İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

DNA hasarı yanıtının incelenmesi, yeni hedefe yönelik tedavide yumurtalık kanseri potansiyel biyobelirteçlerinin patofizyolojisinin anlaşılmasında gereklidir. Bu teknik, numunenin bozulmadan kalmasına izin verir ve antijenlerin etki yerlerinde incelenmesine izin verir. Bu protokol hızlıdır ve immünofloresana uygun herhangi bir antijene uyarlanabilir.

Bu yöntem, kemoterapötik ve PARP inhibitörü direncinde rol oynayan yumurtalık kanseri ve DNA hasarı onarım süreçleri hakkında fikir verir. Bu yöntemler, 3D kültürlerin ve organoidlerin kullanımını içeren diğer çalışma alanlarına uygulanabilir. Başlamak için, 3B matrisini bozmadan medyayı ışınlanmış ve inkübe edilmiş organoidlerden aspire edin.

Daha sonra 300 mikrolitre PBS ile yıkayın. Organoidleri 10 dakika boyunca 300 mikrolitre% 2 paraformaldehit içinde sabitleyin. Sabitledikten sonra, organoidleri 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın ve beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Daha sonra 300 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyerek organoidi geçirgenleştirin. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, tamponu çıkarın ve 300 mikrolitre boyama tamponu ile yıkayın. Organoidleri beş dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Ardından, geçirgenlik adımını engellemek için 300 mikrolitre boyama tamponu ekleyin. Çalkalayıcıya 30 dakika boyunca yerleştirin ve bir pipet kullanarak boyama tamponunu aspire edin. Daha sonra boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre birincil antikor ekleyin.

16 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın. Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın.

Boyama tamponunda seyreltilmiş 300 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve 300 mikrolitre seyreltilmiş DAPI ekleyin. Çalkalayıcıya beş dakika boyunca yerleştirin.

Çalkalayıcıda her biri beş dakika boyunca 300 mikrolitre boyama tamponu ile üç yıkama yapın. Boyama tamponunu çıkarın ve hazne kızaklarıyla birlikte verilen sökme kitini kullanarak odaları ayırın. P200 pipet ucunun ucunu kesin ve organoid tırnak içeren her bir kuyuyu kaplayacak montaj ortamı eklemek için bunu kullanın.

Kabarcıklardan kaçınırken numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Şeffaf oje alın ve slaytı kapatmak için kapak camının kenarlarına boyayın. Bir saat sertleşmesine izin verin ve ardından 20 santigrat dereceye yerleştirin.

Daldırma yağı ile 63X objektif kullanarak konfokal mikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Bu protokolü kullanarak, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri, ışınlamadan önce ve sonra DNA hasarı onarım proteinleri için boyandı ve DNA hasarının bir belirteci olan gama H2AX ve homolog rekombinasyon onarımı için bir belirteç olan RAD51 gibi biyobelirteçler için değerlendirildi. Replikasyon stresinin bir belirteci olan RPA, homolog olmayan enjonktüre edici bir belirteç olan 53BP1 ve GS2 faz hücre döngüsü belirteci Geminin de bu teknik kullanılarak değerlendirildi.

BME tırnakları depolimerize olma eğilimindedir, bu nedenle sabitleme ve aspirasyondan sonra çok dikkat etmek hayati önem taşır. Organoidlerin hasarını ve DNA hasar yanıtını monte etme yeteneğini belirlemek için antijenlerin analiz edilmesi, kemoterapötik direncin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir.