E.coli gibi bakteriler konjugatif plazmidlerde antibiyotiğe dirençli genler taşırlar. Bu bakteri hastanelerde, hayvanlarda komensal olarak yaşayan ve su ortamlarında bulunabilir. Doğal konjugatif plazmidler, farklı bakteri soyları arasında genlerin yatay transferidir.
Konjugatif plazmidlerin tespiti ve oluşum konjugasyon etkinliği için metalleri sunuyoruz. Bu teknik basit ve hassastır. Plazmid, donör ve alıcı için belirteçler kullandığı için hassastır.
Bu belirteçler seçilebilir, yani çok büyük popülasyonlardaki tek olayları tanımlayabilirler. Sunduğumuz protokoller, antibiyotik direncinin evrimini incelemek ve epidemiyolojik gözetim için, yani ilaca dirençli genlerin akışını izlemek için yararlıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Caison Warner ve CAMS laboratuvarından bir lisans öğrencisi olan Pepper St.Clair olacak.
İlk gün, donörleri ve alıcıyı, antibiyotiksiz MacConkey agar olan C ortamındaki gliserol stoklarından ayrı ayrı çizin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, her donör ve alıcı için 14 mililitrelik bir kültür tüpü etiketleyin. Her donör ve alıcının tek bir kolonisini seçin ve bunları 37 santigrat derecede 18 saat boyunca 200 RPM'de iki mililitre Mueller Hinton Et Suyunda büyütün.
Üçüncü günde, vorteks olmadan 600 nanometrede gece boyunca yetiştirilen kültürün 10 katı tuzlu suyun optik yoğunluğunu ölçün. Gerekirse, optik yoğunluğu ikiye ayarlamak için sterilize edilmiş salin çözeltisi kullanın. Donör ve alıcı suşlarını gösteren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünü çiftleşme tüpü olarak etiketleyin.
Her bir donörün ve alıcının ayarlanmış süspansiyonunun 500 mikrolitresini çiftleşme tüpüne aktarın ve süspansiyonu ters çevirerek yavaşça karıştırın. Çiftleşme tüpünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 G.Pipet, peleti rahatsız etmeden çiftleşme tüpünden 800 mikrolitre süpernatant çıkarır ve tüpte 200 mikrolitre bırakır. Çiftleşme tüpünü 37 santigrat derecede 18 saat boyunca inkübe edin.
Ayrıca, negatif bir kontrol olarak, B medyasındaki bağışçıların ve A medyasındaki alıcıların gece boyunca kültürünü çizin ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, dördüncü günde, çiftleşme tüpüne 800 mikrolitre tuzlu su çözeltisi ekleyin ve vorteks yaparak yeniden askıya alın. Çiftleşme süspansiyonunun seri seyreltmelerini yapın ve ortam plakalarına her seyreltmenin 100 mikrolitresini ekleyin.
Plakalar kuruduktan sonra, 37 santigrat derecede 18 saat boyunca inkübe edin ve makalede açıklandığı gibi donör başına veya alıcı başına konjugasyon sıklığını hesaplayın. Basit bir kaynatma hazırlığı ekstraksiyon yöntemi kullanarak bakteri hücre duvarlarından DNA ekstraksiyonu yapıldıktan sonra, 1.5 mililitrelik bir tüpü, gerekli PCR tüplerinde gen ve numune adıyla bir havuz olarak etiketleyin. Havuz olarak etiketlenmiş tüpün içine steril su, PCR ana karışımı, primerler ve polimeraz ekleyin.
Soğutulmuş bir ortamda en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Şablon DNA'yı ilgili tüpe ekleyin ve PCR tüplerini kapaklarla sabitleyin. PCR tüplerini termosikler içine yerleştirin ve makalede açıklandığı gibi direnç genleri ve replikonlar için programı başlatın.
Amplikon onayı için, 250 mililitrelik bir şişeye agaroz ve TAE tamponu ekleyerek% 1'lik bir agaroz jeli hazırlayın ve agarozu bir mikrodalga kullanarak eritin. Agaroz çözeltisi yaklaşık 55 santigrat dereceye soğutulduktan sonra, bir duman davlumbazının altında, altı mikrolitre SYBR Green ekleyin ve karıştırın. Dökülmeyi önlemek için jeli yapışkan bantla kapatılmış bir tepsiye dökün ve jelin bulanıklık görünene kadar 15 ila 25 dakika boyunca ayarlanmasına izin verin.
Yapışkan bandı çıkardıktan sonra, jeli elektroforez odasına yerleştirin ve jeli örtmek için TAE tamponu ekleyin. Altı kez DNA jel yükleme boyasının beş mikrolitresini, en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek her reaksiyonun 25 mikrolitresi ile karıştırın. Daha sonra kabarcıklardan kaçınarak karışımı kuyucuklara yükleyin.
İlk kuyucuğa bir kilobaz çifti DNA merdiveninin dört mikrolitresini ekledikten sonra, oda kapağını kapatın ve jeli 120 volt ve 400 miliamperde 60 dakika çalıştırın. Jeli UV ışığı altında görselleştirin ve görüntüyü kaydedin. MacConkey agar, büyük pembe koloniler üreten laktoz pozitif donörleri, laktoz negatif olan ve daha küçük soluk sarı koloniler üreten alıcıdan ve transkonjugantlardan ayırt etti.
Bir donör suşu SSW4955'in beş konjugasyon etkinliğinin hepsi aynı büyüklük sırasına sahipti, bu da konjugatif plazmidin mobilizasyonunun transkonjugant tanımlama için kullanılan seçimden bağımsız olarak tespit edilebileceğini gösteriyordu. Donör suşu SSW7037 ise üç kat daha düşük bir konjugasyon etkinliği gösterdi, bu da farklı donörlerin ve plazmid tiplerinin konjugasyon verimliliklerinin aynı alıcılarla karşılaştırılmasına izin verdi. PCR ürünlerinin jel elektroforezi, transkonjuganlarda beklenen replikonların varlığını doğruladı.
Bu tahlil tamamen seçilebilir belirteçlere bağlıdır. Her seçimin çalıştığını doğrulamak için kontroller yapılmalı ve transkonjuganların kolorimetrik olarak veya PCR ile doğrulanması gerekir. Burada sunulan protokoller, in vivo veya biyofilm modellerinin konjugasyon çalışması ve konjugasyon verimliliğini modüle eden değişkenlerin incelenmesi için uyarlanabilir.
Mobilize edilebilir plazmidleri ölçekte tespit etmek için kullanılan bu protokol, genlerin çevre üzerindeki akışını anlamamıza ve konjugasyonun verimliliğini etkileyen değişkenleri incelememize büyük ölçüde katkıda bulunacaktır.
