توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

الخلايا اللمفية تي هي مكونات أساسية في الجهاز المناعي التكيفي. خلايا T هي المسئولة عن ليس فقط التوسط مباشرة استجابات مناعية وقائية لمسببات الأمراض من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المستجيب، ولكن أيضا الحفاظ بنشاط التسامح المناعي الذاتي وتوجيه استجابات خلايا أخرى في جهاز المناعة. يتم توجيه هذه الوظائف من خلال عدد من الإشارات متكاملة، بما في ذلك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ربط، والسيتوكينات كيموكينات، والأيض ^1. من هذه الإشارات، وTCR له أهمية خاصة، حيث أنه يوفر خصوصية المميزة التي تحدد دور الخلايا التائية في المناعة التكيفية. يتفاعل مع مستضدات TCR الببتيد الخطية التي قدمها MHC (HLA ortholog البشري) جزيئات (المجمعات PMHC) بطريقة محددة جدا وحساسة لتوفير الإشارات التي تبدأ T وظيفة الخلايا المستجيب. المعلمات البيوكيميائية من التفاعلات مع TCR بروابط رهن العقاري توفر ليس فقط خصوصية لTتنشيط الخلايا، ولكن أيضا أن يكون لها تأثير نوعي على وظيفة خلايا T لاحقا ^2. وبالتالي، دراسة وظيفة خلايا T وغالبا ما يتطلب دراسة استجابات الخلايا التائية نسيلي مع خصوصية محددة المستضدات.

تي المقصورة الخلية البشرية، التي تحتوي على ما يقرب من 10 ¹² خلايا T αβ، ويحتوي على ما يقدر بنحو ¹⁰ يوليو - 10 أغسطس αβTCRs متميزة ^3-4. يوفر هذا ذخيرة متنوعة فرصة للاعتراف مجموعة واسعة من الببتيدات من مسببات الأمراض المحتملة التي من شأنها أن تتطلب استجابة خلايا T للمناعة وقائية. وتشير التقديرات إلى أن وتيرة خلايا تي الاستجابة لمستضد الأجانب نظرا قدمها MHC الذاتي هو بناء على أمر من 10 ^-4 - 10 ^-7 في غياب الاستجابة المناعية قبل أن مستضد ^5. يتشكل من السذاجة الخلايا التائية ذخيرة عن طريق الانتقاء الغدة الصعترية لضمان القدرة على التعرف على الذات MHC تقديم المستضدات الببتيد والحد تتفاعلivity ضد المستضدات الببتيد الذاتي، وتعظيم الفائدة المحتملة للوساطة مناعة وقائية ^2. ومع ذلك، في انتهاك لهذا التفاعل تصميم، تردد كبير نسبيا، 10 ^-3 - 10 ^-4، خلايا تي من الأفراد ساذج مناعيا الرد على التحفيز مع خلايا الاعضاء المختلفة وراثيا، والاعتراف كلا من جزيئات MHC الأجنبية وكذلك الببتيدات الذاتية ما يقدمونه ^6. الاعتراف بروابط PMHC خيفي يشبه هيكليا إلى الاعتراف مستضدات أجنبية قدمها MHC على الذات؛ وTCR يجعل التفاعلات الكيميائية الحيوية الهامة مع كل من الجزيء MHC خيفي فضلا عن تقديمها ⁷ الببتيد. مجمعات الطبيعة القوية لاستجابة خلايا T إلى نتائج التحفيز خيفي من تنوع PMHC موجودة على سطح الخلايا خيفي ^8. ويقدر أن كل MHC يقدم حوالي 2 × 10 ⁴ مختلف المستضدات الذاتية الببتيد ^9. هذا بreadth الاستجابة للتحفيز خيفي هو جانب هام من أمراض سريريا ذات الصلة، مثل رفض المزروع أو الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف (GVHD)، الناتجة عن الخلايا التائية alloreactivity.

دراسة استجابات الخلايا التائية alloreactive الإنسان قد اعتمدت تقليديا على دراسة الردود بولكلونل خلايا T ساذجة التالية التحفيز مع خلايا خيفي. التحفيز المتكرر مع نفس خط الخلية خيفي جنبا إلى جنب مع الحد من التخفيف يحلل قادر على توليد خلايا T نسيلي مع الاعتراف محددة من خيفي HLA ^10. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مشكلة لدراسة الردود على الفرد بروابط PMHC خيفي، ومرجع كبير ومتنوع من الذاتية PMHC مجمعات الحالي لخيفي نظرا HLA يحفز ذخيرة واسعة من خلايا تي. وهذا من شأنه تحفيز السكان السائبة والحد من نهج التخفيف تتطلب فحص أعداد كبيرة من الحيوانات المستنسخة لعزل خلايا T مع reacti المطلوبvity ضد PMHC يجند احد. بالإضافة إلى ذلك، تردد خلايا تي الاستجابة لفرد خيفي PMHC يجند منخفض نسبيا بين السكان السذاجة الخلايا التائية، مما يشكل عائقا أمام جيل فعال من استنساخ الخلايا التائية البشرية تستجيب لمستضد معين.

وقد مكن تحديد وعزل خلايا T مستضد معين من السكان بولكلونل من خلال تطوير المسمى fluorophore PMHC multimers ^11. هذا النهج يستخدم المضادات الببتيد محددة تحميلها في المؤتلف للذوبان جزيئات MHC المعقدة البيروكسيديز، والتي وصفت من قبل الملزم إلى fluorophore المسمى streptavidin. Multimerization للرهن العقاري يزيد من الطمع، وتعويض عن انخفاض جوهري (ميكرومتر) تقارب من TCR للرهن العقاري بروابط القابلة للذوبان. ويمكن تحديد وعزل الخلايا المسمى من قبل التدفق الخلوي. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا تزال محدودة بسبب التردد المنخفض من خلايا تي مستضد معين بين السكان السذاجة الخلايا التائية، والتي عادة ما تكونأوامر من حجم أقل من الحد من تحديد دقيق وتقدير على معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي. لمعالجة هذا القيد، تم تطوير طريقة للرهن العقاري ووضع العلامات tetramer احق تخصيب حبة المغناطيسي للخلايا المسمى tetramer ^12. وقد أثبتت هذه الطريقة الكشف موثوق بها، تعداد، وعزل خلايا T مستضد معين التردد المنخفض.

يصف هذا البروتوكول بروتوكول فعال لتوليد استنساخ الإنسان خلايا T التي تستجيب خصيصا لالفردية بروابط PMHC خيفي. ينطبق البروتوكول رهن العقاري (HLA) متعدد القسيمات وضع العلامات وإثراء لعزل خلايا T الإنسان مستضد خيفي خاصة مع التدفق الخلوي خلية الفرز وسيلة قوية للثقافة في المختبر من خلايا T البشرية لتمكين إنتاج تي استنساخ خلية من خلايا مرتبة واحدة ( نظرة عامة في الشكل 1).

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول استخدام عينات الدم الطرفية من متطوعين من البشر. يجب مراجعة كل البحوث على الإنسان ووافق عليها الدراسات الإنسانية المؤسسي مجلس المراجعة لضمان الامتثال لإعلان هلسنكي (2013) ونقل التأمين الصحي وقانون محاسبة لعام 1996.

1. عزل خلايا T من الدم الكامل

1. قبل البدء، تدفئة متوسطة الكثافة التدرج إلى درجة حرارة الغرفة. قسامة 4 مل من التدرج الكثافة المتوسطة إلى 2-4 معقمة 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية (سيتم استخدام أنبوب لكل 1 مل 10 إجمالي حجم الدم المخفف).
2. الحصول على 10-20 مل من الدم في 1-2 صوديوم الهيبارين رذاذ المغلفة (الأخضر العلوي) أنابيب جمع الدم الوريدي. جمع العينات البشرية تحت إشراف أفراد مدربين وفقا لمجلس المراجعة المؤسساتي وافق البروتوكول.
3. مسح السطح الخارجي للأنابيب مع الايثانول 70٪. إزالة بعناية قمم فايlled أنابيب جمع وصب الدم إلى العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي.
4. إضافة 10 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) إلى كل أنبوب جمع الدم. جمع برنامج تلفزيوني، إضافة إلى الدم كله يصب، وتخلط بلطف.
5. إضافة 25 ميكرولتر تي الإنسان إثراء خلية كوكتيل / 2 مل الحجم الكلي. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
6. باستخدام ماصة 10 مل، طبقة تصل إلى 10 مل من 1: 1 الدم المخفف بلطف على أعلى من متوسط ​​كثافة التدرج. يجب الحرص على عدم تعطيل سطح متوسطة الكثافة التدرج.
7. الطرد المركزي الدم وكثافة الطبقات المتوسطة التدرج في 1200 x ج لمدة 20 دقيقة عند 20 ^{درجة مئوية.}
8. إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي، مع الحرص على عدم تعطيل التفاعل بين متوسطة الكثافة التدرج وطبقة من الكريات البيض في واجهة بين متوسطة الكثافة التدرج والبلازما المخفف. باستخدام ماصة 5 مل، وجمع بعناية طبقة الكريات البيض ونقل إلى معقمة 50 مل حوض مخروطي الشكل الجديده.
9. إضافة برنامج تلفزيوني لتبرزي حجم من PBL جمعت إلى 50 مل وتخلط بلطف.
10. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 ^{درجة مئوية.} صب.
11. في resuspend مكعبات الخلايا في 10 مل العقيمة تدفق الخلوي فرز عازلة (PBS العقيمة التي تمت تصفيتها تحتوي على 1٪ BSA). عينة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية، وتمييع 01:10 (إضافة إلى 90 ميكرولتر) أزرق التريبان عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (العائد المتوقع 1-4 × 10 ⁶ خلية / أنبوب من الدم الكامل).
    1. إزالة 1 مل قسامة، ونقل إلى أنبوب 5 مل، والحفاظ على الجليد لتحليل خلايا تي لا وصفت من قبل tetramer. الحفاظ تعليق الخلية على الجليد.

2. التخصيب المغناطيسي للخلايا T مستضد خيفي محددة

1. تمييع مستضد خيفي PMHC tetramer إلى 1: 100 في المخزن فرز معقم.
2. تعليق خلية الطرد المركزي (9 مل من الخطوة 1.11) في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 ^{درجة مئوية.} صب.
3. إضافة 50 ميكرولتر من المخفف مستضد خيفي PMHC tetramer إلى مكعباتالخلايا (تصل إلى 10 ⁷ خلايا). مزيج لطيف من قبل pipetting. نقل إلى أنبوب معقم 5 مل. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. إضافة 2 مل نوع عازلة. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 ^{درجة مئوية.} صب.
5. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر عازلة النوع. إضافة 10 ميكرولتر اختيار البيوتين كوكتيل واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. إضافة 5 ميكرولتر المغناطيسية النانوية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. إضافة 2.5 مل العازلة نوع وتخلط بلطف بواسطة pipetting. إزالة 100 ميكرولتر قسامة، ونقل إلى أنبوب 5 مل، والحفاظ على الجليد لتحليل الخلايا ما قبل التخصيب.
8. وضع أنبوب 5 مل تحتوي على تعليق خلية في المغناطيس فصل الخلايا. وينبغي أن يكون الحد الأقصى فضفاضة فوق الأنبوب. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. بلطف وإزالة الغطاء من الأنبوب. عقد أنبوب والمغناطيس معا، صب محتويات أنبوب إلى أنبوب 5 مل الطازجة. لا استفادة أو التخلص محتويات أنبوب لإزالة آخر قطرات من السائل.
10. إزالة أنبوب من المغناطيس. إضافة 2 مل عازلة النوع البارد وتخلط بلطف بواسطة pipetting. عينة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية، وتمييع 1: 2 (إضافة إلى 10 ميكرولتر) أزرق التريبان عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

3. إعداد الخلايا T للوحيدة الخلية التدفق الخلوي الفرز الخلية

1. إضافة عازلة النوع البارد لجميع أنابيب من الخلايا (tetramer الخالي من الملصقات والأمم المتحدة التخصيب، والتخصيب وصفت tetramer المسمى tetramer) لتحقيق حجم إلى 3 مل.
2. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^درجة مئوية وعازلة صب لاستعادة الخلايا.
3. الخلايا resuspend مكعبات في 25 ميكرولتر عازلة النوع البارد. إضافة 5 ميكرولتر البشري كتلة لكرة القدم. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
4. إعداد الأجسام المضادة لالتدفق الخلوي الفرز. مزيج 15 ميكرولتر عازلة نوعا، 15 ميكرولتر مكافحة CD5، 15 ميكرولتر مكافحة CD14، و 15 ميكرولتر مكافحة CD19.
5. إضافة 20 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل أنبوب من الخلايا. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
6. إضافة 2 مل من العازلة النوع البارد لكل أنبوب.
7. الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^درجة مئوية وعازلة صب لاستعادة الخلايا.
8. الخلايا resuspend بتركيز 1 -2 × 10 ⁶ خلية / مل في المخزن النوع.
9. قسامة 100 ميكرولتر من البشر تي خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM Iscove وتستكمل مع 2 مم Glutamax، 10 ملي HEPES، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، و 10٪ الحرارة المعطل الإنسان AB مصل، و 2.5 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف IL-2) إلى كل بئر من 96-جيدا لوحة مستديرة ثقافة الخلية أسفل. الحفاظ على الجليد.

4. عزل خلايا T-المسمى Tetramer بواسطة وحيدة الخلية التدفق الخلوي الفرز

1. إنشاء التدفق الخلوي المعلمات النابضة لتحديد مستضد خيفي-PMHC tetramer خلايا T المسمى (الشكل 2.A). استخدام tetramer قبل التخصيب وصفت جزء لإقامة النابضة استراتيجيات للقضاء على الحلل، بوابة على الخلايا الليمفاوية، واستبعاد التعبير عن CD19 CD14 الخلايا البائية ومعربا عن حيدات، وتحديد خلايا T من CD5 التعبير. استخدام نموذج لا المسمى مع tetramer باعتباره مضان ناقص واحد للتحكم لإنشاء النابضة لتحديد الخلايا التائية ملزم tetramer (مع 0٪ من CD5 ⁺ CD14 ^- CD19 ^- يجب خلايا من العينة لا وصفت من قبل tetramer تقع ضمن هذه البوابة) .
   ملاحظة: المحاصرة الاستراتيجيات التي ليست صارمة بشكل كاف سيؤدي إلى عزل الخلايا غير T أو خلايا T التي لم يتم مستضد معين، في حين أن الاستراتيجيات النابضة تقييدية بشكل مفرط سوف يقلل من عدد الخلايا T معزولة.
2. برمجة المعلمات لوحة لنوع خلية واحدة. توجيه فارز لوضع CD5 1 ⁺ CD14 ^- CD19 ^- tetramer ⁺ خلية في كل بئر. توجيه لوحة إقامة لاحتواء 1 السيطرة السلبية بشكل جيد (أي الخلايا التي تم فرزها في البئر) و 1 مراقبة إيجابية جيدا (100 CD5 ⁺ CD14 ^- CD19 ^- tetramer ^- خلايا) في كل صف (الشكل 2.B ).
3. باستخدام التدفق الخلوي تأسيس استراتيجية النابضة ولوحة الإعداد، وعزل خلايا T ملزم tetramer فردية مباشرة في لوحة 96-جيدا باستخدام فارز خلية تدفق cytometric.

5. الثقافة والتوسع في استنساخ الخلايا التائية مستضد خيفي محددة

1. بعد الانتهاء من الفرز الخلية، لوحة أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 ^{درجة مئوية.} لوحة ثقافة المكان عند ³⁷ درجة مئوية في 6٪ CO ₂ الحاضنة.
2. دوامة تنشيطية ميكروبيدات مكافحة CD3 / مكافحة CD28 لمدة 30 ثانية ل resuspend الخرز.
3. حساب حجم حبات المنشط المطلوبة لتنشيط خلايا T التي تم جمعها (0.5 ميكرولتر من ميكروبيدات المنشط / جيد). نقل حجم محسوب من الخرز مشجعا لأنبوب معقم 5 مل. إضافة 1 مل البشري زراعة الخلايا T المتوسطة ودوامة.
4. وضع أنبوب مع تعليق microbead في المغناطيس. وينبغي أن يكون الحد الأقصى فضفاضة فوق الأنبوب. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. إزالة بلطفالغطاء من الأنبوب. عقد أنبوب والمغناطيس معا، صب محتويات أنبوب إلى أنبوب 5 مل الطازجة. لا استفادة أو التخلص محتويات الأنبوب.
6. إزالة أنبوب من المغناطيس. إضافة البشري تي خلية ثقافة المتوسط ​​(100 ميكرولتر المتوسطة / 0.5 ميكرولتر من ميكروبيدات أضافت في البداية).
7. قسامة 100 ميكرولتر من حبة منشط تعليق على كل بئر من لوحة 96-جيدا. احتضان لوحة الثقافة في ³⁷ درجة مئوية في 6٪ CO ₂ الحاضنة.
8. مراقبة نمو الخلايا يوميا عن طريق الفحص المجهري. يمكن ملاحظة مجموعات صغيرة من الخلايا المتكاثرة مجهريا بعد 5 - 7 ايام الثقافة (الشكل 3.A).
   ملاحظة: تصور تي مزارع الخلايا في هذه المرحلة قد يكون من الصعب، وعدم وجود مجموعات الخلايا يمكن ملاحظتها في هذه المرحلة قد لا يكون مؤشرا على عدم وجود خلايا T المتنامية.
9. في 14 يوما بعد عزل الخلايا والثقافات تغذية عن طريق إزالة بعناية 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخروج من الجزء العلوي من الثقافة واستبدالها مع 100 μ؛ ل الطازج البشرية تي خلية ثقافة المتوسط. مواصلة احتضان لوحة الثقافة في ³⁷ درجة مئوية في 6٪ CO ₂ الحاضنة.
10. مراقبة نمو الخلايا يوميا عن طريق الفحص المجهري وتقييم اللون من مستنبت. وينبغي أن تكون مجموعات الخلايا كبيرة المرئي مجهريا 2 - 3 أيام بعد التغيير المتوسط. ظاهريا، ينبغي أن تصبح الكريات الخلايا مرئية خلال 14 يوما التالية لتغيير المتوسطة.
11. في 28 يوما بعد عزل الخلايا، وتحديد استنساخ المتنامية عن طريق الفحص المجهري. نقل حجم 200 ميكرولتر من الثقافات لوحة 96-جيدا نموا إيجابيا إلى الآبار الفردية 48 لوحة جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على 200 ميكرولتر البشري تي خلية ثقافة المتوسط.
12. إضافة 100 ميكرولتر تحتوي على 12.5 ميكرولتر من تنشيطية ميكروبيدات مكافحة CD3 / مكافحة CD28 (المعد كما هو موضح في أقسام 5،2-5،6). احتضان لوحة الثقافة في ³⁷ درجة مئوية في 6٪ CO ₂ الحاضنة.
13. مراقبة نمو ثقافة يوميا السابقين المجهريأمينة وتقييم اللون من مستنبت. عندما تصل زراعة الخلايا T> 2X10 ⁶ / مل (عادة بعد 3-5 أيام إعادة تنشيط، يمكن تقدير يوما بعد يوم أن وسائل الإعلام يبدأ تحول القش الأصفر)، نقل الثقافة إلى بئر من لوحة ثقافة 24-جيدا الأنسجة وإضافة 500 ميكرولتر البشري الخلايا التائية المتوسطة.
14. في 10-14 يوما اتبع إعادة تنشيط، وجمع 200 ميكرولتر من الثقافة الخلايا التائية لتقييم مستضد خيفي خصوصية التدفق الخلوي تحليل PMHC tetramer ملزمة (باستخدام استراتيجية التوسيم والنابضة المبين في المادتين 3 و 4.1).

6. على المدى الطويل إعادة تنشيط وثقافة استنساخ الخلايا T

1. باستمرار إعادة تنشيط وتوسيع نسيلي الثقافات الخلايا التائية مع خصوصية المطلوب يمكن أن يكون كل 14 يوما. جمع T الثقافات الخلية في أنبوب معقم 5 مل في اليوم 14 بعد مكافحة CD3 / CD28 الماضي التحفيز microbead. الجمع بين آبار متعددة من نفس استنساخ الخلايا التائية في أنبوب واحد، ما يصل الى حجم 2.5 مل.
2. إضافة سيلة لجلب الحجم النهائي إلى 2.5 مل وتخلط بلطف بواسطة pipetting.
3. وضع أنبوب 5 مل تحتوي على زراعة الخلايا T في المغناطيس فصل الخلايا لإزالة ميكروبيدات القديمة من الثقافة. وينبغي أن يكون الحد الأقصى فضفاضة فوق الأنبوب. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. بلطف وإزالة الغطاء من الأنبوب. عقد أنبوب والمغناطيس معا، صب تعليق الخلية في أنبوب 5 مل الطازجة. لا استفادة أو التخلص محتويات أنبوب لإزالة آخر قطرات من السائل.
5. إضافة سيلة لجلب الحجم النهائي إلى 4 مل. عينة 10 ميكرولتر لحساب الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
6. استعادة خلايا T بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. طاف صب. Resuspend الخلايا T في 10 ⁶ خلية / مل T البشري خلية ثقافة المتوسط. نقل 1 مل مأخوذة من كل بئر من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة.
8. إعادة تنشيط خلايا T وذلك بإضافة 100 ميكرولتر وسائل الإعلام التي تحتوي على 12.5 ميكرولتر من تنشيطية لمكافحة CD3 / أميكروبيدات NTI-CD28 (كما وصفها في أقسام 5،2-5،6). احتضان عند ³⁷ درجة مئوية في 6٪ CO ₂ الحاضنة.

يصف هذا البروتوكول الجيل الثقافات الخلايا التائية البشرية نسيلي مع خصوصية محددة مستضد خيفي عبر تخصيب حبة المغناطيسي والتدفق الخلوي وحيدة الخلية فرز استراتيجية الشكل 1 يقدم الخطوط العريضة للعملية.

الرقم 1: نظرة عامة بروتوكول وصف بروتوكول هنا توفر طريقة موثوق بها لجيل من استنساخ الخلايا التائية البشرية مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي. ومن المتوقع أن يستغرق حوالي 4.5 ساعة في عملية واحدة عزلة الخلايا التائية وإقامة ثقافة الخلية. التوسع في استنساخ الخلايا التائية يتطلب جولات متعددة من تحفيز الخلايا التائية غير محدد والثقافة، كل 14 يوما مع الأخذ. ويمكن اختبار مستضد خيفي الثقافات نسيلي للخصوصية بعد 28 يوما العزلة، والثقافات ويمكن زيادة توسيع لإجراء اختبارات إضافية قبل roun المتكررةس من التحفيز.

فإن العائد المتوقع للخلايا T مستضد خيفي محددة تعتمد على الجهات المانحة، ومستضد خيفي المستخدمة، والتردد المماثل من خلايا T في رد الفعل المانحة. ويبلغ متوسط ​​المانحة صحي يكون 4،5 حتي 10،0 × 10 ⁶ الكريات البيض / مل من الدم، مع ما يقرب من 20٪ اللمفاويات التائية الشكل 2 يوضح نتائج قياس ملزمة للخلايا T من HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) المانحة -negative إلى مستضد خيفي محددة، وبقايا الأحماض الأمينية 30-48 من البروتين HLA-A2 (DTQFVRFDSDAASQRMEPR، A2 _30-48) المقدم من الدرجة الثانية الجزيء HLA-DR4 ^13.

الشكل 2: التدفق الخلوي والفرز للمستضد خيفي الخلايا المسمى tetramer لتوليد الثقافات خلية واحدة. A. تدفق cytometric تحديد وعزل A2 _30-48 / HLA-DR4 tetrameص المسمى خلايا T من متبرع HLA-DR4 سلبية. تم فرز خلايا T المخصب لخلايا المسمى tetramer عن طريق الانتقاء حبة المغناطيسي التدفق الخلوي، النابضة على القميص CD5 ⁺ CD14 ^- CD19 ^- tetramer ⁺ الخلايا الليمفاوية كما هو موضح. واستخدمت خلايا غير المسماة Tetramer باعتباره مضان ناقص واحد للتحكم في إقامة النابضة للخلايا tetramer ^+. تم فرز خلايا B. Tetramer ⁺ T في 96-جيدا جولة القاع لوحة زراعة الأنسجة تحتوي على 100 ​​ميكرولتر البشرية تي خلية ثقافة المتوسط. وشملت لوحة انشاء الآبار الإيجابية والسلبية السيطرة كما هو مبين.

من رقم يبدأ من 2.0 × 10 ⁷ الكريات البيض وجدنا تردد من خلايا محددة مستضد خيفي من 1/4776 خلايا T:

1.1x10 ⁶ خلايا التخصيب tetramer X 0.992 (SINGLETS) × 0.744 (الخلايا الليمفاوية) × 0.477 (CD5 ⁺ CD14 ^- CD19 ^-) × 0.0034 (tetramer ⁺ خلايا T) / 2.0 س10 ⁷ الكريات البيض الدموية المحيطية اكس 0.314 (قبل تخصيب CD3 ⁺⁾

بدءا من 2.0x10 ⁷ الكريات البيض تمكنا من عزل خلايا T 88 الفردية المسمى tetramer للثقافة. 2 بعد جولات من مكافحة CD3 / CD28 التحفيز microbead والثقافة كما هو موضح حددنا 2 الثقافات النمو الإيجابي عن طريق الفحص المجهري (مثال تمثيلي للنمو بعد 10 يوما عزل خلية واحدة وثقافة هو مبين في الشكل 3.A). تم توسيع الثقافات نسيلي إلى 1 مل كما هو موضح، وجرى تقييم مستضد خيفي خصوصية من خلال دراسة ملزمة للA2 _30-48 / HLA-DR4 tetramer (الشكل 3.B).

الشكل 3. تقييم تي الثقافات الخلية. ألف الفحص المجهري من 96 لوحة جيدا الثقافات الخلايا التائية. مثال ممثل تي خلية ثقافة 10يوما بعد عزل الخلايا T الفردية عن طريق التدفق الخلوي الفرز. وقد حفز الخلايا مع 0.5 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة CD3 / CD28 / جيد (الأمثلة المشار إليها رأس السهم) في حجم 200 ميكرولتر تي البشري خلية ثقافة المتوسط. B. الخلايا التائية خصوصية مستضد خيفي نسيلي من ثقافات الخلايا التائية تقييمها من قبل تحليل التدفق الخلوي للرهن العقاري وضع العلامات tetramer. / تم فحص _30-48 HLA-A2 DR4 tetramer ⁺ الخلايا الليمفاوية لA2 _30-48 / HLA-DR4 tetramer ملزمة بعد 4 أسابيع من الثقافة في المختبر ^- مزارع الخلايا T نسيلي من التدفق الخلوي CD5 معزولة ⁺ CD14 ^- CD19. واستخدمت خلايا غير المسماة Tetramer باعتباره مضان ناقص واحد للتحكم في إقامة النابضة للخلايا tetramer ^+.

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This diversity in the T cell response impairs the ability to examine the biochemistry of pMHC ligand recognition driving alloreactive T cell responses. The standard solution to this challenge has been to generate clonal T cell lines through repeated stimulation with a given allogeneic cell line and limiting dilution analysis. While this approach is capable of generating clonal T cell lines with a single specificity, it may not reflect the original composition of the oligoclonal response of naive T cells. Additionally, this approach does not directly identify the specific pMHC alloantigen recognized (even narrowing the response to a single HLA molecule still presents the challenge of finding the stimulatory peptide from among the estimated 2x10⁴ endogenous peptides presented under steady-state conditions), complicating biochemical characterization of T cell ligand recognition in alloreactivity.

The protocol presented here utilizes fluorescently-labeled pMHC multimers, magnetic bead enrichment, and flow cytometry cell sorting to identify and isolate human T cells specific for individual allogeneic pMHC ligands. This technique has become a powerful tool for examining antigen-specific T cell responses¹². Our increasing understanding of the highly peptide-specific nature of T cell recognition of allogeneic pMHC complexes^7,8 has enabled us to adapt this approach to the study of alloreactive T cells in both mice¹⁴ and humans¹⁵. This approach uniquely enables examination of the composition of the naive T cell populations that comprise the initial oligoclonal alloreactive response. Furthermore, combination of the pMHC multimer labeling approach with in vitro tissue culture facilitates generation of clonal T cell cultures that can be used to dissect the biochemistry of allogeneic pMHC ligand recognition, a question that cannot adequately be addressed via studying polyclonal T cell responses and is significantly impaired by traditional T cell cloning methods.

Using this approach, it can be expected that T cells specific for a given alloantigen pMHC should be identifiable for isolation and culture. However, the efficacy of this approach is dependent on multiple variables. First, the frequency of T cells from an immunologically naive donor that recognize a single alloantigen pMHC is relatively low (on the order of 1/10³– 1/10⁶) and varies between individuals. The ability to isolate pMHC-specific T cells depends on their abundance, as not all isolated cells will successfully expand to generate clonal cultures. The efficiency of the protocol can be influenced by several factors including the nature of the peptide used and the viability of the cells during preparation and isolation. The success of this technique also requires identification of allogeneic pMHC ligands capable of being re-folded into fluorescently-labeled multimers from recombinantly expressed HLA molecules and synthesized peptides. While there are multiple descriptions in the literature of identified peptides presented by specific HLA alleles, not all peptide re-fold in solution equally well. The efficacy of pMHC re-folding depends on several factors, including peptide length, solubility, and affinity for the MHC peptide binding pocket¹⁶. The ability of pMHC multimers to label antigen-specific T cells is also dependent on the peptide used. The affinity of the peptide for the MHC as well as the affinity of the TCR for the pMHC complex influences the binding of the fluorophore-labeled pMHC multimer. Weak binding can result in low shifts in fluorescence intensity, which can lead to difficulty in identifying antigen-specific cells by flow cytometry. These are significant technical hurdles that can impair the efficient isolation of alloantigen-specific T cells. In addition to these technical limitations, a significant biological caveat to this approach should be noted. T cell binding of pMHC tetramers is limited to TCRs with relatively high ligand affinity. This feature results in excluding T cells with low affinity for a ligand from identification and analysis. This is significant, as these low-affinity T cells are capable of substantial contribution to primary T cell responses¹⁷. However, even with these limitations, the approach described here is an efficient tool for the generation of clonal human T cells with defined antigen specificity. While the focus presented here is identification and isolation of human T cells specific for allogeneic pMHC ligands, the T cell identification, isolation, and culture techniques can be easily adapted to other pMHC specificities.

The authors declare no competing financial interests.

The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).