ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة

البروتينات ملزمة الجليد (IBPs)، المعروف أيضا باسم البروتينات التجمد، وتمنع نمو الجليد واعدة هي المضافة لاستخدامها في الحفظ بالتبريد من الأنسجة. الأداة الرئيسية المستخدمة لتحقيق IBPs هو مقياس التناضح نانولتر. وضعنا منزل التصميم مرحلة التبريد التي شنت على المجهر الضوئي والتحكم باستخدام روتين ابفيف مبنية خصيصا. وصف مقياس التناضح نانولتر هنا التلاعب درجة حرارة العينة بطريقة فائقة الحساسية.

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

0. الإجراءات الأولية

1. الزجاج الشعرية للحقن الحل. باستخدام مجتذب الشعرية (Narishige، طوكيو، اليابان)، وإعداد ماصة حاد مع افتتاح غرامة من أنبوب زجاجي الدقيقة الشعرية (الاسم التجاري GMBH، فيرتهايم، ألمانيا). وينبغي التحقق من حجم الفتحة عن طريق تمرير الهواء من خلال الشعيرات الدموية للحصول على السطح الجميلة في المياه النظيفة. إذا تم إغلاق الشعرية، ثم يمكن للمرء أن فتحه عن طريق كسر حافتها. ويمكن تحقيق هذا عن طريق الضغط عليه برفق أو الخدش ضد الماء تحتوي على جدران الأنبوب. إعداد مثل هذه الشعرية التي يتم حظرها تقريبا افتتاح لكن فتح بما يكفي للسماح بتشكيل الفرعي ملليمتر الفقاعات.
2. النحاس تنظيف القرص. يصوتن الأقراص النحاس لمدة 10 دقيقة في 0.1٪ مايكرو-90 الصابون (كول-Parmer، فيرنون هيلز، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية)، ثم تغسل بالماء المقطر مزدوجة. إدخال أقراص إلى حل (التقنية) الأيزوبروبانول ويصوتن مرة أخرى لمدة 10 دقيقة. زعنفةحليف، تجف الأقراص باستخدام الهواء التي تمت تصفيتها. هذه المرحلة الحرجة التنظيف لتجنب تلوث IBP بين التجارب.
3. وقد أعدت الجمعية مزدوج الطبقة ساترة. A الجمعية ساترة للسماح للمراقبة دون تكاثف الرطوبة عينة على غلاف سطح الزجاج. وقد تحقق ذلك من خلال وضع (WA هاموند Drierite، زينيا، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية) Drierite الجسيمات (2 مليمتر في القطر) بين اثنين من coverslips التي تم لصقها ثم بمسدس الصمغ الحار. منع هذا التكوين التي يمكن أن تكثف منع الرأي عندما تم تبريد العينة إلى درجات حرارة منخفضة وإزالة الحاجة إلى ضربة الهواء الجاف على النافذة المراقبة.

1. مجموعة التبريد مرحلة المتابعة

1. ربط مدخل ومخرج تدفق المياه من مرحلة التبريد إلى 4 مم القطر الداخلي Tygon أنابيب (سان جوبان، باريس، فرنسا)، وتوصيل أنبوب تدفق المياه مدخل إلى مضخة المياه.
2. توصيل 4 مم قطر داخلى Tygon أنبوب إلى مدخل للمرحلة التبريد رس تقديم الهواء الجاف. تم تجفيفها في الهواء باستخدام عمود Drierite في الخط.
3. تشغيل مضخات الهواء والماء. علما أنه لا ينبغي أن عناصر التبريد تشغيل بدون بالوعة الحرارة.
4. تشغيل وحدة تحكم في درجة الحرارة، الكاميرا، والروتين ابفيف.

2. تحضير العينة

1. ضع قطرة 3-4 ميكرولتر من الغمر النفط B (Cargille المختبرات، بستان الارز، ولاية نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) على الجانب الخلفي من القرص القطر النحاس 7 مم وجود ثقوب 500 ميكرون من خلال حفر القرص.
2. وضع القرص النحاس على المسرح التبريد مع الجانب الغمر النفط إلى الأسفل.
3. توصيل أنبوب شعري (حافة حادة) إلى 0.7 مم قطر الأنبوب الداخلي Tygon متصلة في الطرف الآخر لحقنة 2 مل الزجاج (Poulten-غراف، فيرتهايم، ألمانيا).
4. قبل استخدام الأنبوب الشعري، والتحقق من فتحة صغيرة من شعري لضمان أن فتح هو الحجم المناسب (انظر الإجراءات الأولية).
5. إدراج ببطء غلاSS الشعرية في أنبوب المعدة IBP عينة البروتين (2.4 ميكرومتر النائب IBP-GFP في 20 ملي CaCl ₂ و 25 مم تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة في-8، انظر المرجع ¹⁰ لتفاصيل الإعداد) وسحب الحقنة الزجاج حتى الزجاج الشعرية يحتوي على 0،1 ميكرولتر من محلول البروتين.
6. بدء تسجيل الفيديو عن طريق برنامج ابفيف.
7. إدراج حافة حادة من الزجاج الشعرية (التي تحتوي على البروتين الحل) في واحدة من الثقوب في القرص النحاس على المسرح التبريد.
8. مع مراعاة من خلال المجهر (أوليمبوس، طوكيو، اليابان، الهدف 10X)، اختراق طبقة الزيت بعناية الغمر مع طرف زجاج الشعرية، ثم اضغط على حقنة زجاجية (بدقة جدا) لتقديم كمية صغيرة (~ 10 NL) من البروتين الحل هو إنشاء قطيرة ميكرومتر 200.
9. تغطية فتحة في مرحلة التبريد مع الجمعية طبقة ساترة مزدوجة (راجع إجراءات أولية).

3. TH نشاط القياس

1. قبلSS على زر التبريد وضبط درجة الحرارة إلى -40 ° C.
2. في البداية، سوف يكون واضحا حل الحبرية. في درجات حرارة منخفضة، وعادة في نطاق -30 ° C إلى -35 درجة مئوية، ويتغير لون الحبرية، تشير إلى أنه تم تجميد الحل. مباشرة بعد العينة جمدت، وزيادة درجة الحرارة ببطء حتى الجليد معظم يبدأ في الذوبان. وهناك زيادة تدريجية في درجة الحرارة اللازمة لتجنب المبالغة في درجة الحرارة يمكن أن يؤدي إلى ذوبان كامل للعينة.
3. التبديل إلى الهدف 50X والبدء في إذابة الجليد عن طريق ضبط درجة الحرارة. هذا التعديل هو التفاعلية، وعادة ما يتم تنفيذ الخطوات النهائية باستخدام خطوات صغيرة في درجة الحرارة من درجة مئوية 0،002 تواصل تذوب حتى الكريستال واحد لا يزال قائما. ينبغي أن الحجم النهائي من الكريستال يكون حوالي 10 ميكرون. يتم تحديد أعلى درجة الحرارة التي تنصهر وتوقفت عن أن تكون نقطة ذوبان ويتم تحديد بدقة في المرحلة الفيديو تحليلها لاحقا.
<تعيين لى> درجة الحرارة إلى واحد بالمائة من عدد قليل درجة مئوية تحت درجة انصهار البلورة ويبدأ منحدر درجة الحرارة مع تأخير 10 دقيقة. ضبط معدل التعلية على النحو المرغوب فيه. خلال هذا الوقت، سوف يكون عرضة البلورة إلى IBPs.
4. وعند الانتهاء من وقت التعرض دقيقة 10، وسوف تنخفض درجة الحرارة تلقائيا تحت سيطرة الروتين ابفيف.
5. مراقبة على شكل الكريستال مع تناقص درجات الحرارة. في مرحلة ما، قد يكون لاحظ موجة مفاجئة من الكريستال الجليد. ويلاحظ درجة الحرارة التي يحدث هذا لأن البلورة درجة حرارة الانفجار.
6. استخدام تحليل الفيديو لتحديد درجة انصهار دقيقة ودرجة حرارة الانفجار. أولا، عن طريق استخدام تحليل الفيديو، والعثور على نقطة انصهار دقيقة. نذكر بأن يتم تحديد أعلى درجة الحرارة التي تنصهر وتوقفت عن أن تكون درجة انصهار. توثيق هذه المرحلة ذوبان في برنامج جدول بيانات. ثم، تحديد انفجار الكريستال دقيقة درجة الحرارة، وتوثيق هذه القيمةكذلك. الفرق بين درجة انصهار ودرجة التجمد، أو الكريستال درجة حرارة الاندفاع، هو النشاط التباطؤ الحراري من الحل IBP.

4. قياس نشاط TH المعتمدة على الزمن

1. اتبع بروتوكول الموصوفة في أقسام لإعداد 3،1-3،3 الكريستال واحد من الجليد.
2. بعد تشكيل الكريستال، وضبط الوقت تأخير المنحدر كما هو مطلوب، وبدوره على منحدر.
3. سوف تنخفض درجة الحرارة بمعدل ثابت (وفقا لمتطلبات المشغلين) تلقائيا بمجرد وقت التأخير قد مرت منحدر.
4. توثيق درجة الحرارة التي يحدث انفجار الكريستال. حساب زمن التعرض (الوقت بين تشكيل الكريستال والبلور انفجار).
5. تكرار التجربة لمرات تأخير المختلفة ورسم النشاط TH بوصفها وظيفة من الوقت لتقييم التعرض الوقت في الاعتماد على النشاط TH.

قياس الوقت TH الاعتماد

ومقياس التناضح نانولتر ابفيف تعمل على تسهيل أداء قياسات دقيقة النشاط TH. يسمح بتخفيض درجة حرارة ثابتة معدل قياس الوقت TH الاعتماد. كان التحكم في درجة الحرارة دقيقة مكنت من مقياس التناضح نانولتر حاسم لهذه التجارب. ويعرف الوقت من التعرض بلورة الثلج على IBPs في حل والفترة الزمنية من تشكيل الكريستال (نهاية عملية الذوبان) حتى النمو المفاجئ من الثلج في جميع أنحاء الكريستال (كريستال انفجار). وجدنا أن الوقت التعرض للبلورات الثلج على IBPs يؤثر بشكل حاسم على النشاط TH. أنتجت فترات قصيرة من التعرض IBP (بضع ثوان) نشاط TH منخفضة في حل IBP-GFP النائب (2.4 ميكرومتر) (الشكل 5). النشاط TH زيادة مع مرور الوقت تعرض IBP حتى وصلت إلى الهضبة في 4 دقائق IBP التعرض. بتركيزات أعلى IBP، لوحةوتم التوصل الاتحاد الافريقي في أقصر الأوقات.

الشكل 1. رسم تخطيطي يوضح IBPs كثف إلى الجليد. اعتمد بإذن من ^10.

الشكل 2. المرحلة التبريد. A) متصلة على أنابيب المجهر. B) بدون الرصاص العليا. C) رسم تخطيطي.

الشكل 3. لقطة من واجهة ابفيف. الكلورينإك هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 4. درجة الحرارة الرسم البياني الاستقرار. تم تعيين تحكم في درجة الحرارة لخفض درجة حرارة 0.01 ° C كل ثانية 15.

الشكل 5. النائب النشاط TH IBP بوصفها وظيفة من الكريستال الجليد الوقت التعرض لIBPs. كل نقطة هو متوسط ​​الوقت من 3-6 التجارب.

هذا العمل يدل على تشغيل مقياس التناضح نانولتر الكمبيوتر التي تسيطر عليها تمكن قياسات دقيقة من النشاط TH مع التحكم في درجة الحرارة غير عادية. في أي نظام حساسة للحرارة، لا بد من تجنب التدرجات درجة الحرارة غير المرغوب فيها. لتجنب درجات الحرارة التدرجات في الجهاز المعروضة هنا، لا بد من وضع حل لقطيرة الاختبار في وسط حفرة في مرحلة التبريد النحاس القرص (الخطوة 2.7). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون واحدة الكريستال في وسط قطرات بدلا من قرب حواف (في معظم الحالات، وهذا لن يحدث تلقائيا). الاعتماد الوقت وصف يشير إلى أن معدل التبريد قد تؤثر على قراءات TH. وهكذا، فإننا نقترح بما في ذلك تقرير الزمنية التي تعرضت لها الكريستال في حل قبل التبريد، وكذلك معدل التبريد. انتظرنا عادة 10 دقيقة قبل التعلية بانخفاض درجة الحرارة عند 0.01 ° C الخطوات في كل ثانية 4.

المشارك ابفيف التي تسيطر عليهاوقد تم تكييف المرحلة أولينغ للاستخدام مع مجهر مقلوب على الأجهزة التي يمكن التلاعب بها ميكروفلويديك حراريا. هذا النظام يسهل أداء التجارب التي تنطوي على تبادل حل بلورات الثلج وIBPs ذات الكلمات الدلالية مع EGFP ^{9 و 10 و 16.} ويمكن تكييف نظام ابفيف التي تسيطر عليها إلى مرحلة كليفتون من خلال ربط تحكم في درجة الحرارة عن طريق الدائرة 3040 عين الكهربائية التكيف. ويتم تشغيل هذا النظام في المختبر ديفيز ^17. البرنامج ابفيف والتكيف المعينة تصميم الدوائر الكهربائية للمرحلة كليفتون متاحة عند الطلب.

وفي الختام، فإننا وصف مقياس التناضح نانولتر تسهل السيطرة الحساسة والتلاعب في درجة الحرارة ومعدل ارتفاع درجة الحرارة وانخفاض (مع حساسية 0،002 C °)، بتنسيق مع واجهة الفيديو من خلال روتين ابفيف في الوقت الحقيقي التحليل. يمكن هذا النظام أداء استنساخه معدل تسيطر التجارب التي مهمر عن التحقيق في حركية التفاعلات IBP مع الجليد. يمكن معالجة العديد من هذه التجارب الطويلة من الجدل القضايا المحيطة آلية عمل IBPs.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وأيد هذا البحث من قبل قوى الأمن الداخلي، NSF، وERC. نود أن نعترف مساعدة فنية مع المرحلة درجات الحرارة من ميلفورد راندي، كورين مايكل شيفر دوغ، وجيريمي دينيسون. وقدمت المساعدة مع تطوير البرمجيات من قبل تشن أو شو دي، Sannareddy راجيش، وBhattachary سوميت. نود أن نشكر لدينا المتعاونين البروفيسور بيتر ديفيس والدكتور L. لوري غراهام A. للبروتين IBP النائب والمناقشات مفيدة. نشكر أيضا أعضاء المختبر الدكتورة مايا بار دوليف، Yangzhong تشين الدكتور سيليك Yeliz الدكتور Pertaya ناتاليا، Mizrahy Ortal، وغاي شلوميت لردود الفعل المستخدم الخاصة بهم.