Microinjection من البويضات المورق القيطم

هنا علينا أن نظهر للحشوية microinjection القيطم المورق البويضات مع ركيزة استيراد النووية ، فضلا عن التحضير للحقن البويضات عن التصور بواسطة المجهر الإلكتروني رقيقة sectioning.

Microinjection من البويضات المورق القيطم تليها رقيقة sectioning المجهر الإلكتروني (EM) هو نظام ممتاز لدراسة نقل النواة للهيولى. بسبب نواته كبيرة وكثافة عالية من المسام المجمعات النووية (الشخصيات) ، يمكن أن يكون النقل النووي بسهولة في البويضة القيطم. وقد اكتسبت الكثير من التبصر في آليات الاستيراد والتصدير النووي من خلال استخدام هذا النظام (استعرضها Panté ، 2006). بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا microinjection من البويضات لتشريح الضفدع مسارات استيراد النووية عدة من الفيروسات التي تتكاثر في النواة المضيفة.

نحن هنا لشرح microinjection هيولي من البويضات القيطم مع ركيزة استيراد النووية. نعرض أيضا إعداد البويضات لحقن التصور بواسطة رقيقة sectioning EM ، بما في ذلك تشريح ، والجفاف ، وتضمينها في البويضات الى الراتنج الايبوكسي التضمين. أخيرا ، ونحن نقدم نتائج ممثل عن البويضات التي تم microinjected مع قفيصة من nucleopolyhedrovirus الفيروسة العصوية californica Autographa (AcMNPV) أو فيروس البارفو اللحظة من الفئران (MVM) ، ومناقشة التطبيقات الممكنة لهذه التقنية.

الجزء 1 : إعداد البويضات لالقيطم microinjection

1. وضع قطعة صغيرة (حوالى 2 سم) من المبيض المورق القيطم في أنبوب 50 مل مخروطي يحتوي على 20 مل من محلول كولاجيناز (5 ملغ / مل كولاجيناز في الكالسيوم الخالية تعديل بارت والمالحة : مم 0.82 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، MgSO ₄ ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). يستخدم كولاجيناز لإزالة الخلايا التي تحيط جريب البويضات.
2. وضع أنبوب على منصة شاكر والصخور برفق (عند 100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة. هذه المرة يختلف مع الكثير من كولاجيناز مختلفة. هكذا بعد ساعة واحدة ، أخذ عينة صغيرة من البويضات وفحصها تحت المجهر تشريح. وينبغي أن يكون صحيح دي folliculated البويضات مفصولة عن بعضها البعض جيدا ، وينبغي أن يكون من السهل ادخال ابرة الزجاج في البويضة. إذا ليست كافية البويضات دي folliculated ، وتركوا في حل كولاجيناز ودققت مرة أخرى في كل خمس دقائق.
3. غسل البويضات ثلاث مرات مع المالحة تعديل بارت في (MBS : 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، 0.82 ملي MgSO ₄ ، 0.33 ملي كا (NO _{3) 2} ، 0.41 ملي CaCl ₂ ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5) ، ونقل لهم لصحن قطره 100 ملم بتري تحتوي MBS زائد 1 ٪ البنسلين الستربتوميسين /. والبويضات هي الآن جاهزة للmicroinjected. إذا كان سيتم تنفيذ microinjection في يوم آخر ، وتخزين البويضات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
4. باستخدام مجهر تشريح ، حدد البويضات الناضجة للمرحلة السادسة microinjection. هذه البويضات تكون كبيرة ، وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة السوداء والحيوان دسم نصف الكرة الملونة النباتية.
5. سادسا نقل البويضات في مرحلة ناضجة لوحة microwell (نونك ، 10 حجم جيدا ميكرولتر). وينبغي أن يتم ذلك بعناية ، وذلك باستخدام pipettor 200 ميكرولتر مع طرف ماصة أنه تم قطع في نهاية السماح شفط undisrupted من البويضات.

الجزء 2 : Microinjection من البويضات القيطم

1. تعد الركيزة استيراد لتكون microinjected بإضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق برومفينول 1 ٪ ، للمساعدة في التصور من microinjection. على سبيل المثال ، أن نضيف 1 ميكرولتر من اللون الأزرق برومفينول إلى 10 ميكرولتر من الركيزة.
2. وضع شريط صغير من Parafilm على طبق بتري قطرها 100 ملم ، والاستغناء عن انخفاض 5 ميكرولتر من الحل ليتم حقنه في الشريط Parafilm.
3. إبرة حقن ملء معايرة سابقا (التي تم الحصول عليها عن طريق سحب 6.6 ميكرولتر micropipette دروموند مع بولير + لحقن ماتيتش) مع الحل ليتم حقنه. لهذا ، تم تعيين microinjector على وضع الطموح. لمعايرة إبرة الحقن جعل علامات نقطة على كل إبرة 0.5 مم ، والتي تتوافق مع حجم 50 NL.
4. للحقن حشوية ، إدراج غيض من الإبرة إلى بويضة في نصف الكرة النباتي ، وقريب جدا من الكرة الأرضية الحيوان ، بزاوية حوالي 45 درجة. بدوره الإعداد لmicroinjector microinject وmicroinject كل بويضة مع 50 من الركيزة NL الاستيراد. تستخدم علامات نقطة على الإبرة لرصد مبلغ الركيزة التي تم حقنها.
5. نقل البويضات لحقن طبق صغير بيتري (35 ملم القطر) مليئة MBS ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة عن المبلغ المطلوب من الوقت (ويتم اختيار النقاط الزمنية وذلك للسماح للمراقبة الركيزة الاستيراد المرتبطة الشخصيات ، وهذا يحدث بين 10 و 30 دقائق للبروتينات والفيروسات التي تنقل نحو نشط للمجلس الوطنى ، وهذا الوقت يعتمد أيضا على موقع الحقن وحجم البروتين / فيروس).
6. عند اكتمال الحضانة ، ونقل البويضات إلى قارورة زجاجية تحتوي على 4 ميلي غلوتارالدهيد 2 ٪ في MBS ، والإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

الجزء 3 : تشريح الضفدع من البويضات

1. في اليوم التالي ، وغسل البويضات 3 مرات مع MBS.
2. نقل البويضات في طبق بتري صغيرة مليئة العازلة الملح منخفضة (LSB : 1 ملم بوكل ، 0.5 ملي MgCl ₂ ، 10 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). باستخدام مجهر تشريح تشريح وملاقط ، وإزالة القطب نباتية من كل بويضة. ومن المفيد لاستقرار البويضة يتم تشريح مع زوج واحد من ملاقط ، في حين يستخدم هذا الزوج الأخرى مثل المقص لإزالة القطب نباتية. عند هذه النقطة كان من الممكن لتقييم نجاح microinjection وجود مسحة زرقاء في العصارة الخلوية. هو استمرار للبروتوكول فقط للالبويضات التي تم microinjected بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينات لتكون على استعداد لEM ، تشريح هذه الخطوة يجعل من الاسهل بكثير للعثور على نواة عندما التشذيب وsectioning العينات.
3. إصلاح البويضات تشريح غلوتارالدهيد مرة أخرى مع 2 ٪ في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد التثبيت ، وغسل البويضات تشريح ثلاث مرات مع LSB.

الجزء 4 : إعداد البويضات المصبوبة لتضمينها ورقيقة Sectioning EM

1. نقل البويضات إلى شريحة تشريح الكآبة. نضح قدر من السائل ونقاط البيعsible ، ثم سرعان ما (بحيث لا تجف) تغطية البويضات تشريح مع ذوبان agarose منخفضة 2 ٪. بينما لا تزال لينة agarose ، استخدام غيض ماصة للفصل بين البويضات من بعضها البعض ، وضمان أن كل بويضة هو وجه أعلى أو إلى أسفل (وليس جانبيا).
2. السماح لترسيخ agarose لمدة 10 دقائق تقريبا. مرة واحدة في agarose يتصلب ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع agarose الى قطع صغيرة ، كل منها تحتوي على واحد البويضة تشريح.
3. وضع البويضات agarose جزءا لا يتجزأ في قارورة زجاجية 4 مل ، وبعد إصلاح لهم 1 ٪ أوسو ₄ في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. غسل العينة ثلاث مرات في LSB. إذا لزم الأمر ، وتخزين العينة في 4 درجات مئوية خلال الليل والاستمرار في البروتوكول في اليوم التالي.
5. يذوى بالتسلسل العينات في سلسلة الصاعد من الكحول (50 ، 70 ، والايثانول 90 ٪ لمدة 20 دقيقة لكل منهما). ويتبع هذا من قبل اثنين من التغييرات في الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما. يذوى أخيرا العينات مع الأسيتون 100 ٪ لمدة 15 دقيقة.
6. التسلل العينات مع مزيج من EPON 01:01 (Fluka) والأسيتون لمدة ساعة واحدة ، تليها تسلل بمزيج من 02:01 EPON والأسيتون لمدة ساعتين ، وأخيرا في EPON نقية على الأقل ست ساعات.
7. عينات من مكان في قوالب تضمين شقة مليئة EPON النقي الطازج. والبويضات موجهة بطريقة أن الجانب النواة أقرب إلى موقع الحقن -- في هذه الحالة جانب البويضات التي تم تشريح -- سيتم مقطوع الأولى. هذه الخطوة يحسن من فرص تصور استيراد الركيزة المختار.
8. أخيرا ، وتتبلمر EPON لمدة يومين في 60 درجة مئوية.
9. من أجل رؤية العينات ، يتم قطع الكتل ومقطوع ثم باستخدام مشراح مستدق. يتم نقل المقاطع على شبكات EM ملون باستخدام الإجراء العادي ، وتصور مع انتقال المجهر الالكتروني ، ونحن لن يظهر هذا الجزء من البروتوكول كما هو معيار EM الداخلي.

الجزء 5 : نتائج الممثل :

إذا كان البروتوكول قد حققت نجاحا ، ومن ثم ينبغي المغلف النووية (شمال شرق) والشخصيات تكون مرئية بوضوح في EM micrographs. اعتمادا على الركيزة وحقن مقدار الوقت بين الحقن والتثبيت ، يجب أن تكون مرئية الركيزة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب ، في مجلس الشعب ، أو على وجه النووية للمجلس الوطنى.

الشكل 1 يبين NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها capsids من AcMNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، والمجهزة لتضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار إلى الالتحام قفيصة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب بواسطة سهم أبيض.

في المقابل ، يظهر الشكل 2 NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. باستخدام هذه التقنية ، وجدنا أن يدفع MVM اضطرابات في الشرق الأدنى (كوهين وPanté ، 2005). بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء.

الشكل 1 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من البويضة القيطم الذي تم حقنه بمادة capsids للزينة MNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، ومعالجتها لل التضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار Capsids بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر.

الشكل 2 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر.

Microinjection من البويضات القيطم جنبا إلى جنب مع رقيقة sectioning EM هو أداة فعالة للغاية لدراسة نقل النواة للهيولى. وقد استخدم هذا النظام لخريطة خطوات متميزة من الاستيراد عن طريق مجلس الشعب ، على سبيل المثال من التفاعل ركيزة النووية مع استيراد المكونات الهيكلية للمجلس الوطنى مثل خيوط حشوية وسلة النووية (التي استعرضها Panté ، 2006). كما تم استخدامه لدراسة استيراد النووية النووية تكرار الفيروسات (Panté وKann ، 2002 ؛ رابي وآخرون ، 2003 ؛ كوهين وPanté ، 2005).

تباين واحد من هذه التقنية microinjection هيولي المبين هنا هو microinjection النووية ركيزة الصادرات النووية (Panté وآخرون ، 1997). لإجراء الحقن النووية ، يتم وضع البويضات في طبق microwell ، موجهة بحيث القطبين الحيوان مواجهة ، وحضنت في 4 درجات مئوية خلال الليل. في اليوم التالي ، يجب أن تكون مرئية النواة باعتبارها منطقة مرتفعة قليلا في القطب الحيواني. هي نواة microinjected مع حوالي 25 من الركيزة NL التصدير في زاوية (أكبر من 45 درجة) حاد والمجهزة للدمج ورقيقة sectioning EM كما هو موضح هنا.

من المهم أيضا أن نلاحظ أنه عندما نتعامل مع الركيزة النقل التي هي غير مرئية مباشرة تحت المجهر الإلكتروني ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتسمية الركيزة مع جسيم الإلكترون مبهمة مثل الذهب الغروية (استعرضها Panté ، 2006).

نشكر ديفيد Theilmann (المحيط الهادئ الأغذية الزراعية مركز البحوث ، سمرلاند ، كولومبيا البريطانية) لتوفير AcMNPV الفيروسة العصوية ومفيدة للمناقشة.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (MSFHR) ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) .