Biz onların işbirliği için, Viyana, Avusturya Üniversitesi Klinik Patoloji Enstitüsü Profesör Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer ve Sigurd Krieger teşekkür ederim.

Hücre kültürü <ol><li> Grow GlutaMAX I% 10 fetal buzağı serumu, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin sülfat (Invitrogen) içeren standart hücre kültürü yöntemleri kullanılarak, F-12 Ham orta Çin hemstırı yumurtalık hücreleri (CHO-K1). </li><li> Serum ücretsiz medya Exchange kültür ortamı. Etiket hücre yüzey proteinleri CyDye Dige Fluor Cy3 veya Cy5 minimal boyalar (bkz. aşağıdaki bölüm Hücre Yüzey Etiketleme,) ile farklı zaman noktalarında. </li><li> Her zaman noktası ve CyDye Dige Fluor Cy2 etiket hücreleri Havuzu eşit sayıda. Için bir iç standart olarak her 2-D jel kullanın. </li><li> Deneylerin çoğunluğu CHO-K1 hücreleri ile yapılabilir, ancak fare embriyo fibroblastlar (3T3 L1) ve fare asit lenfoma lymphoblasts (EL4) (veriler gösterilmemiştir) kullanılabilir. </li><li> DMEM orta son iki hücre tipleri GlutaMAX II ile büyür, ancak, aksi takdirde, CHO-K1 hücreler için kullanılan aynı koşullar kullanabilirsiniz. </li></ol> Hücre yüzey etiketleme <ol><li> Dikkatle sayma ve 5-10 x106 hücreleri hacimde bölünerek, enzimatik olmayan yapışık hücrelere ayırmak. Süspansiyon büyüyen hücreleri için, koparma adım atın. </li><li> Hücre süspansiyonları yaklaşık 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. Orta içeren süpernatantlar çıkarın. </li><li> 1 ml buz Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) pH 8.5 resuspendion pelet yıkayın. 4 800 xg ° C &#39;de 2 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve 200 ul buz etiketleme tampon hücre pelet (HBSS pH 8.5, 1 M üre) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 600 pmol CyDye Dige Fluor karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde minimal boyalar ile sağlam hücreler etiketleyin. </li><li> Lisin 20 ul 10 mM ekleyerek reaksiyon Quench. 10 dakika inkübe edin. </li><li> 500 4 800 xg&#39;de santrifüj ° C &#39;de 2 dakika süreyle takip ul HBSS pH 7.4, tabanda tarafından yüzey etiketli hücreler iki kez yıkayın. </li></ol> Hücre parçalama ve ayrıştırma <ol><li> 150 ul soğuk lizis tamponu (7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 ahbap, 30 mM Tris, 5 mM magnezyum asetat pH 8.5) yüzey etiketli hücreleri Lyse. Buz üzerinde zaman zaman vorteks ile en az 1 saat bekletin. </li><li> 4 10 000 xg&#39;de lizatları Santrifüj ° C 5 dakika. Yeni bir tüp süpernatantı aktarın. Bu örnek, tüm hücresel proteinleri içeren fraksiyone olmayan bir örnek. </li><li> Buna paralel olarak, membran ve sitozolik fraksiyonları önce 2-B jel elektroforezi (membran fraksiyonasyon kiti kullanılarak, Pierce), yukarıdaki gibi, daha sonra parçalara ayırmak Hücre pelletleri yıkayın. Membran fraksiyonu iç ve hücre yüzey membran proteinleri içerir. </li><li> Karşılaştırma için, standart Ettan Dige prosedürü 3 izleyin ve lyse, etiket, ve hücreler sonunda, damıtmak. D Quant Kiti (GE Healthcare) - 2 kullanarak örneklerinde protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> 2-D elektroforez <ol><li> Rehidrate Immobiline DryStrip jeller, pH 3-11NL Immobiline DryStrip Reswelling tepsisi, bir gecede 450 ul DeStreak rehidratasyon sıvısı (% 0.5 IPG Tampon) 24 cm (24 cm). </li><li> Manifoldu anodik fincan yükleme DryStrip jeller Immobiline ve talimatlara göre II. Ettan IPGphor IEF Sistemi kullanılarak izoelektrik odaklama (IEF) gerçekleştirmek için CyDye etiketli örnekleri (50 mg total protein karşılık gelen) uygulayın. </li><li> IEF sonra, büyük (26 x 20 cm)% 12.5 poliakrilamid jeller (SDS-PAGE) üst üste iki adım yer ve şeritler dengelenmesi. % 0.5 &#39;lik agaroz ile Yerleşimi (Bromophenol Mavi içeren tampon çalışan). 5 W / jel 30 dk Ettan DALTtwelve Büyük Dikey Sistemi kullanarak 2-D elektroforez çalıştırın ve sonra boya ön kadar 15 W / jel, jel alt ulaşır. </li></ol> Görüntüleme ve veri analizi <ol><li> 2-D elektroforez tamamladıktan sonra, bir Typhoon 9410 Değişken Modu Imager kullanarak Cy2, Cy3 veya Cy5 jeller taramak. </li><li> DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı 4 kullanılarak membran kesirler, sitozolik kesirler ve fraksiyone olmayan örnekleri spot haritalar karşılaştırın. </li></ol> Post-boyama <ol><li> Görüntüleme sonra, gümüş, standart prosedür 5 göre jeller leke . </li></ol> Protein tanımlama <ol><li> , Hasat büyümeye, fraksiyone olmayan bir örnek için yukarıda açıklandığı gibi hazırlayıcı miktarda (yaklaşık 1 mg toplam 10 x106 CHO hücreler protein) hücreler, yıkama ve lyse. Cy5, bir başak gibi bir hücre yüzeyinde etiketli örnek (bkz. yukarıda) kullanın ve etiketsiz preparatif miktarda protein birlikte uygulanır. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 2-D elektroforez yürütmek, ancak bu kez, 600 mikrogram Astrum firması etiketsiz hücre anodik bardak uygulaması başak etiketli 50 mikrogram hücre yüzeyi ile birlikte lizat. Doğru noktaya toplama izin vermek için referans işaretleyicileri kullanın ve yereöneriler 3 göre jel döküm önce cam plakalar arasında. </li><li> Derin mor total protein leke 3 total protein boyama takip Cy5, hücre yüzeyinde nokta harita elde etmek için kanal Cy5 jel tarayın. </li><li> DeCyder kullanarak iki nokta haritaları 2-Ge yazılım araya Maç ve Cy 5 etiketli hücre yüzey proteinleri ile ilgili tüm noktalar için bir seçim listesi oluşturmak. Ettan spot taşıma istasyonu kullanılarak hücre yüzey proteinleri Pick jel fişler ayıklamak ve Ettan digester kullanarak trypsinate. MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak belirleyin. </li></ol> Tablo 1: Bir Ettan Dige deney Şekil 1&#39;de hücre yüzey proteini etiketleme protokolü göre etiketli serum tükenmiş hücreleri örnekler kullanılarak yapıldı. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Örnek </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Time serum tükenmesi </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> CyDye ile Etiketli </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Jel sayısı </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30 dakika </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2 saat </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4 saat </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16 saat </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, Cy 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+the+cell+surface+proteome.">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li><li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function.">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ettan+DIGE+System+User+Manual.">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA.">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients,+principles+and+methods.">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB.">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li><li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo.">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB.">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li></ol>

Protein konsantrasyonu Iki etiketleme iş akışlarının bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Hücre yüzey proteini etiketleme protokole göre etiketli hücreleri hala bozulmamış olduğundan, sadece hücre yüzey proteinleri boya maruz kalmaktadır. , Etiketleme ve proteinlerin hücre içinde yanı sıra dış (Şekil 1) etiketli önce standart Ettan Dige protokolde, hücreler parçalanmış. Hücre yüzey proteinleri özellikle quantitated olamaz bu yana boya hücre yüzey proteini etiketleme protokol protein göreceli miktarı bilinmemektedir. Ancak, hücre yüzey proteinleri hücresel proteinlerin 2 çok düşük bir oran teşkil ettiği bilinmektedir. Boya 600 pmol yaklaşık 5-10 x10 6 hücre kullanıldı. Bu çalışmada nonfractionated örnek sadece% 12,5-25, 2-B elektroforez için kullanılan bu yana daha az hücre kullanmak mümkün olabilir. <img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_9_11_4/945_Figure-01.png" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Iş akışı protokolleri etiketleme Genel Bakış 2-D Quant kiti kullanılarak farklı fraksiyonları protein konsantrasyonları belirlendi. 10 x10 6 CHO-K1 hücreleri elde edilen toplam protein miktarı fraksiyone olmayan örnek 920 mikrogram, 225 mikrogram / ​​sitozolik hidrofilik fraksiyonunda membran / hidrofobik fraksiyonu ve 770 mikrogram oldu. Bu tutarlar, büyük olasılıkla hücre tipi ve hücre boyutu bağlı olarak değişecektir. Hücre yüzey protokolü etiketli proteinlerin oranı% 2-3 oranında total protein standart Ettan Dige minimum etiketleme, daha yüksek olabilir. Bu nokta şeklinde jeller düşük molekül proteinlerin yuvarlak ve dikey şeritli olduğundan sadece bir boya molekülü, protein molekülü başına yok (Şekil 2 ve 3) bağlı olduğunu görünüyor. Protein başına iki ve daha fazla boya molekülleri protein etiketli yüksek molekül ağırlığı nedeniyle dikey şeritli neden olur. Bu olgu, bu proteinlerin molekül ağırlığı bir değişiklik jel üzerinde yüksek molekül ağırlıklı proteinler ile karşılaştırıldığında daha büyük bir kayma neden çünkü çoğunlukla, düşük molekül ağırlıklı proteinlerin görülebilir. Hücre yüzey protein özel etiketleme İki hücre aynı örnekleri yüzey CyDye Dige Fluor Cy3 ile etiketlenir. Biri parçalanmış doğrudan ve 2-B elektroforezi için kullanılır oldu. Diğer örnek parçalanmış ve membran ve sitozolik kesirler içine fraksiyone. Tüm floresan etiket membran fraksiyon ortaya çıktı; sitozolik kesir etiketli proteinler (Şekil 2) yoksun. Sitozolik protein örneği ile aynı jel gümüş boyanan ve sonucu jel proteinlerin olduğunu gösterdi, ancak hücre yüzey proteini etiketleme protokolünü kullanarak etiketli değildi. Bu sonuçlar, bu yeni etiketleme protokol için özel hücre yüzey proteinleri olduğunu düşündürmektedir. CyDye Dige Fluor minimum boya hücre veya hücre zarından geçiş girmek için görünmüyor. Hücreleri etiketleme önce buz üzerinde tutulur ve bu zar boyunca herhangi bir taşıma azaltabilir. CyDye Dige Fluor minimal boya maruz kalma süresi protein etiketlenmesi için değil, hücre içine giriş için yeterli olduğu, ayrıca nispeten kısa (20 dakika). Hücre içinde etiketleme olmadığı için başka bir olası açıklama, boya zarından geçer bile, hücre içinde meydana etkin bir etiketleme reaksiyonu (optimum pH 8.5), pH (&lt;pH 7.4) çok düşük olmasıdır. Etiketleme reaksiyon hücreleri parçalanmış sonra daha da herhangi bir protein etiketleme engeller hücreleri, yıkama söndürülür. Bu yöntem, in vitro insan hücre hatlarının yanı sıra in vivo 7 karmaşık bir biyolojik sistem başarıyla tatbik edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_9_11_5/945_Figure-02.png" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Hücre yüzey proteini etiketleme özgüllüğü. CHO-K1 hücreleri cellsurface proteinler Cy3 ve fraksiyone etiketlenir. Farklı fraksiyonları (A) 2-D elektroforezi ile ayrılmış ve Cy3 floresan tarandı. Aynı jeller sonra gümüş vitray (B). Damıtma Nonfractionated örnek (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında, membran fraksiyone örnek spot desen sadece çok küçük farklar vardır. Iki nokta haritalar fraksiyone olmayan bir örnek de mevcut DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı ve membran fraksiyonunda tespit edilen bütün noktalar kullanılarak karşılaştırıldı. Fraksiyonu, bu nedenle hücre yüzey proteinleri tespit geliştirmek için gerekli değildir ancak hücrelerin içindeki proteinlerin etiketleme eksikliği doğrulamak için kullanılabilir. Protokolleri arasında karşılaştırma Yeni hücre yüzeyi pro avantajları değerlendirmek için mümkünprotein etiketleme protokol, standart Ettan Dige protokolü ile bir karşılaştırma yapıldı. Aynı balon yetiştirilen CHO-K1 hücrelerden iki özdeş örnekleri sırasıyla iki farklı protokoller, (Şekil 1) ile paralel olarak etiketlenir. Aynı jel üzerinde bir hücre yüzeyi Cy5 etiketli örnek Cy3 etiketli hücre lizat olarak çalıştırıldı. Jel üzerinde yeşil noktalar (Cy3) (Şekil 3A) membran fraksiyonasyon standart Ettan Dige yordamı kullanarak etiketli proteinlerin temsil eder. Bu lekeler, muhtemelen, hücre yüzey proteinleri yanı sıra hücre içinde membranlar (ER, Golgi, mitokondri ve çekirdek) proteinler de dahil olmak üzere zarı proteinleri vardır. Düşük bol hücre yüzey proteinleri tespit etmek için en yüksek olasılık vermelidir beri bir zar fraksiyonasyon adım takip Standart Ettan Dige etiketleme prosedürü, karşılaştırma için seçilen oldu. Jel (Şekil 3A) kırmızı lekeler (Cy 5) standart etiketleme prosedürü (yeşil noktalar) ile görünmez yeni hücre yüzeyinde protein etiketleme protokolü kullanarak etiketli spesifik proteinlerin hücre yüzeyine. Ayrıca, sarı lekeler ya da prosedür (Şekil 3A) Her iki örnekte meydana gelen örtüşen proteinler temsil eder. Bir diğer kullanışlı bir uygulama, bu hücre içi membranlarda hücre yüzey proteinleri ayırmak için her iki etiketleme protokolleri birleştirmek olacaktır. Ayrıca, hücre yüzeyinde / membran protein düzeyleri, çeşitli uyaranlara sonra göreceli değişiklikler hakkında bilgi aynı anda hem etiketleme teknikleri kullanılarak takip edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_12_22_10/figure3-2.png" alt="Şekil 3.2" /><img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_12_22_9/figure3-1.png" alt="Şekil 3.1" /> Şekil 3. (A) 2-D jel görüntüleri CHO-K1 Cy5 hücre yüzey etiketli örneği (kırmızı lekeler, protokolü 1, Şekil 1) ve bir membran fraksiyone Cy3 örnek (yeşil noktalar, protokol 2, Şekil 1) göre etiketli standart Ettan Dige protokolü aynı 2-D jel çalıştırın. (B) DeCyder 2-D 2-D jel standart Ettan Dige protokolü kullanarak görünmez bir hücre yüzey etiketli proteini gösteren Diferansiyel Analiz Yazılımı kez. Hücre yüzey proteinleri tanımlanması Nokta desen etiketli bir hücre yüzeyinde bir örnek ve total protein etiketli örnek arasında çok farklı olduğundan, başak eşleme ve preparatif nokta harita hücre yüzeyinde noktalar belirlenmesini sağlamak için etiketli bir hücre yüzeyi için gerekli idi. Tüm hücre yüzey proteinleri tutuklandılar. Hücre yüzey proteinleri düşük bolluk nedeniyle tespit etmek zor olabilir. Bazı noktalar gerçek protein miktarı hücre yüzey proteinleri, görsel zenginleştirilmiş ve fiziksel olarak bu protokolü kullanarak zenginleştirilmiş olduğundan, tanımlama için yetersiz olabilir. Total protein preparatif miktarda düşük bol hücre yüzey proteinleri başarılı kimlik kolaylaştırmak için, 2-B elektroforezde uygulama öncesi membran proteinlerinin zenginleştirilmiş olabilir. Bu CHO hücreler, hücre içi zarı proteinleri ve hücre yüzey proteinleri hücrelerin toplam proteinin yaklaşık% 20 oluşturmaktadır. Bu hücre tipi, protein miktarı noktalar potansiyel membran proteinlerinin zenginleştirme faktörü 5 artış olabilir. Ayrıca, IPG şeritler dar degrade pH aralıklarının kullanılması büyük miktarda protein uygulanması sağlayacaktır. Bu çalışmada, membran proteinlerinin için zenginleştirme ve geniş bir IPG şeridi ile, sadece 600 mg total protein kullanılır. Biz hala% 82 daha önce membran ilişkili proteinler olarak bilinen hücre yüzey proteinleri, çok sayıda tespit edebilmek. Çoğullama Üç boyalar 6, serum tükenmiş CHO hücreler örnek bir dizi farklı zaman noktalarında (Tablo 1) toplanmış ve hücre yüzey proteinleri etiketli kullanarak bir Ettan Dige deneyde hücre yüzeyinde protein etiketleme protokol test etmek için. Örnekler 2-D elektroforezi ile ayrıldı. Bir hücre yüzeyi Dige deney için bir iç standart hazırlanması basittir. Bu durumda, Cy 2 etiketli hücre yüzey örnekleri (her zaman noktalarında) toplandı ve her 2-D jel uygulanan internal standart olarak kullanılır. Her üç CyDye Dige Fluor minimal boyalar etiketli hücre yüzeyinde benzer proteinler (veriler gösterilmemiştir). Birçok hücre yüzey proteinleri için serum açlık sırasında ifade değişiklikler DeCyder 2-Ge yazılım (Şekil 4) kullanılarak tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/old/945_2008_9_11_7/945_Figure-04.png" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. CHO-K1 hücreler açlık sırasında iki hücre yüzey proteinleri ifade değiştirin. Nokta haritalar DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar Hücre yüzeyinde protein etiketlenmesi için yeni Ettan Dige protokol u hızlı, basitse ve hücre yüzey proteinleri etiketlenmesi için son derece özel. Birçok yeni hücre yüzey proteinleri hücre yüzey proteini etiketleme protokolü kullanarak sadece saptanabilir. CHO hücreler için 80&#39;den fazla yeni hücre yüzey proteinleri DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı kullanarak tespit edildi. Belirlenen etiketli hücre yüzeyinde lekeler% 80 fazla membran ilişkili proteinlerin. Çoğullama üç CyDye Dige Fluor minimal boyalar kullanılarak elde ve DeCyder 2-Ge yazılım kombinasyonu, bu yeni protokol hücre yüzey proteinleri, 2-D Dige teknolojisi ile elde edilen tüm avantajları ile çalışmak için güçlü bir araçtır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9345-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Quant Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6484-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPG Buffer pH 3-11NL</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Heallthcare</td>
<td>17-6004-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox kit</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-92</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeStreak Rehydration solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip Cover Fluid</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1335-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor 3 IEF Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>11-0033-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor Manifold</td>
<td>Instrument component</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6498-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Gel Caster </td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6467-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6466-46</td>
<td>230 V unit: 80-6466-27</td>
</tr>
<tr>
<td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>63-0055-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spot Picker</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1145-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Digester</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-68</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spotter</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan MALDI-TOF</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeCyder 2-D Differential Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-4012-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageQuant Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9236-62</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1319-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHAPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1314-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Dithiothreitol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1318-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol Blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1329-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1321-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecylsulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1313-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycerol 87%</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1310-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne TEMED</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1312-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Ammonium Persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1311-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycine </td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1323-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Sample Prep for membrane proteins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>89864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin sulphate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes

Yüzey proteinleri hücre yeteneğini çevresine tepki ve komşu hücrelerle etkileşim merkezi. Onlar hemen hemen tüm hücre içi sinyal indükleyicileri olduğu bilinmektedir. Ayrıca, çevreye uyum ve ilaç tedavisi önemli bir rol oynar ve genellikle hastalık patogenezi ve patolojisi (1) katılan. Protein-protein etkileşimleri sinyal yolları içsel, ve bu karmaşık biyolojik süreçleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için, duyarlı ve güvenilir yöntemler, hücre yüzey proteinleri çalışmak için ihtiyaç vardır. İki boyutlu (2-D) elektroforez diferansiyel değişiklikleri incelemek için, karmaşık protein örneklerinin biyobelirteçleri ve diğer hedeflere tespiti için yaygın olarak kullanılır. Düşük bolluk (hücresel proteinlerin 1% 2) kısmen Hücre yüzey proteinleri, fraksiyonasyon ya da diğer tip zenginleştirme olmadan 2-D jel tespit etmek zordur. Onlar da sık sık kötü hidrofobik doğa ve yüksek molekül ağırlıklı (2) nedeniyle 2-B jeller temsil edilmektedir. Bu çalışmada, özel etiketleme ve proteinlerin bu önemli grup tespiti için CyDye Dige Fluor minimal boyalar kullanarak sağlam hücreler için yeni bir protokol mevcut. Hücre yüzey proteinleri hücre içi proteinler en az etiketleme ile çok sayıda özel etiketleme gösterdi. Bu protokol, hızlı, basit, kullanımı ve her üç CyDye Dige Fluor minimal boyalar (2, Cy Cy 3 ve Cy 5), hücre yüzey proteinleri etiket için kullanılabilir. Bu özellikler DeCyder 2-D Diferansiyel Analiz Yazılımı kullanarak protein ekspresyonu değişiklikleri Ettan Dige teknolojisi ve analizi ile 2-B Floresan Fark Jel Elektroforez (2-D Dige) kullanarak çoklama için izin verir. Hücre yüzey proteinleri zaman çeşitli uzunluklarda CHO hücreler (bkz. Tablo 1) serum açlık sırasında izledi. Yüksek doğruluk ile bolluk içinde küçük değişiklikler tespit edildi ve sonuçları tanımlanan istatistiksel yöntemler ile desteklenmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

selective-labelling-cell-surface-proteins-using-cydye-dige-fluor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Görüntüleme.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. Basit ve spesifik bir yöntem, bir fraksiyonasyonu adım olmadan floresan etiketleme ve hücre yüzey proteinleri gelişmiş algılama gösterilmiştir. Hücre yüzey proteinleri Diferansiyel bereket, iki-boyutlu (2-D) elektroforez ve Ettan ™ Dige teknolojisi kullanılarak analiz edildi.

Video: Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Biyoloji

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, differentiation, and proliferation. A comprehensive characterization of these proteins provides rich information for biomarker discovery, cell-type identification, and drug-target selection, as well as helping to advance our understanding of cellular biology and physiology. Surface proteins, however, pose significant analytical challenges, because of their inherently low abundance, high hydrophobicity, and heavy post-translational modifications. Taking advantage of the prevalent glycosylation on surface proteins, we introduce here a high-throughput glycopeptide-capture approach that integrates the advantages of several existing N-glycoproteomics means. Our method can enrich the glycopeptides derived from surface proteins and remove their glycans for facile proteomics using LC-MS. The resolved N-glycoproteome comprises the information of protein identity and quantity as well as their sites of glycosylation. This method has been applied to a series of studies in areas including cancer, stem cells, and drug toxicity. The limitation of the method lies in the low abundance of surface membrane proteins, such that a relatively large quantity of samples is required for this analysis compared to studies centered on cytosolic proteins.

Cell surface proteins are biologically important and widely glycosylated. We introduce here a glycopeptide-capture approach to solubilize, enrich, and deglycosylate these proteins for facile LC-MS based proteomic analyses.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...