب PDMS س / ن (100 درجة مئوية) (الشكل 5A).
4. مستحلب قطرات تشكيل
   1. مراقبة تشكيل قطرات على مجهر حقل مشرق مقلوب. ربط وحدة تحكم الضغط على رقاقة ميكروفلويديك باستخدام أنابيب نظرة خاطفة (بأقطار: 510 ميكرون (الخارجي) و 125 ميكرون (الداخلية)) (الشكل 3A). تعبئة رقائق ميكروفلويديك تماما مع الدهون / النفط مرحلة من مدخل 2.
   2. إدخال المياه المرحلة استنادا MRB80 (انظر القسم 3 "اعادة تشكيل وزهور النجمة أنيبيب الأساسية4؛) من مدخل 1. السيطرة قطرة الحجم عن طريق تغيير الضغوط الدهون / النفط المرحلة والمرحلة الماء لخلق قطرات من ~ 15 ميكرون في القطر (الشكل 3B).
      ملاحظة: استخدام هذا الإعداد، واستخدام ~ 800 مليبار للدهون / نفط مرحلة و~ 200 مليبار لمرحلة الماء لخلق قطرات من الحجم المطلوب.
   3. بعد الحصول على المطلوب قطرة الحجم والكمية المطلوبة (~ 10 ميكرولتر لكل عينة)، وجمع قطرات من قناة مأخذ وتحميل إلى تدفق خلايا (ملء خلايا تدفق تماما).
   4. إغلاق طرفي تدفق خلايا بعناية باستخدام Valap (غير كامل مغلقة تدفق الخلايا يمكن أن يؤدي إلى حركة واسعة من قطرات، مما يجعل من الصعب على صورة منها). وبالإضافة إلى ذلك، منع تشكيل فقاعات الهواء مما يؤدي إلى حركة الحبرية.
   5. شطف الأنابيب نظرة خاطفة على نطاق واسع مع الأيزوبروبانول قبل وبعد الاستعمال لمنع عينة انتقال التلوث وانسداد.

3. إعادة تشكيل الأساسي أنيبيب زهور النجمة

ملاحظة: محتويات القطرة يمكن أن تختلف تبعا لمتطلبات التجريبية. جميع المخازن والقائم على MRB80 (80 أنابيب ملم، 1 ملي EGTA، 4 مم MgCl ₂ (درجة الحموضة 6.8))، ويتم إعدادها جميع العينات على الجليد. بشكل عام، قطرات تحتوي دائما جسيم مركزي، والمكونات المطلوبة للالبلمرة أنيبيب، ونظام الأوكسجين زبال ومنع وكيل (انظر القسم 3.1). يمكن تضمين قوة المولدات أنيبيب والعوامل المساعدة المطلوبة واستهداف العوامل إذا رغبت في ذلك (انظر الأقسام 4.1 و 4.2).

1. الإعداد العام لتشكيل أستر في قطرات مستحلب (الشكل 3D)
   1. إعداد أوكسيديز الجلوكوز (20 ملغ / مل أوكسيديز الجلوكوز في 200 ملي DTT و 10 ملغ / مل الكاتلاز) مزيج مقدما وتخزينها في قسامات صغيرة في -80 درجة مئوية.
   2. إعداد "مزيج حجب" التي تحتوي على κ الكازين، ألبومين المصل البقري (BSA)، توين-20 و ديكستران فلوري (كعلامة محايدة) (انظر الجدول 1) مقدما وتخزينها في أليكو صغيرةالخبر في -80 درجة مئوية. منع تكرار تجميد أذاب دورات. وطازجة ضمان كافة المكونات.
   3. تنقية جسيم مركزي من خطوط الخلايا KE37 الليمفاوي الإنسان كما وصفها Moudjou وآخرون. ³² وتخزينها في -150 درجة مئوية في قسامات الصغيرة.
   4. ذوبان الجليد جسيم مركزي في درجة حرارة الغرفة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ~. قبل الاستخدام لضمان التنوي أنيبيب السليم.
      ملاحظة: هذا يعزز أنيبيب التنوي أثناء التجربة.
   5. في الوقت نفسه، وإعداد "مزيج فحص"، التي تحتوي على تويولين (الفلورية و "الظلام")، غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)، وهو نظام الأوكسجين زبال (الجلوكوز والجلوكوز أوكسيديز، وكتالاز 1،4-dithiothreitol (DTT))، مولدات القوة الجزيئية (مثل محركات أنيبيب / عبر linkers)، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ونظام ATP-تجديد (الفسفوإينول (PEP)، البيروفات كيناز (PK) ونازعة اللاكتات (LDH)) على الجليد (انظر الجدول 2).
   6. قبل تبريدالدوار airfuge على الجليد. تدور باستمرار العينة في الدوار تبريد airfuge (30 رطل لمدة 3 دقائق). إضافة جسيم مركزي قبل ساخنة (تحسين كمية من جسيم مركزي لهدف لقطرات تحتوي على 1-2 جسيم مركزي).
   7. استخدام مزيج جنبا إلى جنب لإنتاج قطرات مستحلب باستخدام الأساليب المذكورة في القسم 2.3.

الجدول 1: المقومات من "حجب ميكس" المقومات بعرقلة المزيج، اللازمة لإعادة تشكيل الهياكل المغزل مثل في قطرات مستحلب الماء في النفط. لوصف، انظر القسم النص الرئيسي 3 "اعادة تشكيل وزهور النجمة أنيبيب الأساسية". لمزيد من التفاصيل على المواد، انظر "مواد الجدول.

الجدول 2: مقومات "ميكس الفحص. مقومات مزيج الفحص، اللازمة لإعادة تشكيل هياكل تشبه المغزل في قطرات مستحلب الماء في النفط. لوصف، انظر القسم النص الرئيسي 3 "اعادة تشكيل وزهور النجمة أنيبيب الأساسية". لمزيد من التفاصيل على المواد، انظر المواد الجدول.

4. تقديم المغزل الجمعية العوامل

ملاحظة: في المقايسات الموصوفة هنا، وهو بروتين الفلورية الخضراء (GFP) -tagged نسخة اقتطاع س تم استخدام خميرة داينين ​​التي dimerized بشكل مصطنع عن طريق أحد أميني محطة الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) -tag ^33. يتم تنقيته هذا البروتين من خلال علامة تقارب يحتوي على نسختين من البروتين ونطاق ملزم مفتش. هو المسمى المختلفة والتي تستخدم هنا مع تسمية tetramethylrhodamine (TMR) على كربوكسي الطرفية ويستخدم N-محطة SNAP-كلمة دلالية لbiotinylate البروتينات النقاء. للحصول على تفاصيل بناء، انظر روث وآخرون ^31؛ للحصول على تفاصيل تنقية، انظر التوصيةك-بيترسون وآخرون. ^33. GFP-البيوتين-داينين-TMR يمكن أن تستهدف الحبرية-القشرة من خلال تشكيل المجمعات البيوتين streptavidin التي تصل نسبة الدهون في داينين ​​إلى biotinyl-PE (الشكل 3E).

1. داينين ​​استهداف لالقطرة اللحاء
   1. تشمل GFP-البيوتين-داينين-TMR في "مزيج فحص" (انظر الجدول 2) في النهائي قطرة-تركيز 30 نانومتر. وتشمل Streptavidin إلى "مزيج فحص" (انظر الجدول 2) في النهائي قطرة-تركيز 200 نانومتر.
      ملاحظة: داينين ​​يعتمد على ATP-التحلل للحركة تدريجي على الأنابيب الدقيقة. ولذلك، تشمل اعبي التنس المحترفين ونظام ATP تجديد (التي تحتوي على PEP وPK / LDH) في "مزيج فحص" (انظر الجدول 2).
      ملاحظة: المؤتلف كامل طول س. pombe GFP-Cut7 (كينيسين 5) يعود الفضل من قبل مختبر دييز (مركز الجزيئية الهندسة الحيوية، الجامعة التقنية في دريسدن، دريسدن، ألمانيا)، انظر. المؤتلف كامل لس ength الموسومة الحامض الاميني، وقدمت pombe GFP-Ase1 يرجى من المختبر جانسون (جامعة فاغينينغين، فاغينينغين، هولندا)، وأضاف إلى "مزيج فحص" بتركيزات في 80 نانومتر.

5. التصوير

ملاحظة: أثناء التجربة، ويمكن التحكم في نمو أنيبيب عن طريق تغيير درجة الحرارة. في اختيار الظروف التصوير، ويجب أن تتم بين التصوير عالية الجودة والقدرة على رصد التجمع المغزل للوقت لفترات طويلة المقايضات. مقارنة حركية تشكيل المغزل في ظل ظروف مختلفة، قطرات مع محتويات مختلفة يمكن أن تكون مختلطة وتصوير في قناة تدفق نفسها.

1. إعدادات التصوير الأساسية
   1. صورة في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة باستخدام غرفة مغلقة. تصور ميكروتثبول الفردية بعد ~ 30 دقيقة في 26 درجة مئوية. بينما التصوير، وتعزيز أنيبيب النمو عن طريق زيادة درجة حرارة تصل إلى ~ 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: الصورةوettings أدناه محددة لإعداد المجهر لدينا ويمكن أن تختلف مع مختلف أنظمة وبرامج التشغيل المختلفة. يتم تصوير جميع المقايسات وصفها هنا على نظام مقلوب بمحركات مع قرص الغزل رئيس متحد البؤر وتشغيلها باستخدام برامج التصوير مثل أندور معدل الذكاء 3.1. الحصول على جميع الصور مع الهدف الغمر النفط 100X وكاميرا EMCCD.
   2. تعيين الليزر الإثارة 488، 561 و 641 نانومتر إلى ما يقرب من 10٪ ~ كثافة. انتقل إلى لوحة "الاستحواذ"، انقر على 'AOTF "علامة التبويب والليزر شريحة شدة إلى 10٪. انقر على 'سجل' لتخزين الإعدادات.
   3. ل-projections ض، تأخذ أكوام مع 1 ميكرومتر فترات (~ 20 صورة / قطرة). انتقل إلى الرئيسية "كاميرا" لوحة، انقر على 'تحرير ض' ومجموعة 'Z خطوة "إلى 1.0 اضغط على" التالي "لتخزين الإعدادات.
   4. تعيين الحد الأقصى الخطية EM-مكاسب عن طريق النقر على علامة التبويب "الكاميرا" وفي لوحة "الاستحواذ"، وحرك شريط مكاسب EM إلى 300. تعيين التعرضمرات إلى 200 مللي ثانية في نفس التبويب. انقر على 'سجل' لتخزين الإعدادات.
2. تصوير لايف
   1. لتصوير حي، باستخدام عناصر التحكم البرمجيات تجعل -projections ض كل دقيقة 2. لمدة 1-2 ساعة عن طريق الحد من التعرض مرات إلى ~ 100 مللي ثانية. (كما هو موضح في 5.1.4) وزيادة -intervals ض إلى 2 ميكرون (كما هو موضح في 5.1.3). تعيين السلاسل الزمنية في لوحة رئيسية 'كاميرا'، انقر على 'تكرار ر' وتعيين إلى 2 دقيقة. فترات لفترة ما مجموعه 120 دقيقة.
   2. لفحوصات الحية، استخدام كوب PDMS بدلا من تدفق خلايا منتظمة للتأكد من أن قطرات غير قادرة على الحركة قدر الإمكان.
3. التصوير جنبا إلى جنب من 2 شروط
   1. إنتاج قطرات استخدام على microfluidics وتخزينها على أعلى شريحة زجاجية PDMS المغلفة على الجليد. هذا يمنع أنيبيب التنوي حتى تم تشكيل المجموعة الثانية من قطرات. قبل إنتاج المجموعة الثانية من قطرات، وشطف الأنابيب نظرة خاطفة ورقاقة ميكروفلويديك معMRB80 تماما وإعادة ملء رقاقة ميكروفلويديك مع الدهون / النفط المرحلة.
   2. توليد قطرات مع وبدون ديكستران فلوري (أو استخدام ديكستران مع fluorophores الطول الموجي مختلفة) من أجل التمييز بين قطرات بألوان مختلفة. بعد انتاج الدفعة الثانية من قطرات، المزيج بلطف قطرات من قبل pipetting وتحميل إلى تدفق خلايا / PDMS كوب واحد.
4. تحليل الصور.
   1. تحليل الصور باستخدام فيجي (البرمجيات مفتوحة المصدر متاحة على شبكة الإنترنت) ^34.
   2. لفحوصات الحية، وتحويل أكوام إلى hyperstacks باستخدام 'صورة' - 'hyperstacks' - 'كومة إلى hyperstack ". تعيين العدد الصحيح من ض شرائح والأطر الزمنية.
   3. من أجل جعل ض التوقعات، اختر 'صورة' - 'أكوام' - 'ض المشروع. اختر 'أقصى كثافة "الإسقاط.
   4. ل3D-إعادة البناء، انتقل أولا إلى "صورة" - "خصائص" وتعيين بكسل السليم مع، heigth بكسل، وعمق فوكسل والابفترات آمي. انقر فوق "موافق". اختر 'صورة' - الاختيار "مشروع 3D، مربع" أقحم "وانقر فوق" موافق "-" أكوام ".

الأساليب المعروضة في الأقسام السابقة تسمح إعادة تشكيل هياكل مثل مغزل مع زيادة تعقيد استخدام الحبس هندسي قطرات مستحلب الماء في النفط. يصف هذا القسم نتائج ممثلة التي تثبت نوعيا قدرة هذه المقايسات.

خلال الانقسام، عندما يتم تجميعها المغزل القطبين، وخلايا تعتقل لتشكيل المجالات التي يبلغ قطرها حوالي 15 ميكرون، وقياس للخلايا البشرية. يوفر هذه الخاصية شكل الخلية الإنقسامية حدود الهندسي أن كلا من يقيد وتوجه حجم المغزل والتوجه ^35،36. تقنيات الموائع الدقيقة، وتوفير مستوى من الحبس هندسي يشبه بدقة الوضع لوحظ في الخلايا الحية وبالتالي يسمح اعادة الاعمار من أسفل إلى أعلى مغزل الإنقسامية في المختبر.

الصفحة = "1"> زهور النجمة أنيبيب هي في حد ذاتها بالفعل قادرة على سلوك معقد عندما يقتصر النمو أنيبيب من الحدود الهندسية. كما تنمو الأنابيب الدقيقة، القوى التي تدفع الناتجة عن دمج dimers تويولين جديدة بالسيارة من جسيم مركزي اثنين على طرفي نقيض من قطرات مستحلب. في البداية، جسيم مركزي منتشر بحرية داخل حجم يقتصر (الشكل 4A، اللوحة اليسرى). بعد حوالي 20-30 دقيقة، تصبح الأنابيب الدقيقة الأولى نشر مرئية والجسيم المركزي يصبح مقيدا كما تنمو الأنابيب الدقيقة ضد القشرة في كل الاتجاهات. زهور النجمة مع الأنابيب الدقيقة من طول متوسط ​​(حوالي 50٪ من القطر قطرة) يمكن (sterically) تتنافر آخر، مع ميكروتثبول دفع بعضهم ضد البعض الآخر، وجسيم مركزي الأخرى والقشرة. وهذا يؤدي إلى "القطبين" ترتيب المغزل مثل نموذجي مع اثنين من جسيم مركزي معارضة بعضها البعض (الشكل 4A، لوحة المتوسطة). عندما تنمو الأنابيب الدقيقة أطول من ~ 50٪ من الحبرية-ديامتر، وجسيم مركزي الحصول على دفع المزيد للحدود معارضة من الحبرية، مع الأنابيب الدقيقة تنمو على طول القشرة الحبرية (الشكل 4A، اللوحة اليمنى). من المهم أن نلاحظ أن معدلات النمو أنيبيب في هذه المقايسات حساسة جدا لدرجة الحرارة و-تركيزات تويولين. وبالتالي فإن هذه المعايير تؤثر بقوة على الوقت الذي لوحظ التنوي لأول مرة، وعندما يتم التوصل إلى مواقف أستر ثابتة للدولة.

في الخلايا، يتم إنشاء التجاذبات القشرية من خلال تشكيل إرفاق ملفات الحاملة بين أنيبيب بالإضافة إلى الغايات وداينين ​​المرتبطة القشرة. في الخلايا الحيوانية، هذه الجمعية يعتمد على مجمع Gαi / LGN / نوما، التي تستهدف غشاء البلازما عبر myristoylation N-محطة من Gαi ^1. في هذه المقايسات إعادة، يتم تجاوز شرط مجمع Gαi / LGN / نوما من قبل اقتران مباشرة داينين ​​إلى الدهون المعقدة البيروكسيديز من خلالتشكيل المجمعات البيوتين streptavidin البيوتين. هذه السندات هي مستقرة نسبيا (K _D ~ 10 ^-14 م) ³⁷ وتشكل بسرعة (عادة في غضون 10 دقيقة بعد تشكيل مستحلب قطرات، قبل أن يصبح أنيبيب التنوي واضح) (الشكل 4B). في ظل وجود داينين ​​القشرية، جسيم مركزي عادة تحتفظ موقف أكثر مركزية، في حين أنه في حالة عدم وجود داينين، يتم دفع جسيم مركزي إلى جانبي القشرة الحبرية (الشكل 4C). نحن السبب في هذا هو نتيجة لاثنين من الآثار، التي منع ومواجهة القوى أنيبيب دفع. (1) داينين ​​تشجع بصورة مباشرة الكوارث أنيبيب، مما يحد من طول أنيبيب ومنع الإفراط في التواء أنيبيب، و (2) التجاذبات القشرية يؤدي إلى القوات تمركز صافي على زهور النجمة الفردية ^8، التي مواجهة قوى التنافر أستر-أستر.

وإنتشاري عبر رابط Ase1 يدفع و orces التي تميل إلى زيادة المنطقة متداخلة من الأنابيب الدقيقة لمكافحة موازية ^29. واتساقا مع ذلك، في ظل وجود Ase1 (وغياب داينين) تم العثور على جسيم مركزي قريبة من بعضها البعض مع Ase1 توطين لالمجمعة الأنابيب الدقيقة بين القطبين (الشكل 4D). دفع أفراد الأسرة كينيسين 5 الفصل الجسيم المركزي من خلال توفير القوى التي تدفع من داخل المغزل (انظر المقدمة). في ظل وجود Cut7 (وS. pombe كينيسين 5 ortholog)، يتم دفع جسيم مركزي لطرفي نقيض من قطرات مستحلب، حتى في وجود Ase1 (الشكل 4E). من خلال الجمع بين مولدات قوة القشرية وبين القطبية، ومستوى التعقيد يمكن زيادة أخرى في هذه التجارب، مما يؤدي في النهاية إلى فهم شامل للثنائي القطب التجمع الإنقسامية المغزل. ووصف كمي مفصل لهذه النتائج ستكون متاحة في المستقبل (روث وآخرون، مخطوطة في الإعداد).

ف together.within الصفحات = "1"> بالإضافة إلى مراقبة موقف جسيم مركزي في لحظات محددة في الوقت المناسب، والمتعلقة سلوكهم لأطوال المرصودة من الأنابيب الدقيقة، ويمكن الحصول على معلومات قيمة من خلال اتباع عملية تحديد المواقع على مرة. عن طريق الحد من التعرض مرات وشدة الليزر، فمن الممكن الآن لمتابعة المواقع أستر على فترات دقيقة 2 لا يقل عن 1 ساعة مع التبييض فقط ~ 30٪. وهذا يسمح للرصد التجمع أستر وتحديد المواقع من جسيم مركزي نشرها بحرية (0 دقيقة) عبر المركزية (12 دقيقة) لزهور النجمة اللامركزية (36 دقيقة، وأكثر من ذلك) (الشكل 5C). هذا يسهل دراسة كل من سلوك ثابت للدولة وحركية الجمعية المغزل. من خلال الجمع بين قطرات مع محتويات مختلفة في نفس العينة، هو، على سبيل المثال، من الممكن مقارنة مباشرة الجسيم المركزي المواقع والجمعية المغزل حركية في قطرات مع وبدون مولدات قوة القشرية (الشكل 5B).

: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 1: القوى المؤثرة على الميتوزى المغزل عدة جزيئات تولد قوة تعمل على الأنابيب الدقيقة للمغزل الإنقسامية لتشجيع تكوين المغزل وتحديد المواقع. الأنابيب الدقيقة التي تنمو في القشرة خلية توليد قوة دفع على الجسيم المركزي. داينين ​​القشرية (الأرجواني) يلتقط الأنابيب الدقيقة depolymerizing ويولد قوة سحب على جسيم مركزي. داخل المغزل، وتوفر كينيسين 5 البروتينات المحرك / Cut7 قوة الانزلاق إلى الخارج على الأنابيب الدقيقة لمكافحة موازية، في حين عبر linkers للأسرة PRC1 / Ase1 تخلق معارضة الخارج قوة انزلاق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .

الشكل 2: ميكروفلويديك تصميم رقاقة (A) تصميم 4 بوصة الضوئية الرئيسية التي تحتوي على 4 رقائق ميكروفلويديك. (ب) تمثيل مفصل من شريحة واحدة. رقائق تحتوي على قناة منفذ واحد وثلاث قنوات مدخل تليها الغبار فلتر. مدخل قناة 1 تحتوي على مرحلة والمياه، قناة 2 الدهون / النفط المرحلة وقناة 3 يمكن استخدامها لتمييع قطرات شكلت مع دهن إضافية / نفط المرحلة. (ج) تمثيل مفصل من تقاطع فيها الدهون / النفط مرحلة (قادمة من أعلى وأسفل) تجتمع مع الماء مرحلة (قادمة من اليسار). عند تقاطع، وقطرات تشكيل وتتدفق نحو قناة مخرج على اليمين. (د) تمثيل مفصل من الغبار فلتر مع 2 ميكرون القنوات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): منهجية تشكيل المياه في والنفط المستحلب القطرة (A) رقاقة ميكروفلويديك والأنابيب على microfluidics على المجهر مشرق الميدان. كلا يتم توصيل أنابيب الماء والدهون / النفط المرحلة إلى مداخل رقاقة 1 و 2 على التوالي. (ب) القيود المفروضة على رقاقة على microfluidics حيث تلبية الماء والدهون /-مراحل النفط. عن طريق تغيير الضغوط، حجم قطرات يمكن السيطرة عليها. (ج) تصميم خلايا تدفق المغلفة PDMS. بعد تحميل قطرات في خلية تدفق، وتغلق فيه نهايات مفتوحة مع Valap إضافية. (د) رسم تخطيطي للتشكيل الحبرية. وتستخدم قطرات لتغليف جسيم مركزي، تويولين والمكونات الإضافية المطلوبة لتشكيل المغزل الإنقسامية. (E) رسم تخطيطي للاستهداف القشرية-داينين. ويستهدف البيروكسيديز (بيو) داينين ​​إلى الدهون المعقدة البيروكسيديز من خلال streptavidin (STRP). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية للمغزل Reconstitutions مع زيادة التعقيد (A) توقعات كثافة القصوى من قطرات تحتوي على اثنين من جسيم مركزي تظهر أمثلة من الأنابيب الدقيقة قصيرة ومتوسطة وطويلة. وتصور جسيم مركزي والأنابيب الدقيقة من خلال إضافة 10٪ HiLyte-488 المسمى تويولين. الحانات النطاق = 10 ميكرون. (ب) توطين-GFP البيوتين-داينين-TMR في غياب (- يسار) وجود (+، يمين) من streptavidin (STRP). تحديد المواقع (C) أنيبيب أستر في غياب (- يسار) أو وجود (+، يمين) من القشرية GFP-البيوتين-داينين-TMR. (D) أنيبيب أستر (اللوحة اليسرى، غرامالتابعين) لتحديد المواقع في وجود Ase1 (لوحة المتوسطة والأحمر). (E) أنيبيب أستر (اللوحة اليسرى، الأخضر) لتحديد المواقع في وجود Ase1 وCut7 (كينيسين 5) (لوحة المتوسطة والأحمر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: التصوير أستر المواقع حيوية في المختبر (A) تصميم كوب PDMS الذي يسمح التصوير قطرة لمدة تصل إلى عدة ساعة. (ب) توليد وتخزين والتصوير من قطرات (المنقولة) التي تحتوي على محتويات مختلفة، ويتضح من غياب (يسار) إدراج (يمين) من ديكستران فلوري (اليكسا 647). (C) وصور طائرة واحدة من 60 دقيقة مرور الزمن (2 فترات دقيقة) مأخوذة من ض المكدس (2 ميكرون مسافات) من الإعلانroplet يحتوي على جسيم مركزي واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ووصفت وسائل الجهود الحالية هنا مؤخرا لإعادة مغزل الإنقسامية الأساسية في قطرات مستحلب الماء في النفط. دراسة الجمعية المغزل داخل حدود هندسية يوفر مزايا عديدة. وتوجد آليات التغذية المرتدة هامة بين الأنابيب الدقيقة للمغزل الإنقسامية والقيود الهندسية التي يتم تجميعها. يمكن الأنابيب الدقيقة تولد دفع القوات عندما ينمو إلى الحدود الهندسية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشريد المغزل الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، وتزايد إلى حاجز مادي يمكن أن تحدث كوارث أنيبيب. أيضا، الجمعية المغزل في هندسة تقتصر يمكن أن يؤدي إلى نضوب التدريجي من المكونات الفردية، مثل تويولين، وهذا بدوره يؤثر بشكل مباشر على معدل النمو أنيبيب ^36. وهذه كلها محددات أساسية من الجمعية المغزل، والتي يمكن دراستها باستخدام المقايسات وصفها هنا.

المقايسات وصفها هي حساسة جدا لاح تركيز صغيرالامتحانات التنافسية الوطنية من مكونات قطرة. هذا هو الحال بالنسبة لتويولين، حيث الاختلافات الطفيفة تركيز يمكن أن يؤدي إلى إما بطيئة جدا أو سريع جدا النمو أنيبيب. في هذه الحالة، يمكن في كثير من الأحيان لا يزال يتم تصحيح معدلات النمو أنيبيب عن طريق ضبط درجة الحرارة خلال أول دقيقة ~ 30 من هذه التجربة. حساس جدا لتغيرات في تركيز مولدات (القشرية) القوة أيضا الإنقسامية الجمعية المغزل وتحديد المواقع. هذا ومن المرجح أن تعتمد على التركيز والنقاء والنشاط من عناصر النقاء وتحتاج إلى معاير بعناية لكل البروتين المنقى حديثا.

وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تتم في أماكن التصوير، وهذا يتوقف على طبيعة الفحص بعض المقايضات. في البداية، وارتفاع مستويات قابلة للذوبان dimers تويولين الفلورسنت تجعل من الصعب صورة الأنابيب الدقيقة الفردية. كما الأنابيب الدقيقة تنمو أطول ونفاد تويولين للذوبان ببطء، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء يصبح تدريجيا العالي ويسمح التصوير من individuآل الأنابيب الدقيقة. وعلى النقيض من الاجهزة مع الأنظمة المفتوحة، والحبس هندسي يمنع تبادل جزيئات الفلورسنت ومكونات النظام الأوكسجين زبال داخل الخزان بكميات كبيرة، مما يؤدي إلى تبييض كبير. خاصة لرصد الجمعية المغزل وتحديد المواقع مع مرور الوقت، هو مطلوب منها صورة مع شدة الإضاءة الخافتة، حتى في وجود نظام الأوكسجين زبال قوية.

تمكن هذه الطرق إعادة من أسفل إلى أعلى تبسيط الهياكل المغزل تشبه في المختبر. وبالإضافة إلى المكونات قدم هنا، وقد وصفت العديد من العوامل الأخرى للتأثير على تشكيل ثنائي القطب المغزل، وتحديد المواقع، والتوجه لتشكيل، الخ. ^3. هذا النظام يمكن توسيع نطاقها لدراسة الآثار الفردية والمشتركة للمولدات قوة إضافية. هامة تسهم في تشكيل المغزل التي هي غائبة حاليا من هذا النظام هي الكروموسومات الإنقسامية. وقد تبين لونين الإنقسامية لتشكيل المغزل المباشر من قبل (1) chromokinesins التي يمكن أن تولد ما يسمى "قوات القطبية طرد" ^3، (2) تشكيل التدرج RanGTP من قبل محددة لونين RanGEF RCC1 ^38، (3) kinetochores التي يمكن أن تتفاعل مع (depolymerizing ) الأنابيب الدقيقة ³⁹ و(4) لونين نفسها، والتي يمكن أن تكون بمثابة ربيع الميكانيكية في الفترات الفاصلة بين الأنابيب الدقيقة معارضة ^40.

وأخيرا، يقدم النظام المذكور حاليا السيطرة الزمانية والمكانية محدودة على النشاط وتوطين عرض قوة المولدات الكهربائية. في الخلايا، العديد من العوامل الجمعية المغزل توطين لمقصورات محددة أو تنشط في غضون فترة زمنية نافذة مقيدة. ومن الأمثلة الصارخة على نشاط داينين، الذي أثرى تحديدا في الجانب الخلفي من C. ايليجانس خلية واحدة مرحلة الجنين إلى تعزيز غير المتماثلة المواقع المغزل وانقسام الخلايا. في هذا النظام، ونحن حاليا بصدد استكشاف إمكانية محاكاة هذا رالنشاط باستخدام أساليب emporal وغير المتماثلة اقترضت من تقنيات البصريات الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال بالنسبة لجيم ايليجانس الجنين والخلايا بجدار الخلية جامدة، والعديد من الخلايا لا محاصرة في الانقسام. وشكل هندسي الحبس يكون له تأثير جوهري على القوى المؤثرة على محور ^41. ولذلك سيكون من المهم إعادة الجمعية المغزل وتحديد المواقع في قطرات غير كروية كذلك، وربما باستخدام نظم ميكروفلويديك أكثر تعقيدا التي تتيح تشكيل وتخزين مستحلب قطرات ^42،43. وأخيرا، في الأنسجة، خلية خلية وإشارات الخلية الركيزة والتعلق توفر منبهات الخارجية التي يمكن أن تترجم إلى التوجه المغزل توجيهها، إذ أن كثيرا ما لوحظ في الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية. لم تؤخذ جميع هذه الجوانب المتخصصة بعين الاعتبار في هذه الدراسة الحالية وربما يوفر التحديات المستقبلية لبناء نحو مزيد في الجسم الحي تشبه reconstitutions من assemb المغزل الإنقساميةلاي وتحديد المواقع.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).