باستخدام بويضات من

بيض البلهارسيا المنسونية والتحفيز والتشجيع قوي من نوع المساعد تي 2 (TH2) استجابة جهاز المناعة، سمة من العدوى الطفيلية، والربو والالتهاب التحسسي. ويستخدم هذا البروتوكول س. المنسونية بيضة حقن لتوليد CD4 TH2 خلوى بفعل الاستجابة الالتهابية في الرئة، وتتميز تشكيل الحبيبي الرئة في جميع أنحاء البيض، كثرة اليوزينيات وتنشيط البلاعم بديل.

طفيليات البلهارسيا والديدان المثقوبة الدم الذي يصيب ما يقدر بنحو 200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ^1. في عدوى مزمنة مع البلهارسيا، وأمراض خطيرة، بما في ذلك تليف الكبد وتضخم الطحال، والناجمة عن رد الفعل المناعي للبيض الطفيلي بدلا من الطفيليات نفسها ^2. بيض طفيلي حث استجابة Th2 يتميز إنتاج IL-4، IL-5، وايل 13، وتفعيل البديل الضامة وتجنيد الحمضات. هنا، نحن تصف حقن بيض البلهارسية المنسونية كنموذج لدراسة الطفيليات محددة استجابات TH2 خلوى في الرئة والغدد الليمفاوية استنزاف، وتشكيل حبيبية رئوي المحيطة البيض، والتهاب الشعب الهوائية.

بعد توعية داخل الصفاق والتحدي في الوريد، S. ويتم نقل البيض المنسونية إلى الرئة عن طريق الشريان الرئوي حيث هم محاصرون داخل حمة الرئةبواسطة حبيبية تتألف من الخلايا الليمفاوية، الحمضات والضامة تفعيلها بدلا من ^3-6. المرتبطة التهاب الحبيبي، وتشكيل في المساحات الشعبة الهوائية السنخية، ويمكن التوسع في الغدد الليمفاوية واستنزاف CD4 يمكن ملاحظة تي تنشيط الخلايا. نحن هنا بالتفصيل بروتوكول لعزل بيض البلهارسيا المنسونية من الأكباد المصابة (تعديل من ^7)، وتوعية وتحدي الفئران، واستعادة أجهزة (الشعبة الهوائية غسل السنخية (بال) والرئة والغدد الليمفاوية تصريف) للتحليل. نحن تشمل أيضا نسيجية ممثل والبيانات المناعية واقتراحات لتحليل مناعية إضافية.

عموما، هذه الطريقة توفر في نموذج الجسم الحي للتحقيق استجابات مناعية الديدان الطفيلية التي يسببها في الرئة، والتي تنطبق على نطاق واسع لدراسة الأمراض الالتهابية TH2 بما في ذلك عدوى الديدان الطفيلية، والأمراض متليفة، التهاب الحساسية والربو. مزايا هذا النموذج لدراسة الطباعE 2 التهاب في الرئة وتشمل استنساخ استجابة قوية للالتهابات TH2 في الرئة والغدد الليمفاوية استنزاف، وسهولة تقييم التهاب عن طريق الفحص نسيجية من حبيبية المحيطة البيض، وإمكانات التخزين الطويل الأجل للطفيلي بيض.

1. تنقية البلهارسيا المنسونية البيض

1. تصيب السويسري وبستر الفئران مع البلهارسيا السركاريا، وهي المرحلة المعدية في دورة حياة البلهارسيا ^8. بدلا من ذلك، الحصول على البلهارسيا الفئران المصابة من مركز الموارد البلهارسيا المعدية ( http://www.schisto-resource.org/~~V ). ترك الفئران ل6-7 أسابيع بعد الإصابة، وهو الوقت الذي نقطة، والبيض موجودة في الكبد ويمكن استردادها على النحو المبين أدناه (انظر الشكل 1).
2. الموت ببطء الفئران مع CO _2، والرطب مع الايثانول 70٪. ضع الماوس على ظهره. استخدام الملقط حادة ومقص لقطع الجلد والغشاء البريتوني الكامنة. استئصال الكبد، وتقع أسفل القفص الصدري والحجاب الحاجز.
3. اللحم المفروم ناعما الأكباد وإضافة 20 مل في الكبد من خليط الهضم، ويتألف من كولاجيناز / dispase (0.5 ملغ / مل)، البنسلين (100 يو / مل) والستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني. وضع mixtلدى عودتهم في أنبوب 50 مل الصقر واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 37 درجة مئوية.
4. منبذة الخليط في 400 XG / 3 دقيقة / 20 درجة مئوية. صب بلطف السائل الزائد وملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني. منبذة مرة أخرى وكرر PBS غسيل. بعد الطرد المركزي الماضي، resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 25 مل.
5. يجهد بيليه معلق من خلال مصفاة المطبخ المعدنية القياسية (استخدام 50 مل حقنة الغطاس إلى الهريس القطع من خلال الكبد في كوب زجاج)، تليها تمرير الخليط عبر منخل ناعم (استخدام 10 مل حقنة لدفع خليط من خلال منخل ناعم في كأس زجاج الثانية).
6. وضع خليط المتوترة في أنبوب 50 مل الصقر. الطرد المركزي في 400 XG / 5 دقيقة / 20 درجة مئوية. بعناية من اجل الخروج طاف دون أن تفقد بيليه. Resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني مل 3.
7. تراكب مزج بلطف في الصعود إلى Percoll 20٪، و 40 مل من الانحدار Percoll مل و 32 مل 8 السكروز 0.25M (FW = 342.3 ذلك 8،56 ز sucrose/100 مل H ₂ 0).
8. منبذة 10 دقيقة / 800 XG / 20 درجة مئوية. ماصة قبالةد تجاهل الطبقة العليا هلامي من خلايا الكبد. إزالة البيض بيليه في أسفل مع ماصة نقل وضعت في أنبوب 15 مل الصقر.
9. غسيل 3X بيليه في برنامج تلفزيوني مل 10/1 EDTA مم / 1 ملم الإعدادات EGTA باستخدام الطرد المركزي: 3 دقائق / 30 XG / 20 درجة مئوية. Resuspend في 500 برنامج تلفزيوني ميكرولتر.
10. تراكب المزيج على Percoll الجديدة 25٪، 10 مل التدرج (2.5 مل Percoll و 7.5 مل السكروز 0.25M) باستخدام إعدادات الطرد المركزي: 10 دقيقة / 800 XG / 20 درجة مئوية.
11. غسل 3X في برنامج تلفزيوني 10 مل باستخدام إعدادات الطرد المركزي: 3 دقائق / 30 XG / 20 درجة مئوية.
12. في غسيل مشاركة 10 مل، وإزالة 100 ميكروليتر لحساب البيض. بيض حل بسرعة، لذلك يجب أن تكون مختلطة الأنبوب الصقر جيدا قبل إزالة عينة. تمييع العينة 100 ميكروليتر مع 900 PBS ميكرولتر. ينبغي أن يحسب 100 ميكرولتر من المزيج كما قطرات على شريحة المجهر باستخدام مجهر تشريح (1:10 تخفيف). وينبغي أن تستخدم على نطاق وتتحمل نصائح ماصة.
13. Resuspend البيض في البيض 50000 / مل في برنامج تلفزيوني. ويمكن تخزين البيض لعدة أشهر في -80 درجة مئوية وإذابة مرة واحدة أو تويكه للاستخدام. قبل الاستخدام، وفحص تحت المجهر للتأكد من أن البيض لا تزال على حالها (انظر الشكل 1).

2. داخل الصفاق توعية مع س. بيض المنسونية: يوم 0

1. يعد البيض في برنامج تلفزيوني eggs/100 5000 ميكرولتر في أنبوب 5 snapcap مل. للحقن، ويقدر البيض 50٪ أكثر من اللازم.
2. تحميل إبرة قياس 23 ^3/4inch وحقنة 1 مل مع 100 ميكرولتر من تعليق بيضة لكل فأر. بيض تسوية، حتى إبرة الحمل مع البيض مباشرة قبل استخدامها.
3. حقنة صخرة ذهابا وإيابا إلى مزيج البيض قبل كل حقن، وحقن intraperitoneally 100 ميكرولتر من تعليق لكل فأر.

3. الرجعية المدارية التحدي عن طريق الوريد مع س. بيض المنسونية: يوم 14

1. تحضير البيض على النحو الوارد أعلاه في ميكرولتر eggs/100 5000.
2. تخدير الفئران في غرفة متخصصة مع isoflurane (4٪)، أو intraperitoneally مع زيلازين (10 ملغ / كلغ) والكيتامين (120 ملغ / كلغ). عمق anestيتم تحديد hesia بواسطة معسر من قاطع الطريق، وضمان عدم استجابة المادية.
3. بعد التحميل من الحقنة مل 1 و 23 إبرة قياس ^3/4inch مع البيض، واستخدام الملقط لثني الإبرة بزاوية 90 درجة مع شطبة أسفل إلى الزاوية. ضمان عدم وجود فقاعات موجودة.
4. ضع الماوس على جانب واحد. تراجع الجلد حتى عين وسوف تبرز، وحقن 100 ميكروليتر في الأوعية وراء مقلة العين بزاوية 45 درجة إلى الأنف.
5. سحب إبرة، وتطبيق ضغط خفيف للسيطرة على النزيف.

يجب أن تتم كل هذه الإجراءات كان خارجا مع الرعاية، ويجب مراقبة الفئران حتى يشفى من التخدير. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة ولاية بنسلفانيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).

4. التجريبية الحصاد: يوم 22

1. الموت ببطء الفئران مع CO _2.
2. الرطب الفأر مع الايثانول 70٪، ومكان على ظهره.
3. باستخدام كليل forcالعائد على السهم، فهم بطن الفار وجعل شق صغير في الجلد. إزالة الجلد بعناية مع مقص وفضح القفص الصدري والصفاق.
4. خفض فتح الصفاق. قطع الشريان الأورطي البطني لاسترداد الدم مع ماصة باستير. تخزين على الجليد.
5. نقل الكبد وصولا الى كشف الحجاب الحاجز. استخدام مقص لقطع غرامة الحجاب الحاجز. قطع بعناية فتح القفص الصدري لفضح أنسجة الرئة.
6. استرداد العقد اللمفاوية parathymic التي تستنزف في الرئة مع ملقط غرامة. وهذه مدسوس تحت القفص الصدري، على جانبي الغدة الصعترية ^9. متجر على الجليد في وسائل الاعلام عقيمة 1mL (DMEM تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل العجل الجنين، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، كل ما هو متاح من إينفيتروجن).
7. لاسترداد BAL، وتضخم الرئتين لتحليل نسيجية، يجب إجراء التنبيب داخل الرغامى. فضح القصبة الهوائية عن طريق تحريك الغدد اللعابية إلى الجانب، وplaciغرامة ملقط نانوغرام تحت القصبة الهوائية. باستخدام مقص غرامة، وقطع حفرة في وسط القصبة الهوائية، وإدراج أنبوب إلى الرئتين. تأمين الأنابيب عن طريق ربط مع الموضوع الجراحية.
8. نعلق PBS مملوءة 1 مل حقنة للأنابيب وتضخم الرئتين مع PBS 1 مل. استرداد بعناية غسيل BAL مع حقنة. تخزين على الجليد.
9. نعلق بارافورمالدهيد 4٪ (منهاج العمل) في برنامج تلفزيوني مملوءة حقنة 1 مل إلى أنابيب وتضخم الرئتين.
10. إزالة الأنابيب، وتشديد الخيط الجراحي لمنع تسريب لمنهاج العمل.
11. تشريح بعناية أنسجة الرئة ومكان في أنبوب 50 مل مع الصقر PFA مل 5 4٪.

5. إعداد الأنسجة المستردة

1. المصل: تخزين التالية على الثلج لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة لتجلط الدم، يتم استرداد المصل من الدم عن طريق الطرد المركزي (13000 XG / 10 دقيقة / 4 درجات مئوية). يتم تخزين المصل عند -20 درجة مئوية، ويمكن استخدامها لELISAs خلوى أو س. المنسونية بيضة مستضد محدد مفتش isotype ELISAs ^{6 و 10.}
2. الغدد الليمفاوية: مستعدون تعليق خلية واحدة وعدد الخلايا المستخدمة لتقييم حجم الاستجابة المناعية. لفحص TH2 الاستقطاب الخلية، هي خلايا إعادة حفز مع س. المنسونية مستضد البيض لمدة 72 ساعة. يمكن فحص Intracellar تلطيخ خلوى بواسطة التدفق الخلوي، ويمكن استرداد supernatants وتخزينها في درجة مئوية -20 لإليسا من السيتوكينات TH2 (IL-4، IL-5، IL-13) ^6.
3. BAL: خلايا من مكعبات (400 x ج / 5 دقيقة / 4 درجات مئوية). يتم استرداد السائل BAL وتخزينها في -20 درجة مئوية لتحليل السيتوكينات TH2 بواسطة ELISA. وتستخدم الخلايا BAL التهم باعتبارها قراءات لالتهاب الشعب الهوائية. الاستعدادات Cytocentrifuge من 10،000-100،000 الخلايا (500 دورة في الدقيقة / 5 دقيقة / 4 درجات مئوية)، وسوف تليها تلطيخ Diffquik تسمح تعداد التهابات تسلل ^{4 و 6.} بدلا من ذلك، يمكن فحص الخلايا BAL بواسطة التدفق الخلوي ^6.
4. أنسجة الرئة: أنسجة الرئة هو ستورإد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الأنسجة الثابتة هو جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع، والتي شنت على الشرائح للتحليل النسيجي والمناعي.

6. ممثل النتائج

هذه تفاصيل بروتوكول جميع الخطوات اللازمة ل(ط) إعداد تنقية بيض البلهارسيا المنسونية للاستخدام في الجسم الحي (الشكل 1)، (ب) توعية وتحدي مع هذه الفئران البيض و(ثالثا) استرداد أجهزة للفحص من الاستجابة للالتهابات الرئة. هذا نموذج في فيفو يدفع بتكاثر امكانات استجابة الرئة TH2 التهابات. هذا ما أظهرته التهاب الشعب الهوائية، وكثرة اليوزينيات تصور حسب تعداد خلايا BAL والاستعدادات cytocentrifuge (الشكل 2). يمكن فحص H & E-أقسام الرئة الملون للبيضة التي يسببها حبيبية (الشكل 3A)، وتلطيخ مناعي من أقسام الرئة تسمح برؤية الضامة تفعيلها بدلا من ذلك، وTH2 خلوى الناجمة عن الجينات مثل Resisالقصدير مثل α (RELM) جزيء (الشكل 3B). يتم فحص المستضد محددة CD4 استجابة خلوى TH2 بواسطة ELISAs لIL-5، IL-4 و. IL-13 من مستضد حفز parathymic خلايا العقدة الليمفاوية (الشكل 4)

الشكل 1 وتظهر البلهارسيا حقن البويضة المنسونية نموذج صورة الممثل من كبد الحبيبي، سمة من أعباء S.mansoni البيض عالية، والبيض S.mansoni - حجم متوسط ​​(L) 120 ميكرون من ميكرون 50 (W).

الشكل 2. س. المنسونية بيضة حقن يقود التهاب الشعب الهوائية. أ. أرقام الخلية BAL (X10 ⁵⁾ من السذاجة (N) أو S.mansoni الفئران المحقونة البيض (ن خ). * P <0.05. ب إعداد Cytocentrifuge من الخلايا BAL. لجنة الهدنة العسكرية، بلعم؛ ايوق، يوزينية؛ الليمفاوية، الخلايا اللمفاوية. بار، و 10 ميكرون.

الشكل 3. التصور من حبيبية الرئوي وبدلا من ذلك تفعيل الضامة المحيطة بيضة S.mansoni ألف. وكان حبيبي رئوي المحيطة بيضة SM (السهم الأسود) في تصور H & E-أقسام الرئة الملون. B. المناعي تلطيخ لRELMα (الأخضر)، مستقبلات المانوز (أحمر) ودابي (الأزرق) يكشف الضامة وبدلا من تفعيل (أبيض السهم) في الحبيبي المحيطة autofluorescent ن خ البيض (السهم الأسود). بار، و 50 ميكرون.

الشكل 4. S.mansoni بيضة مستضد معين وحفز استجابة خلوى TH2. تصريف parathymic خلايا العقدة الليمفاوية من الفئران ساذجة (N) أو ن خ البويضة المحقونة مع SM </ م> مستضد البيض لمدة 72 ساعة، تلتها إليسا من supernatants لIL-4، IL-5 و IL-13. النطاق، نانوغرام / مل. * P <0.05.

هنا، يوصف نموذج توظيف بيض البلهارسيا المنسونية للحث على نوع التهاب الرئة 2. السمات المميزة لهذا النموذج وتشمل استجابة مناعية قوية TH2، التهاب الشعب الهوائية والرئة تشكيل الحبيبي. وبما أن هذه المعايير تعتمد على ردود CD4 الخلية TH2 ^11، هذا هو نموذج مفيدة للتحقيق في الآثار المترتبة على عمليات الحذف بروتين محددة أو نسب محددة على الاستجابات الخلية TH2. هنا سوف تشمل قراءات القياس الكمي للمستضد محدد السيتوكينات TH2، تحليل للتسلل خلية في الشعب الهوائية، وحجم حبيبية رئوي. معلمة إضافية التي يمكن قياسها هي البيضة التي يسببها تليف ^12. ويقاس ذلك من خلال تلطيخ أقسام الرئة بيضة حقن مع ثلاثي الألوان ماسون، والتي تسمح برؤية ترسب الكولاجين التي تحدث في الأوعية المحيطة بها، الخطوط الجوية، وداخل الورم الحبيبي (كما هو موضح في ^6).

على الرغم من أن هذا protocرأ س توظف المنسونية البيض، واحد الحد من هذا النموذج هو أنه لا يتم إنتاج س. المنسونية العدوى، والتي تتم عن طريق إصابة الفئران مع السركاريا المعدية. ومع ذلك، ميزات هذا النموذج هو الراحة للإقامة، وأنه لا يوجد خطر العدوى من المحقق. بعد تنقية، يمكن تخزين البويضات مريح وتستخدم عدة أشهر في وقت لاحق. إذابة مرة واحدة، والبيض ليست معدية، وبالتالي يمكن التعامل معها بسهولة أكثر من البيض مباشرة، أو السركاريا المعدية. عند إعداد البيض للحقن، لا بد من ضمان أن البيض سليمة عن طريق التفتيش تحت المجهر. ويجب للحد من انقطاع البيض، نصائح ماصة واسعة تتحمل والإبر يمكن استخدامها عند التعامل مع وpipetting من البيض إلا عند الضرورة. منذ تسوية البيض بسرعة، ومن الأهمية بمكان أيضا إلى بواسطة هزاز لطيف إعادة تعليق، قبل حساب أو عن طريق الحقن.

على الرغم من أن يمكن تجميد البيض النقية، لا بد من معالجتها الأكباد المصابةعلى الفور الحصول على تنقية ناجحة من البيض. منذ شدة الإصابة، وعدد من البيض موجود في الكبد هي السلالة التي تعتمد على الفأرة، وسوف تستغرق وقتا نقطة لاسترداد البيض والبيض عوائد تختلف اعتمادا على الفئران المستخدمة. هنا استخدمت السويسري وبستر من الإناث، وضحوا في 6-7 أسابيع بعد الإصابة لتوليد 10،000-30،000 بيض / الكبد. مرجعا مفيدا، تشيفر وآخرون. تفاصيل الأعباء البيض الكبد في العديد من سلالات الفئران ^13.

حقن البيض لا يسبب الوفاة. ومع ذلك، قد الفئران الاستسلام إذا الإفراط في تخدير، إذا لم يتم غسلها إعداد البيض جيدا (كما هو مفصل في البروتوكول)، أو إذا حقن البويضة يسبب نزيف حاد. بديل لالرجعية المداري هو حقن ذيل حقن الوريد من البيض. هذه النتائج أيضا في رد فعل قوي بيضة الرئة الناجم عن التهاب ^3. يجب أن تتم كل هذه الإجراءات كان خارجا مع الرعاية، ويجب مراقبة الفئران حتى يشفى من التخدير.

في الختام، هذه حقن تفاصيل بروتوكول س. بيض المنسونية للتحريض التهاب الرئة والاستجابات الخلية TH2، وقابل للتطبيق لدراسة الديدان الطفيلية التي يسببها الالتهاب، والحساسية، والربو وأمراض تليفي.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) AI091759 وكرون والتهاب القولون من مؤسسة وليام أميركا وشيلبي Modell مؤسسة أبحاث العائلة جائزة (لMN). تم تزويد البلهارسيا المصابين الفئران عن طريق مركز الموارد البلهارسيا المعدية (العقد NIAID N01 A130026).