رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام

وقد اكتسب تتبع من الخلايا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي اهتمام ملحوظا في السنوات الماضية. يصف هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الجذعية مع الفلور ( ¹⁹ جزيئات F) الغنية، وتطبيق في الجسم الحي من هذه الخلايا، ورصد مدى هجرتهم إلى العقدة الليمفاوية استنزاف مع ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي و ¹⁹ F MRS.

التقدم المستمر في طرائق التصوير موسع مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) قد تحسنت بشكل كبير قدرتنا على دراسة العمليات الفيزيولوجية المرضية أو في الكائنات الحية. التصوير بالرنين المغناطيسي يثبت أيضا أن يكون أداة قيمة لالتقاط الخلايا التي تم زرعها في الجسم الحي. استراتيجيات التوسيم الخلية الأولي للتصوير بالرنين المغناطيسي استخدام مصنوعة من عوامل التباين التي تؤثر في اوقات الاسترخاء MR (T1، T2، T2 *) ويؤدي إلى تعزيز (T1) أو نضوب (T2 *) من إشارة حيث الخلايا المسمى موجودة. T2 * وكلاء تعزيز مثل الصغر وكلاء أكسيد الحديد (USPIO) وقد استخدمت لدراسة الهجرة الخلية والبعض أيضا قد وافقت عليه ادارة الاغذية والعقاقير لالتطبيق السريري. والعيب من T2 * وكلاء هو صعوبة التمييز بين الانقراض إشارة إنشاؤها بواسطة الخلايا المسمى من التحف الأخرى مثل جلطات الدم، نزيف الدقيقة أو فقاعات الهواء. في هذه المقالة، ونحن تصف تقنية ناشئة لخلايا الجسم الحي تتبع في ذلكويستند على وصفها الخلايا مع الفلور (F ¹⁹⁾ الغنية الجسيمات. وتعد هذه الجسيمات عن طريق الاستحلاب المشبعة (PFC) مركبات وتستخدم بعد ذلك إلى خلايا التسمية، التي لاحقا يمكن تصوير بنسبة ¹⁹ F التصوير بالرنين المغناطيسي. مزايا هامة من الهيدروكربون المشبع بالفلور لتتبع خلية في الجسم الحي ما يلي: (ط) عدم وجود الكربون محدد ¹⁹ F في الجسم الحي والتي ينتج عنها بعد ذلك خالية من الصور الخلفية وكاملة خلية selectivityand (II) إمكانية لقياس إشارة الخلية بنسبة ¹⁹ F MR الطيفي .

تتبع من الخلايا في الجسم الحي هو جانب هام في عدة مجالات الطب الحيوي. لهذا، وتقنيات التصوير موسع التي يمكن توطين بشكل انتقائي خلايا على مدى فترة من الوقت هي قيمة للغاية. قبل وضع ثلاثي الأبعاد التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تتبع هجرة الخلايا المناعية اقتصر على التحليلات المجهرية أو الخزعات النسيجية. وقد اكتسب تتبع الخلية بمساعدة التصوير بالرنين المغناطيسي الاهتمام هائلة في السنوات القليلة الماضية، ليس فقط بالنسبة للمناعة دراسة سلوك الخلايا المناعية في الجسم الحي، ولكن أيضا للباحثين الخلية الجذعية السريرية و. خلال منتصف 90s، أولى الدراسات على أكسيد الحديد النانوية ¹ شرعت في سلسلة من التطورات لخلايا تتبع مع ​​التصوير بالرنين المغناطيسي. جسيمات أكسيد الحديد تقصير وقت الاسترخاء MR (T2 *) من الخلايا المسمى وبالتالي تسبب نضوب إشارة في صور الرنين المغناطيسي. وقد استخدمت جسيمات أكسيد الحديد لالضامة التسمية ^2، ص دبقية قليلة التغصنrogenitors ³ والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. كما تم الموافقة سريريا بعض هذه الجسيمات من قبل ادارة الاغذية والعقاقير لوصفها اللقاحات الخلوية في مرضى سرطان الجلد ^4. منذ ذلك الحين في الجسم الحي أو وضع العلامات فيفو السابقين الخلايا مع جزيئات أكسيد الحديد تعتمد على تقصير من * إشارة T2 ويمكن رفع هذا الأخير أيضا حول من قبل في الجسم الحي المتصلة قابلية T2 * تأثيرات مثل ينزف الصغرى، رواسب الحديد أو فقاعات الهواء، قد يكون من الصعب تحديد الخلايا المسمى في الجسم الحي من خلفية أخرى T2 * انقراض إشارة ^5.

في هذه المقالة، ونحن تصف تقنية لتتبع الخلايا الجذعية (DC) في الجسم الحي من خلال توظيف ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وقدم هذه التكنولوجيا تتبع الخلية فقط في عام 2005 ^6، وبعد عدة سنوات من تطبيقات أقر لأول مرة لمدة ¹⁹ F في التصوير بالرنين المغناطيسي قد تم الإبلاغ عن ^7. واحدة أدفا هامةntage من ¹⁹ F أكثر من أكسيد الحديد الجسيمات وسم الخلية هو وقوع البيولوجي منخفض من ¹⁹ F في الأنسجة، وهذا يجعل من الممكن لتعقب الخلايا بشكل انتقائي جدا مع الصور مجانا خلفية أساسا. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن تراكب ¹⁹ F MR إشارة من الخلايا المسمى المزروعة مع الصور التشريحية التقليدية 1H تم الحصول عليها من التصوير بالرنين المغناطيسي. ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي هو بالتالي ذات الصلة إلى حد كبير لدراسات الهجرة التحقيق خلية في الجسم الحي. وصفت الخلايا درس مع هذا الأسلوب مع ¹⁹ الجزيئات F الغنية. المشبعة صناعيا المستمدة بالفلور التي تتكون أساسا من الكربون وذرات الفلور وتستخدم عادة لتحضير جسيمات. هذه المركبات هي غير قابلة للذوبان في الماء، وتحتاج إلى مستحلب قبل تطبيق في المختبر أو في الجسم الحي. حجم المعتاد للجسيمات PFC التي استخدمت من قبل مجموعات أخرى لفي الجسم الحي ¹⁹ التجارب تتبع F-MRIيتراوح بين 100 نانومتر و 245 نانومتر ^6،8-10. ومع ذلك أظهرنا أن كفاءة في وسم الخلايا الجذعية مع perfluoro-15-تاج-5-الأثير (PFCE) زيادات جزيئات مع زيادة حجم الجسيمات (> 560 نانومتر). ¹¹

يجب الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية المحلية قبل التنفيذ. خلال قياسات MR مستوى كاف من التخدير والرصد الفسيولوجي (درجة حرارة الجسم ومعدل التنفس) هي المتطلبات التي لا غنى عنها.

1. جيل من الفأر نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية

1. استخراج خلايا نخاع العظام من C57BL / 6 الفئران كما هو موضح سابقا ^12. هذا البروتوكول يعود إلى عام 1992 ¹³ و وصفت في الأصل من قبل مجموعة من رالف ستينمان M. (1943-2011)، مكتشف الخلية الجذعية ^14.
2. لفترة وجيزة، واستخراج الظنبوب والشظية قريبا بعد التضحية الفئران. تعمل تحت غطاء تدفق الصفحي (لمنع التلوث الميكروبي)، بمسح نخاع العظام في طبق بتري الصغيرة مع المتوسطة غسل (FBS 5٪، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، و 1٪ HEPES في RPMI) ^12.
3. نقل تعليق الخلية من خلال سترا الخليةINER (100 ميكرون حجم فتحات الشباك، النايلون) في أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل من أجل إزالة العظام والأنسجة متبقية. بعد عدة خطوات غسل وخطوة تحلل ^12، عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الزرقاء وعدادة الكريات.
4. Resuspend خلايا نخاع العظام بتركيز 400،000 الخلايا مل ^-1 في مستنبت (RPMI تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، HEPES 1٪ و 1٪ L-الجلوتامين) التي تحتوي على 75 نانوغرام مل ^-1 من محببة الماوس عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MGM-CSF) تم الحصول عليها من supernatants من 293FT الخلايا كلوة الجنين البشري transfected مع لGMCSF الماوس البلازميد. نقل 10 مل من تعليق خلية (4 × 10 ⁶ خلايا) في أطباق بتري (100 ملم × 20 ملم)، واحتضان في حاضنة CO ₂ (37 درجة مئوية، 5٪ CO _2). في اليوم 3، تجديد المتوسطة القديمة مع الطازجة المتوسطة 10 مل (حفظ تركيز نهاية MGM-CSF في 75 نانوغرام مل ^-1). في يوم 6، وإزالة 10 مل من المتوسط ​​القديمة وتجديدمع 10 مل المتوسطة الطازجة (MGM-CSF تركيز نهاية = 75 نانوغرام مل ^-1). في يوم 8، وإزالة 10 مل من المتوسط ​​القديمة وتجديد مع 10 مل المتوسطة الطازجة (MGM-CSF تركيز نهاية = 150 نانوغرام مل ^-1).
5. في يوم 10، وناضجة في العاصمة متباينة مع 1 ميكروغرام مل ^-1 عديد السكاريد الشحمي (LPS) لمدة 24 ساعة.

2. وسم الخلايا الجذعية مع ¹⁹ F الجزيئات الغنية

1. خلال الخطوة نضوج ساعة 24 (1.5)، وتسمية العاصمة مع 1 ملي الغنية الفلور perfluoro-15-تاج-5-الأثير (PFCE) الجسيمات (500-560 نانومتر) أيضا لمدة 24 ساعة. إعداد الجزيئات الكبيرة الفلور وصفت من قبل الاستحلاب PFCE في بلورونيك F-68 (مجموع حجم 2.5 مل) باستخدام خلية المخل التيتانيوم sonotrode وتوظيف برنامج نبض المستمر (سعة 100٪، الطاقة = 250 W) لمدة 60 ثانية.
2. باتباع الخطوات الحضانة أعلاه، حصاد DC ناضجة والفلور المسمى باستخدام زراعة الأنسجة الخلية مكشطة، ونقل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل وأجهزة الطرد المركزيفي 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. ليغسل أي جزيئات بقايا الخلايا الميتة و، وترك الخلايا تحصد التمسك على أطباق بولي-L-يسين. للتحضير لهذه الخطوة، أطباق بتري مع معطف بولي-L-يسين (1 ملغ مل ^-1) في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ويغسل بعد ذلك قبالة غير منضم بولي-L-يسين مع برنامج تلفزيوني.
4. احتضان الخلايا تحصد أعلاه على لوحات بولي-L-يسين المغلفة في المصل خالية المتوسطة وتسمح للخلايا على الانضمام (1 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2).
5. يغسل المتوسطة لتجاهل الخلايا غير ملتصقة، والجسيمات المتبقية والخلايا الميتة ويغسل ثلاث مرات مع مرحلة ما قبل حرارة (37 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني.
6. حصاد الخلايا الملتصقة بواسطة التربسين EDTA-العلاج (0.25٪ التربسين EDTA-، 3 دقائق الحضانة عند 37 درجة مئوية).
7. بعد آخر خطوة الطرد المركزي يغسل، resuspend والمبلغ المطلوب من العاصمة ناضجة في المصل خالية برنامج تلفزيوني العقيمة.
8. لتحديد ما إذا كانت الخلايا وقد وصفت بنجاح، فمن المستحسن للتحقق من physicocheالخصائص mical من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي (FACS). يجب مبعثر sideward (SSC) تكشف زيادة تحبب في هذه الخلايا، كما هو موضح سابقا ^11. ينبغي أن يوضع في الاعتبار أيضا أن الخلايا الليفية قد تلوث الثقافات DC ويمكن أيضا تناول الجزيئات F ¹⁹ بشكل متواز. ولذلك ينبغي تقييم نقاء DC (عن طريق قياس نسبة CD11c ^و+ CD11b ⁺ الخلايا باستخدام FACS) قبل تطبيق في الجسم الحي.

3. في التطبيق فيفو من ¹⁹ الخلايا الجذعية F المسمى

1. إدارة العاصمة ⁽¹⁰ يونيو - 10 يوليو) في حجم 50-100 ميكرولتر intracutaneously في الأطراف الخلفية من الفأرة C57BL / 6 عن طريق وضع الماوس في حامل وإدراج بعناية ½ 26 إبرة G في الطبقات العليا من الجلد قبل تطبيق (استخدام 0.5 مل المحاقن مع الإبر السلين بشكل دائم المرفقة لتقليل حجم القتلى). لضمانن تطبيق أدمي المناسبة، فمن المهم أن الجزء المدرج من الإبرة تكون مرئية جزئيا تحت الجلد. إذا كانت إبرة غير مرئية أي أكثر من ذلك، تم إدراج إبرة عميق جدا في طبقات الجلد. بالنسبة للفرد غير مدربين، ويمكن أن يتم تنفيذ التطبيق داخل الجلد تحت التخدير.
2. صورة أطرافه من قبل في الجسم الحي الفلور (F ¹⁹⁾ / بروتون ⁽¹ H) التصوير بالرنين المغناطيسي (انظر القسم التالي) 21 ساعة التالية الحقن.

4. في فيفو ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي

تعليمات مفصلة لإعداد بالاشعة MR تشير إلى MR الماسح الضوئي بروكر باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة Paravison (الإصدار 5.1). وقد تم تسليط الضوء أسماء اشارة الى وظائف وبنود محددة بائع بخط مائل. عن الماسحات الضوئية MR أخرى قد يكون لهذه الخطوات التي ينبغي تعديلها وفقا للمبادئ التوجيهية التي والصانعين.

1. ترتيب الوصول إلى متخصصالحيوانات الصغيرة MR الماسح الضوئي. للحصول على جودة الصورة كافية، نظام مع قوة المجال المغناطيسي 9.4 تسلا أو أكثر ومصممة لفائف الترددات الراديوية (على سبيل المثال ¹ H / F ¹⁹ ثنائي الانضباطي لفائف حجم RF، 35 مم القطر الداخلي، 50 مم طول؛ السريع بيوميد، فورتسبورغ، ألمانيا) ويوصى.
2. قبل التصوير بالرنين المغناطيسي، وإعداد الإعداد من ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي للتخدير والرصد الفسيولوجية. تأكد من أن قناع التنفس من السرير / صاحب الحيوان يتم توصيلها إلى نظام isoflurane و، والتي ترتبط في التحقيق في درجة الحرارة والتنفس وسادة لنظام مراقبة الحيوانات عن بعد (على سبيل المثال نموذج 1025 SA الادوات شركة، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). يقدم هذا الأخير لمراقبة المعلمات الحيوية الحيوان مثل درجة حرارة الجسم والتنفس.
3. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الخدر باستخدام غرفة الماوس متصلا نظام isoflurane و. ضبط معدل تدفق الهواء وO ₂ في 0.2 L ^-1 دقيقة و 0.1 لتر دقيقة ^-1، على التواليو 3٪ isoflurane و(معدلة من المرذاذ) لمدة 2 دقيقة حتى المستوى المطلوب من التخدير يتم التوصل (أي رد التالية قرصة أخمص القدمين). قد تختلف معدلات التدفق الأمثل اعتمادا على الإعداد المستخدمة. كن على علم بأن معدلات تدفق عالية قد يؤدي إلى الجفاف. مطلوب الرصد الدقيق لأوضاع الحيوانات في جميع الأوقات على النحو المذكور أعلاه.
4. ضع الماوس عرضة على السرير الماوس / حامل من الحيوانات الصغيرة MR الماسح الضوئي (الشكل 1).
5. مع الحفاظ على معدل تدفق الهواء وO ₂ ثابت، وضبط المرذاذ isoflurane وإلى 0،8-1،5٪ حتى يتم التوصل إلى نمط التنفس الأمثل. ويوصى 70 نفسا في الحد الأدنى - A معدل التنفس من 50.
6. الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 36-37 درجة مئوية خلال التجربة من خلال استخدام الماء الدافئ (أو الهواء الدافئ بدلا من ذلك) نظام الدورة الدموية.
7. إبقاء أعين رطبة الفأر مع مرهم معقم التشحيم العين أثناء عملية القياس.
8. بعد الحصول على حيوانعلى حامل التصوير والاتصالات إلى نظام الرصد، ونقل لحاملها وسط ¹ H / F ¹⁹ لفائف RF (التي يتم المتمركزة على مركز التساوي من المغناطيس الماسح الضوئي الحيوان).
9. تعيين موضع الماوس بحيث الركبة يقع ضمن مركز التساوي من المغناطيس، إما مع وسيلة الآلي (على سبيل المثال باستخدام الليزر لتحديد المواقع جنبا إلى جنب مع صاحب الحيوان بالمحركات) أو عن طريق حساب المسافة يحتاج لحاملها يتم نقل يدويا في مغناطيس للوصول إلى مركز التساوي.
10. لتأكيد تحديد المواقع الصحيحة للحيوان في الماسح الضوئي والتخطيط في وقت لاحق للهندسة شريحة صورة (أي حجم، موقف والتناوب في الفضاء)، واكتساب الكشفية الصور في ثلاثة توجهات القياسية (محوري، الاكليلية، السهمي) باستخدام بسرعة وانخفاض دقة وضوح الصورة طرق اكتساب (على سبيل المثال TriPilot البروتوكول، والذي يستخدم تسلسل نبض FLASH).
11. ضبط لفائف RF إلى ¹ H صدى تردد (على سبيل المثال. 400.1 ميغاهرتز لل9.4 T) وتردد صدى ¹⁹ F (على سبيل المثال 376.3 ميغاهرتز لل9.4 T) وتتطابق مع خاصية مقاومة من لفائف إلى 50 أوم باستخدام جهاز ضبط للMR الماسح الضوئي الحيوان. ضبط ومطابقة أمر ضروري لتحقيق الظروف المثلى لنقل واستقبال الإشارات.
12. أداء ما يلزم من إعدادات النظام الآلي بما في ذلك الملئ إلى صقل تجانس الحقل المغناطيسي للأرض (على سبيل المثال ADJ_SHIM)، والتعديلات تردد نظام لضبط الترددات اللاسلكية لتردد امور من الفأرة (على سبيل المثال ADJ_SF) وكسب إشارة إلى ضبط السعة RF ( على سبيل المثال ADJ_REFG). كل هذه الإعدادات هامة لجعل ثابت ومتغير الحقول المغناطيسية (B _0، ب ₁₎ في المنطقة من اهتمام ومتجانسة قدر الإمكان.
13. الحصول على المجموعة الثانية من الصور الكشفية (على النحو الوارد أعلاه) على طول التوجهات متعامد ثلاثة، بعد أن ضبط مجال الرؤية (فوف) بحيث كلا الطرفين السفليين عالبريد المرئي من الحوض إلى القدم (طول = 50x25x25 مم). هذه الصور تعمل على التخطيط لتوجهات النهائي 3D ¹ H / F ¹⁹ بالاشعة.
14. إعداد بروتوكول 3D TurboRARE ^ل1 H-المسح الضوئي: TR / TE = 1،500 / 53 ميللي ثانية، FOV = 50x25x25 مم، مصفوفة = 400X200X200، عامل نادر = 16 (. وقت الفحص تقريبا 60 دقيقة). ضبط مجال الرؤية مع مساعدة من الصور الكشفية، بدء الفحص (حركة الضوء).
15. تحميل نبض واحد ااا تسلسل مع TR من 1،000 على الأقل ميللي ثانية. فتح تحرير المسح الضوئي وتعيين نواة ^ل19 F. استخدام إعدادات مكسب دليل من خلال إلغاء المكسب إشارة تلقائي في طريقة تحرير من مربع الأدوات.
16. بدء قياس دون تسجيل البيانات لعرض إشارة MR في الوقت الحقيقي باستخدام نظام الأفضليات المعمم (اذهب الإعداد). إذا كان ¹⁹ F إشارة الطيفية ضمن إطار اكتساب منخفضة جدا، إضافة المزيد من المتوسطات في تحرير الأسلوب و / أو تعدل نبض المخفف (TX0 أو SP0 المنزلق) حتى سيgnal مرئيا بوضوح. ضبط التردد الأساسي من أجل مركز ذروة ¹⁹ F الطيفية في 0 هرتز في إطار الاستحواذ. تطبيق تردد الأساسية وإيقاف الصحافة. لاحظ أن isoflurane واستخدام التخدير قد تولد إشارة الخلفية. في 9.4 تسلا MRI التحول الكيميائي بين ¹⁹ الجسيمات المحتوية F-وisoflurane وحوالي 1،800 هرتز. تأكد من أن عرض النطاق الترددي الإثارة أصغر من 3،600 هرتز إلى تجنب إثارة معا isoflurane ومع ^{19 خلية} F المسمى أو جزيئات. يجب تعيين تردد الأساسية بشكل صحيح على إشارة التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا ^F-19 المسمى. بدلا من ذلك، طريقة أخرى من التخدير يمكن أن تستخدم كما يرى المجرب مناسبا.
17. استنساخ (مكررة) بروتوكول 3D TurboRARE من السابق ¹ H المسح الضوئي. انتقل إلى تحرير طريقة وإلغاء كسب إشارة التلقائي (على النحو الوارد أعلاه). تعيين ¹⁹ نواة F من تحرير المسح الضوئي. تغيير المصفوفة إلى 128x64x64ونادر عامل إلى 40 (ما يصل إلى 64) على الأقل. لTR / TE 1،000 / 6 ميللي ثانية و 64 متوسطات، وقت الفحص ما يقرب من 70 دقيقة. تعيين كسب المتلقي إلى 101 (أدوات) وبدء المسح من دون أي تعديلات أخرى باستخدام الحزب الجمهوري (اذهب خط الأنابيب).
18. عندما يتم الانتهاء من عمليات الفحص التراجع عن حامل الماوس من الماسح الضوئي MR. افصل الماوس بعناية من حامل. إذا لم يتم التضحية الماوس لتحليل فيفو السابقين (مثل الأنسجة أو التحليل الطيفي، انظر أدناه) مباشرة بعد القياسات MR، تراقب عن كثب حتى تعافى تماما من التخدير. يتأثر الجسم تنظيم درجة الحرارة عن طريق التخدير، لذلك أثناء عملية الاسترداد، وضع الماوس في قفص منفصل التي يتم وضعها على وسادة دافئة درجة الحرارة التنظيم. مرة واحدة قد تعافى تماما الماوس من التخدير، إعادته إلى القفص القابضة والخمسين وإلى غرفة الحيوانية.
19. لتراكب الصور F ^19-1 H الصور، استخدم القائمة عرض سption على نفس البرنامج (Paravison). وظيفة البطانة يمكن العثور عليها تحت متلازم. حفظ الأساس الذي تقوم عليه، تحميل صورة جديدة وتسليط الضوء على طبقة F ¹⁹ عن طريق تحديد لون جديد من نظرة متابعة الجدول. على التمييز بين F ¹⁹ و ¹ بالاشعة H، يغير عتبة للون المختار (خفض نظرة متابعة الجدول) مثل أن إشارة F ¹⁹ سوف يكون اللون المختار والخلفية ¹ صورة H ستبقى في الرمادي. برامج مرحلة ما بعد المعالجة الأخرى (مثل يماغيج) متاحة لإنشاء ¹ H / F ¹⁹ تراكب الصور.
20. يجب على القياس الكمي في الجسم الحي للإشارة F ¹⁹ يكون من الضروري، واتباع بروتوكول كمية بسيطة كما هو موضح سابقا ^15،16. وباختصار، يمكن أن يتم التحديد الكمي عن طريق وضع أنبوب المرجعية مع تركيز معروف من PFCE فرقت داخل مجال الرؤية بجانب الماوس. بعد الحصول على MR الصور، تشيوانtify شدة من الإشارات F ¹⁹ باستخدام المنطقة من الفائدة (ROI) تحليل ومقارنة لفي المختبر منحنى المعايرة كما هو مبين في الشكل 2.

5. العقدة الليمفاوية الرنين المغناطيسي الطيفي (MRS)

1. بعد التضحية الماوس، وإزالة العقدة الليمفاوية المأبضية ومكان في أنبوب صغير 5 مم NMR وإضافة 100 ميكرولتر من 2٪ PFA.
2. تثبيت ¹⁹ F فائف الطيفي (مثل لفائف حلقية) والذي يحتوي على افتتاح 5 مم على الأقل لعقد أنبوب NMR تحتوي العقدة الليمفاوية.
3. وضع أنبوب NMR داخل لفائف ونقل لفائف في مركز التساوي من المغناطيس.
4. ضبط لفائف الترددات اللاسلكية لتردد صدى F ¹⁹ (على سبيل المثال 376.3 ميغاهرتز لل9.4 T) وتتطابق مع خاصية مقاومة من لفائف إلى 50 أوم باستخدام جهاز ضبط للMR الماسح الضوئي الحيوان. ضبط ومطابقة أمر ضروري لتحقيق الظروف المثلى لنقل وإشارةاستقبال.
5. تعيين كافة المعلمات الرقاقة داخل أدوات الملئ إلى 0 ثم اضغط تطبيق. عادة فإنه ليس من الضروري تطبيق أساليب الملئ منذ حجم العينة صغير نسبيا. إذا كان إشارة كافية F ¹⁹ هو متاح، ويمكن تطبيق الأساليب الآلية لالملئ، تردد النظام وكسب المتلقي كما هو موضح أعلاه.
6. تحميل نبض واحد ااا تسلسل مع TR من 1،000 على الأقل ميللي ثانية. فتح تحرير المسح الضوئي وتعيين نواة ^ل19 F. استخدام إعدادات مكسب دليل من خلال إلغاء المكسب إشارة تلقائي في طريقة تحرير من مربع الأدوات. تعيين عدد من المتوسطات إلى 1.
7. بدء تسلسل باستخدام نظام الأفضليات المعمم. إذا كان ¹⁹ F إشارة الطيفية ضمن إطار اكتساب منخفضة جدا، إضافة المزيد من المتوسطات في تحرير الأسلوب و / أو تعدل نبض المخفف (TX0 أو SP0 المنزلق) حتى إشارة واضحة للعيان. ضبط وتيرة الأساسية بحيث جمعية مهندسي البترول F ¹⁹ذروة ctral هو في وسط النافذة في اكتساب وتطبيق 0 هرتز تردد الأساسية. ضبط نبض المخفف مرة أخرى لتعظيم الإشارة، لتصل إلى 90 درجة الإثارة. عند إشارة في أقصى ستوب الصحافة.
8. تعيين المعدلات في تحرير الأسلوب بين 64 و 256 (أو أكثر إذا لزم الأمر، اعتمادا على إشارة) والبدء في عملية الاستحواذ باستخدام الحزب الجمهوري. إشارة الكشف يرتبط خطيا مع عدد من المتوسطات. خلال القياس الكمي أن نضع في اعتبارنا أن الكشف عن إشارة يحتاج إلى تطبيع إلى متوسط ​​واحد. وعلاوة على ذلك، وهو معيار معايرة تركيز معروف أو منحنى المعايرة هو ضروري لحساب عدد الخلايا من تطبيع ¹⁹ إشارة F (الشكل 2).
9. وبمجرد الانتهاء من المسح الضوئي، وإزالة عينة، ضع عينة المقبل والمضي قدما في الخطوة 5.3.

ثمانية عشر إلى واحد وعشرين ساعة بعد تطبيق أدمي، ¹⁹ الخلايا الجذعية F-المسمى (DC) تهاجر إلى العقدة الليمفاوية المأبضية تجفيف. حركة DC عبر القنوات اللمفاوية في العقدة الليمفاوية politeal استنزاف يمكن أن يكون موضع تقدير من قبل تتراكب ¹ H الصور التشريحية مع ¹⁹ F الصور DC (الشكل 2A). لقد ذكرت سابقا على الهجرة من هذه الخلايا في الجسم الحي، فضلا عن تأثير حجم ¹⁹ F-الجسيمات على DC البيولوجيا المناعية، بما في ذلك كفاءة امتصاص ^11. من أجل قياس مدى هجرة العاصمة إلى الغدد الليمفاوية، ونحن استخراج الغدد الليمفاوية استنزاف وتنفيذ ¹⁹ F MRS (الشكل 2B). عندما نقارن إشارة F ¹⁹ تم الحصول عليها من كل العقدة الليمفاوية مع إشارة F ¹⁹ تم الحصول عليها من أرقام مختلفة من العاصمة المسمى مع جزيئات PFCE نفسه (منحنى المعايرة، الشكل 2C) يمكننا أن نستنتجعدد ¹⁹ F-المسمى DC التي تصل إلى العقدة الليمفاوية استنزاف. في التجربة ممثل هو مبين في الأرقام 2A و 2B، يمكننا أن نستنتج أن 3.6 × 10 ⁵ مستضد محملة DC صلت العقدة الليمفاوية الحق بينما 7.5 × 10 ⁴ DC التي لم يتم تحميلها مع مستضد وصلت العقدة الليمفاوية الحق.

الشكل 1. موقف الماوس على حامل الماوس من الحيوانات الصغيرة MR الماسح الضوئي.

الشكل 2. الكمي ^لل19 F-صفت الهجرة DC في الجسم الحي باستخدام ¹⁹ F MRS. (A) وصفت DC مع 1 ملي 560 نانومتر PFCE particl ES، محملة (يمين) أو بدون (يسار) المستضد وتدار intracutaneously في أطرافه الخلفية. كان يعمل ألبومين البيض من الدجاج الكامل (OVA) كما مستضد؛ وقد حضنت OVA مع DC جنبا إلى جنب مع جزيئات F ^19. وتظهر الخلايا الجذعية ^و19 F MR إشارة (الحمراء)، في حين تظهر الغدد الليمفاوية والقنوات اللمفاوية في ¹ H التشريحية MR صورة (الرمادي). تم الحصول على الصور مع ¹⁹ F / H ¹ حجم ثنائي الانضباطي قفص العصافير مرنان. (B) العقد الليمفاوية من الماوس هو مبين في انتزعت منهم ووضعها في أنبوب NMR. تم قياس إشارة F ¹⁹ بنسبة ¹⁹ F MRS (انظر نص البروتوكول) وحساب السعة عن طريق إجراء التحول فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس) من تسوس التعريفي مجانا المكتسب (ااا). (C) على مدى فترة من 24 ساعة، مختلفة وصفت مبالغ DC مع 1 ملي 560 نانومتر الجزيئات PFCE وتم قياس ¹⁹ إشارة F بنسبة ¹⁹ F MRS كما في B.EF = "https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50251/50251fig2large.jpg" الهدف = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

هذه الطريقة في توظيف ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي لمتابعة حركة العاصمة إلى العقدة الليمفاوية يعطي الفرصة لدراسة أنماط هجرة الخلايا المناعية في الجسم الحي. الخلايا الجذعية هي أمثلة ممتازة للهجرة بسرعة الخلايا المناعية التي تكون قادرة على المناورة من خلال هياكل ثلاثية الأبعاد دون التقيد بإحكام على ركائز محددة ^17. على الرغم من أن القرار المكانية منخفضة (مجموعة ميكرون) من تقنية وصفها ليست قابلة للمقارنة مع ما يمكن تحقيقه مع المجهري multiphoton، مع هذه التقنية عالية الدقة (المدى نانومتر) فإنه لا يزال من الممكن لدراسة طبيعة الهجرة خلية في الجسم الحي وأكثر فترة أطول من الزمن. وعلاوة على ذلك، الفحص المجهري لديه محدودة الاختراق من العمق وحقل محدود من عرض، مما يجعلها غير صالحة حاليا لتصوير مناطق واسعة داخل الكائن الحي.

ونظرا لnoninvasiveness من هذه التقنية، فمن الممكن أن الإثنينitor هجرة الخلايا المناعية لعدة أيام دون التضحية الماوس بعد التحقيق. ميزة أخرى لهذه التقنية هو إمكانية تراكب الصور F ¹⁹ التي تستحوذ على الخلايا المهاجرة مع التشريحية ¹ H بالاشعة، وبالتالي السماح لتوطين دقيقة من الخلايا داخل الكائن الحي. هذه التقنية سوف تمكننا من دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء هجرة العاصمة. خلافا للعادة في فحوصات المختبر الهجرة، وهذه الطريقة تمكن من دراسة الهجرة الخلية في بيئة 3D الفسيولوجية.

منذ فترة طويلة معترف بها التطبيق المحتمل ^لل19 F في MRS والتصوير بالرنين المغناطيسي ^7،18. نسبة gyromagnetic عالية، وتدور عالية وفرة النظائر الطبيعية يجعل F ¹⁹ مرشحا مثاليا لMR التصوير ^7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التشابه بين ¹⁹ F و ¹ H (المتعلقة بالخصائص NMR بهم) هو شرط أساسي للحصول على تراكب ذات مغزى بين رانه التشريحية 1H التصوير بالرنين المغناطيسي مع ¹⁹ F التصوير بالرنين المغناطيسي من الخلايا المسمى. في الواقع ميزة واحدة من ¹ H / F ¹⁹ MRI أكثر من غيرها من ¹ H / X نوى التصوير بالرنين المغناطيسي هو أن نفس RF مرنان يمكن أن تستخدم في كل ¹⁹ F و ¹ H نوى. في معظم التطبيقات المستخدمة لمدة ¹⁹ F / ¹ H التصوير بالرنين المغناطيسي، وبلغ حجم التداول مرنان يعمل التي يمكن ضبطها لكلا ¹⁹ F و ¹ H. ويرجع ذلك إلى متطابقة تقريبا B حقل ₁ لكلا قنوات، نقل إعدادات الطاقة من H قناة ¹ (الذي هو أسهل لقياس) إلى القناة F ¹⁹ هو ممكن لذلك.

أحد العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند وضع العلامات الخلايا مع جزيئات من أي حجم (من صغير جدا إلى جزيئات كبيرة الحجم الصغير) هو احتمال التلاعب البيولوجية والسمية. لقد أظهرنا مؤخرا أن زيادة حجم الجسيمات وصفها، ونحن يمكن أن تعزز حالة نضوج DC ^11. A ممكنشرح لإيجاد لدينا هو رجحان للجسيمات أكبر من 500 نانومتر إلى أن تناولها من قبل البلعمة بدلا من الإلتقام ^19؛ آلية امتصاص السابق تحديد طبيعة DC. يمكن أن الخصائص الفيزيائية الأخرى (مثل شكل الجسيمات وطوبولوجيا السطح) أيضا تغيير الوظيفة البيولوجية للخلايا وصفت وينبغي أيضا النظر بعناية ^20. لأي الإعداد التجريبية بالنظر إلى أن يتطلب وضع العلامات من العاصمة مع الجسيمات، بالتالي فمن المستحسن جدا أن نموذجي المقايسات بيولوجيا الخلية يتم تنفيذها بالتوازي مع تجربة لتحديد / استبعاد أي تأثير الجسيمات على الخواص البيولوجية لهذه الخلايا. عدة فحوصات يمكن القيام بها، اعتمادا على دراسة تجريبية في السؤال. استبعاد تأثير على DC نضوج، والقياسات من علامة سطح الخلية (مثل CD80، CD86) التعبير من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية ويوصى. استبعاد تأثير على امتصاص المستضد والعرض، وخبرة البلعمةينصح iments وT التجارب فتيلة الخلية، على التوالي،. في حالة التجارب الهجرة، والمستقبلات التعبير عن chemokine (CC) (مثل CCR7) والمقايسات الهجرة في المختبر ويوصى.

على الرغم من أن ¹⁹ F / H ¹ MRI يحمل وعدا لدراسة الهجرة الخلية ولا سيما لأغراض السريرية، وهناك حاليا عدد من القيود. وتشمل هذه (ط) القرار المكانية التي تحول دون رؤية مباشرة من الخلايا الفردية، (ثانيا) عدم كفاية حساسية F ¹⁹ (حد الكشف عن العديد من 10 ⁵ خلايا في واحد ROI)، (الثالث) زيادة فترات المسح الضوئي ونتيجة لزيادة في المتوسط ​​للتعويض للقيود السابقة، (الرابع) مجموعة محدودة من ¹⁹ F مرنانات RF في السوق و(V) غير مرغوب فيه ممكن خلفية ¹⁹ إشارة F من قبل غيرها من العناصر التي تحتوي على الفلور مثل (السليكوون) ضمن مكونات الأجهزة MR isofluorane وبولي تترافلوروإيثيلين (مثل المكثفات والكابلات التي تربط).

وبصرف النظر عن عوامل مثل قوة المجال المغناطيسي والقوة والتدرج، واحد المحددات الرئيسية والتي تملي على مستوى القرار المكانية هو حساسية للترددات الراديو (RF) المستخدمة مرنان ^21. ويرتبط قرار التصوير بالرنين المغناطيسي بشكل وثيق لنسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) ²¹ وعلى الحد من حجم فوكسل لتضخيم القرار المكانية، خسارة في SNR هو متوقع. طريقة واحدة لزيادة القرار المكانية دون المساس حساسية إشارة هو استخدام لفائف جثمان المبردة التي تعزز SNR عن طريق الحد من الضوضاء الحرارية ^22. مع المعونة من لفائف الرأس 1H يستخدم نظام المبردة، فإننا لا يمكن تصور مؤخرا تتسرب الخلوية في التهاب الدماغ و النخاع المناعة الذاتية التجريبية بعد استخدام في القرار طائرة من (35x35) ميكرون ^{2 23.} تطبيق هذه التكنولوجيا جثمان المبردة لمدة ¹⁹ F / H ¹ MRI سيكون بمثابة المرجعportunity إلى التغلب على بعض القيود المرتبطة التصوير بالرنين المغناطيسي الكشف عن إشارة الخلية والقرار.

وثمة مسألة هامة للفي تتبع المجراة من الخلايا عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي هو القياس الكمي لهذه الخلايا في مكان معين داخل الكائن الحي. لهذا فمن الممكن لأداء ¹⁹ F MRS (انظر 5،1-5،9). من خلال توظيف منحنيات المعايرة التي يتم الحصول عليها من ¹⁹ F MRS قياسات أعداد مختلفة من ¹⁹ DC F-المسمى، فمن الممكن للاستدلال على عدد من الخلايا يصل إلى العقدة الليمفاوية. يمكن مقارنة ¹⁹ F MRS القياسات من الغدد الليمفاوية إلى ¹⁹ F MRS DC منحنى المعايرة. وعلاوة على ذلك، من خلال مقارنة البيانات MRS من الخلية منحنيات المعايرة DC مع PFCE نقية، يمكننا أن نستنتج أنه من الممكن للكشف عن ما يقرب من 10 ^{13 19} F يدور في الخلية بعد وضع العلامات. وفقا لمبادئ MR، والحد الأدنى هو كشف 10 ¹⁸ يدور في فوكسل ²⁴. وهكذا، يمكننا أن نفترض أننا قادرون على الكشف عن الحد الأدنى لعدد 10 ⁵ DC لكل فوكسل باستخدام 9.4 T التصوير بالرنين المغناطيسي.

وباختصار، فإن البروتوكول الذي وصفنا هنا هو مفيد لفي التحقيقات المجراة دراسة الهجرة الخلية أثناء عمليات المرضية في جسم المريض. وnoninvasiveness من التقنية تمكن دراسات طولية دون الحاجة إلى التضحية أعداد كبيرة من الحيوانات، والقدرة على تراكب ¹⁹ F صور من الخلايا المسمى في ¹ H الصور التشريحية يعزز تتبع الأمثل وانتقائية للغاية من الخلايا المهاجرة، ويوفر ¹⁹ F MRS فرصة لتقدير عدد الخلايا إضفاء الطابع المحلي إلى المناطق التشريحية محددة في الجسم الحي.

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل جمعية الألمانية للبحوث إلى SW (DFG WA 2804) ومنحة الجامعة لSW من مركز البحوث التجريبية والسريرية، وبالتعاون مع مركز ماكس للطب الجزيئي وشاريتيه في برلين كلية الطب ديلبروك. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر السيد روبرت يستفال للحصول على الدعم الفني خلال التدريب له في مختبرنا.