مكافحة النووية عن طريق فحص الأجسام المضادة التهاب الكبد-2 خلايا

وقد جرت العادة على استخدامها مناعي غير المباشرة (معهد التمويل الدولي) فحوصات للكشف عن الأجسام المضادة للنواة (ANA) في مصل الدم البشري. وجود هذه الأجسام المضادة يمكن أن تساعد في تشخيص الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية (التنمية الزراعية والريفية). يوضح هذا البروتوكول كيفية تنفيذ الفعال للتقنية معهد التمويل الدولي للكشف عن الأجسام المضادة هذه بدقة.

الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم في بيان موقف اختبار ANA ينص على استخدام IIF كأسلوب المعيار الذهبي لفحص ANA ^1. على الرغم من أن معهد التمويل الدولي هو اختبار الفحص ممتازة في أيدي الخبراء، والصعوبات التقنية لمعالجة وقراءة الشرائح معهد التمويل الدولي - مثل تجهيز العمل المكثف الشرائح، قراءة دليل، والحاجة إلى ذوي الخبرة والتقنيين المدربين واستخدام غرفة مظلمة - جعل الأسلوب معهد التمويل الدولي من الصعب احتواؤها في سير العمل، والمختبرات الآلي الحديثة.

الخطوة الأولى والحاسمة تجاه جودة عالية ANA الفحص هو تجهيز الشريحة حذرا. هذا الإجراء هو العمل المكثف، ويتطلب الفهم الكامل لهذه العملية، وكذلك الانتباه إلى التفاصيل والخبرة.

يتم تنفيذ القراءة الشريحة بواسطة المجهر الفلورسنت في غرف مظلمة، ويتم ذلك عن طريق التقنيين المدربين الذين معتادا على أنماط مختلفة، في سياق دورة الخليةومورفولوجية البيني وتقسيم الخلايا. شريطة أن معهد التمويل الدولي هو أول أداة فحص خط التنمية الزراعية والريفية، وفهم الخطوات لتنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية.

مؤخرا، تم تطوير أنظمة التصوير الرقمي للقراءة الآلية من الشرائح معهد التمويل الدولي. هذه الأنظمة، مثل NOVA مشاهدة الآلي نيون مجهر، وقد صممت لتبسيط سير العمل الروتينية معهد التمويل الدولي. عرض NOVA يكتسب ومخازن عالية الدقة الصور الرقمية من الآبار، وبالتالي فصل الحصول على الصور من التفسير؛ وينظر إلى الصور وتفسيرها على شاشات الكمبيوتر عالية الدقة. فإنه يخزن الصور كمرجع في المستقبل، وتدعم تفسير المشغل من خلال توفير البيانات الفلورسنت شدة الضوء على الصور. كما أنه يصنف مبدئيا النتائج بأنها إيجابية أو سلبية، ويوفر نمط الاعتراف للعينات الإيجابية. وباختصار، فإنه يلغي الحاجة إلى غرفة مظلمة، وبأتمتة ويبسط readi معهد التمويل الدولينانوغرام / تفسير سير العمل. الأهم من ذلك، لأنه يزيد من الاتساق بين القراء والقراءات. علاوة على ذلك، مع استخدام الشرائح barcoded، يتم استبعاد أخطاء النسخ من خلال توفير إمكانية التتبع وتحديد عينة إيجابية المريض. هذا يؤدي إلى زيادة تكامل البيانات وسلامة المريض.

الهدف العام من هذا الفيديو هو للتدليل على الإجراء معهد التمويل الدولي، بما في ذلك تجهيز الشريحة، والتعرف على أنماط معهد التمويل الدولي المشترك، وإدخال التطورات الجديدة إلى تبسيط ومواءمة هذه التقنية.

الأجسام المضادة للنواة المدى (ANA) يصف مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة التي تتفاعل مع مكونات نواة الخلية بما في ذلك الحمض النووي والبروتينات وribonucleoproteins ^{1، 2.} الخلية التهاب الكبد-2، مجموعة البروتين الأصلي مع مئات من المستضدات، يوفر ركيزة مثالية للكشف عن ANA ^1. الكشف عن ANA في مصل الدم البشري هو أداة مهمة لفحص أمراض النسيج الضام، ومعهد التمويل الدولي هو الأسلوب مرجعية لANA اختبار ^1. مؤخرا، تم استبدال معهد التمويل الدولي على التهاب الكبد-2 في الخلايا المناعية بعض المختبرات مع مستضد محددة وأساليب متعددة. بسبب المخاوف من نتائج سلبية كاذبة وانعدام الشفافية للأطباء، والكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم شكلت فرقة العمل التي خلصت إلى أن معهد التمويل الدولي باستخدام خلايا التهاب الكبد-2 يجب أن يكون "المعيار الذهبي" لفحص ANA ^1.

نظرا لطبيعة الشخصية للANA الفحص ونوعية التهاب الكبد-2 الخلايا فيtegral إلى تقارير دقيقة واثقة من النتائج. وجود عدد كبير من الخلايا الإنقسامية، مورفولوجيا الخلايا الأمثل، confluency كافية، والتعبير عن مستضدات ذات الصلة أهمية خاصة. يقدم معهد التمويل الدولي والتعرف على نمط كأداة مهمة للمساعدة في تشخيص المريض. فهم أهمية أنماط مختلفة تمكن الأطباء والعاملين في المختبرات المناسبة لأداء اختبار المتابعة لتأكيد التشخيص. على سبيل المثال، يمكن أن يحدث متجانسة نمط ANA بحضور مكافحة dsDNA والأجسام المضادة أو لونين، وربما تترافق مع الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ^3. من الجانب الآخر، وصفت مؤخرا أن يسمى كثيفة نمط الأرقط غرامة (DFS) التي ينظر اليها عادة في ما يصل إلى 12٪ من عينات روتينية، ومعظمها ارتبطت الأجسام المضادة للDFS70. هذه الأجسام المضادة، عندما وجدت في عزلة (دون أخرى ANA بأمراض محددة) لا يرتبط مع الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية <سوب> 4-9. الاختبار التأكيدي بذلك عن الأجسام المضادة لمكافحة DFS70 يمكن أن تساعد في الحد من غير الضروري اختبار رد الفعل، وتقديم وفورات كبيرة في التكاليف، وتخفيف القلق المريض.

بالنظر إلى أن معهد التمويل الدولي هو أول منهجية الفحص للكشف عن الأجسام المضادة الخط، فإنه من الأهمية بمكان أن يفهم كيف للمستخدم اختيار الكواشف وركائز الأنسجة يمكن أن تؤثر على النتائج. منذ تقنية معهد التمويل الدولي هو ذاتي بطبيعتها، فمن المهم أن الكواشف المستخدمة توفير أعلى نوعية النتائج.

هذا الهدف من هذا البروتوكول الفيديو هو تعريف المستخدم مع الخطوات الصحيحة اللازمة لأداء الأسلوب معهد التمويل الدولي، والأنماط الشائعة المرتبطة ANA، وإدخال التطورات الجديدة التي يمكن تبسيط سير العمل وتوحيد النتائج المختبرية.

1. عينة إعداد واختيار الركيزة

1. إزالة الكواشف من التعبئة والتغليف والسماح لكل بند أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد الكواشف وتمييع الأمصال المريض وفقا لإدراج الاتجاه. ملاحظة: يتم barcoded الشرائح NOVA لايت ويمكن دمجها بسهولة في النظم الآلية بالاشتراك مع مختبر نظام المعلومات LIS. يوضح هذا الإجراء تجهيز الشريحة دليل؛ مختبرات إنتاجية عالية، ومع ذلك، قد تختار لمعدات تجهيز الشريحة الآلي.

2. إضافة الضوابط وعينات

1. الاستغناء 1 قطرة من السيطرة الإيجابية و1 قطرة من المراقبة السلبية إلى الآبار الشريحة المناسبة. ماصة 20-25 ميكرولتر من مصل المريض المخفف إلى الآبار المتبقية. معالجة شريحة واحدة في المرة الواحدة.
2. وضع الشريحة (ق) في وعاء تلطيخ مع منشفة ورقية مبللة في القاع. تغطية الحاويات واحتضان الشريحة (ق) لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: سيتم الظروف الرطبةمنع الركيزة من الجفاف. جفاف الآبار يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ مصطنعة. خلال هذه الفترة الحضانة، فإن الأجسام المضادة المناهضة للاسلحة النووية في مصل المريض ربط المستضدات للخلايا التي يتم إصلاحها على كل بئر.
3. بعد فترة الحضانة، شطف المصل باستخدام تيار لطيف من غسل العازلة. من أجل تجنب الإضرار الركيزة ومنع انتقال أكثر من عينات بين الآبار، وزاوية الشريحة قليلا لتجنب توجيه تيار مباشرة على الآبار. الاستفادة من غسل العازلة الزائدة ووضع الشريحة في جرة Coplin تحتوي على غسل العازلة لحوالي 5 دقائق.

3. إضافة نيون الاقتراني

1. واحدا تلو الآخر، وإزالة الشرائح من غسل العازلة والاستفادة بلطف لإزالة غسل العازلة الزائدة. تطبيق 1 قطرة من المكورات فلوري (FITC المسمى مفتش مكافحة الإنسان) على كل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في حاوية مرطب، وتأكد من استبدال تلطيخغطاء الحاوية. ملاحظة: للحصول على اختبار ANA، فمن المستحسن استخدام وسيلة محددة المكورات مفتش لكرة القدم. والمكورات هو الحساسة للضوء، وسوف غطاء حماية الشرائح من التعرض للضوء، بالإضافة إلى الحفاظ على البيئة مرطب. خلال هذه الفترة الحضانة، فإن المكورات ربط الأجسام المضادة المناهضة للاسلحة النووية المريض التي منضما إلى مستضدات الخلية. هذه المكورات نتائج ملزمة بحضور مضان في الآبار.
2. شطف وغسل الشريحة كما هو موضح أعلاه.
3. وضع ساترة على منشفة ورقية وتطبيق تصاعد المتوسطة في خط متواصل إلى الحافة السفلى من ساترة.
4. إزالة كل شريحة من غسل العازلة والاستفادة من الشريحة بلطف لإزالة غسل العازلة الزائدة. لمس الحافة السفلية من الشريحة إلى حافة ساترة.
5. خفض بلطف الشريحة على ساترة في مثل هذه الطريقة التي المتوسطة المتزايدة على ساترة يتدفق إلى الحافة العلوية من الشريحة دون تشكيل فقاعة الهواء. ملاحظة: التعاونverslipping، بما في ذلك استخدام كمية الأمثل للتصاعد المتوسطة، هو الاسلوب الذي يأخذ الممارسة لاتقان.

4. تحديد النتائج الإيجابية والسلبية

دليل تفسير

1. عرض الشرائح مع المجهر الفلورسنت، وتقع في غرفة مظلمة. تنفيذ مسح البئر بالكامل مع الهدف 20X 25X أو لتقييم توزيع الخلايا وتوحيد مضان
2. التبديل إلى الهدف 40X لجعل التفسير النهائي بشأن الإيجابية والنمط.
3. ننظر إلى الضوابط الإيجابية والسلبية. الإيجابية الصف باستخدام مقياس الدرجات تفاعل من 1 إلى 4 + +. ملاحظة: سيطرة سلبية قد لا تظهر مظلمة تماما، ولكن في كثير من الأحيان عرض مضان غير محدد مستوى منخفض. فإن السيطرة الإيجابية عرض التفاح مشرق مضان أخضر في النواة (الشكل 1).

التفسير الآلي

ملاحظة: في additiإلى تفسير مختصر، تحميل الشرائح وتفحص بواسطة NOVA مشاهدة الآلي الإسفار مجهر أو غيرها من أداة التصوير الرقمي الآلي؛ لا غرفة مظلمة هو ضروري. بعد إنشاء المشروع عن طريق تحديد نوع الشريحة المناسبة، يكتسب الصك ومخازن عالية الدقة الصور الرقمية من الخلايا في كل بئر. بالإضافة إلى ذلك، عرض NOVA يقيس شدة الضوء الفلورسنت، ويصنف النتائج بأنها إيجابية أو سلبية، ويوفر نمط الاعتراف للعينات الإيجابية. يتم عرض الصور من قبل المشغل على جهاز الكمبيوتر عالية الدقة، مما يتيح للالتفسير النهائي، ومراجعة وتأكيد NOVA عرض نتيجة. يمكن أن تتولد تقارير عن النتائج المؤكدة. وينبغي استخدام المجهر الرقمي بالتعاون مع فني مختبر من ذوي الخبرة لأنه معد للمساعدة في تفسير النتائج.

عند تقييم نتائج تلطيخ خلية لالتهاب الكبد-2، خمسة أنماط النووية الكبرى هي الأكثر شيوعا: متجانسة، الأرقط، السنترومير، نويي، والنقاط النووية. هذه الأنماط هي نتيجة الأجسام المضادة ملزمة للهيئات المكونة محددة من النواة. على الرغم من أن اختبار ANA غير محددة لهياكل النووية، ويمكن أيضا أن يلاحظ أنماط حشوية المرتبطة الأجسام المضادة ضد الهياكل حشوية. في بعض الحالات، قد يكون العديد من الأجسام المضادة الموجودة في العينة، ويمكن أن تظهر الصورة باعتبارها نمط مختلط.

هناك غيرها، لاحظ كثير من الأحيان أقل، وغالبا ما أنماط محددة دورة الخلية التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأسلوب معهد التمويل الدولي؛ مؤخرا، وقد وصفت ما يسمى كثيفة نمط الأرقط مع غرامة أهمية سريرية خاصة في بعض الأمصال إيجابية ANA.

نمط متجانس

لتحديد نمط متجانس، تفحص جيدا وتحديد الإنقسامية أو الفاصلالخلايا. لونين مكثف من الخلايا الإنقسامية (الشكل 2، البرتقال السهم) يسلك الصلبة، مضان موحدة والتي غالبا ما تكون أكثر وضوحا مما كانت عليه في خلية يستريح nuclei.In نمط متجانس، ويستريح الخلايا المعرض موحدة، مضان منتشر للنواة بأكملها (الشكل 2، السهم الأبيض). هذا النمط مميزة وغالبا ما يكون نتيجة لأجسام مضادة لمكافحة dsDNA ^و10.

نمط الأرقط

في نمط الأرقط الخشنة، تظهر الخلايا الإنقسامية أي تلطيخ للمناطق الكروموسومات المختصرة (الشكل 3، البرتقال السهم). الخلايا الحبيبية مضان يستريح تظهر في جميع أنحاء نواة بأكملها. والتنقيط النووية يمكن تعريفها بأنها الخشنة أو الغرامة. نمط التنقيط الخشنة وغالبا ما يكون نتيجة لمكافحة-SM ومكافحة RNP ^11.

في نمط الأرقط غرامة، تظهر الخلايا يستريح التنقيط الغرامة أو منتشر في جميع أنحاء نوى، وعادة في زي دistribution (الشكل 4، السهم الأبيض). نمط الأرقط غرامة وغالبا ما يكون نتيجة لمكافحة SSAand مكافحة SSB ^12.

الكثيفة مبقع الجميلة نمط

من المسلم به الآن أن كثيفة نمط الأرقط غرامة (DFS) هو أمر شائع في الفحوصات الروتينية، وبقدر 12٪ من العينات إيجابية لمكافحة الأجسام المضادة DFS70. ومع ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة، عندما وجدت في عزلة، لا يرتبط مع الأمراض الروماتيزمية المناعة الذاتية الجهازية ^{4 -6.} هذه الأجسام المضادة هي السائدة في الأفراد والمرضى واضعة أمراض لا علاقة لها التنمية الزراعية والريفية ⁶ صحية. الاختبار التأكيدي لأجسام مضادة لمكافحة DFS70 يمكن أن تساعد في الحد من غير الضروري اختبار رد الفعل، وتقديم وفورات كبيرة في التكاليف، وتخفيف القلق المريض.

منذ نمط DFS من الصعب تحديد وANA الإيجابية يمكن أن يسبب القلق لكل من المرضى والأطباء، فمن المستحسن للغاية لإجراء اختبار تأكيدي بعد identi fying نمط موح من الأجسام المضادة المقاومة للDFS70 لتوضيح الأهمية السريرية لANA positivty ^5،6.

في هذا النمط، والخلايا الإنقسامية (الشكل 5 والبرتقالي السهم) تظهر تلطيخ إيجابية الأرقط من لونين الطورية، في حين يستريح نواة الخلية (الشكل 5، السهم الأبيض) المعرض بقع غرامة وزعت بشكل موحد في جميع أنحاء النواة.

السنترومير نمط

لتحديد نمط السنترومير، مسح الآبار وتحديد الإنقسامية أو تقسيم الخلايا. في الخلايا الإنقسامية (الشكل 6، البرتقال السهم)، وهذه البقع تصبح منفصلة مرتبطة ارتباطا وثيقا في ما غالبا ما يوصف بأنه "شريط الطورية". في نمط السنترومير، ويستريح الخلايا (الشكل 6، السهم الأبيض) تظهر ما يقرب من 40-60 بقع منفصلة موزعة في جميع أنحاء نوى. نمط السنترومير هو نتيجة لمكافحة CENP A، B، C الأجسام المضادة ^13.

وترتبط بعض أنماط نويي مع تلطيخ حشوية منتشر في الخلايا الإنقسامية (الشكل 7، البرتقال السهم) والمنطقة الكروموسومات السلبية، في حين عرض أنماط أخرى nucleolear تلطيخ إيجابية في المنطقة الكروموسومات. ويرتبط هذا النمط نويي مع تلطيخ متجانسة أو الأرقط من نويات (الشكل 7، السهم الأبيض)، جنبا إلى جنب مع ضعف الأرقط أو تلطيخ متجانسة من جبلة النواة. وترتبط هذه الأنماط مع مكافحة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثالث، ومكافحة fibrillarin، anti-Th/To وanti-PM/Scl الأجسام المضادة ^14،15.

دوت النووية نمط

ويرتبط نمط نقطة النووية مع الخلايا السلبية الطورية الإنقسامية (الشكل 8 والبرتقالي السهم) ومع عدد قليل من بقع منفصلة في نواة الخلية يستريح (الشكل 8، السهم الأبيض). هذا النمط مميزة وغالبا ما يكون نتيجة لSP-100، الرابطة الاسلامية، أو P80 الأجسام المضادة كولن. هذه الأجسام المضادة هي على النحو sociated مع التشمع الصفراوي الابتدائي والتهاب الكبد الذاتية ^16.

. الرقم 1 السيطرة السلبية (إلى اليسار): خلايا عرضه انخفاض مستوى مضان غير محددة، ولكن لا تلطيخ النووية الرقابة المحددة الإيجابية (اليمين): عرض خلايا التفاح الأخضر مضان النووية.

الشكل 2. نمط متجانسة. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر مضان الصلبة. تظهر الخلايا يستريح حتى، وتلطيخ منتشر (whitearrow).

"العرض =" 500 "/>
الرقم 3. الأرقط الخشنة النمط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ السلبية. تظهر الخلايا يستريح وصمة عار الأرقط متميزة (السهم الأبيض).

الشكل 4. نمط الجميلة الأرقط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ السلبية. تظهر الخلايا يستريح على تلطيخ الأرقط غرامة متميزة (السهم الأبيض).

الرقم 5. الكثيفة نمط غرامة الأرقط. الخلايا الميتوزى (السهم البرتقالي) تظهر تلطيخ الصلبة الحبيبية غرامة. تظهر الخلايا يستريح غرامة جدا، وصمة عار الأرقط منتشر (whitearrow).

ogether.within صفحة = "دائما">
الرقم 6. نمط السنترومير. الخلايا الميتوزى (orangearrow) عرض موحد، بقع منفصلة. يستريح الخلايا (whitearrow) يظهر بقع منفصلة 40-60 في نواة الخلية.

الرقم 7. نمط نويي. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر مجموعات كبيرة اعتبارا من تلطيخ الحبيبية. يستريح الخلايا nucleishows مضان في نويات (whitearrow).

الرقم 8. نمط نقطة النووية. الخلايا الميتوزى (orangearrow) تظهر سلبية. تظهر الخلايا يستريح بضع discrبقع مؤسسة التدريب الأوروبية في النواة (whitearrow). بالإضافة إلى ذلك، فإن نمط نقطة nucelar يمكن أن تتعايش مع تلطيخ حشوية المرتبطة الأجسام المضادة لمستضدات الميتوكوندريا (السهم الأحمر).

Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.

To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.

In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.

Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.

المؤلفين غابرييلا Lakos، كاساندرا براينت، كارول بوخنر، وآنا اسلامي هم موظفون من INOVA التشخيص.

نشكر كاساندرا براينت لأداء التجربة معهد التمويل الدولي وكارول بوخنر لها الاستعراض التقني الخبير.