Bu protokol, lipit damlacıklarının miktarının belirlenmesine ve morfolojilerinin ve hücre altı dağılımlarının lif tipine özgü bir şekilde analiz edilmesine izin verir. Bu teknik, farklı kasların aynı anda işlenmesini, zamandan tasarruf edilmesini ve bağımsız olarak işlendiğinde ortaya çıkabilecek eserlerden kaçınılmasını sağlar. Ayrıca lipit damlacıklarının miktarının otomatikleştirilmesine izin verir.
Miyostoeatoz deniz kaslarında değerlendirildi, ancak bu protokol obezite, yaşlanma ve kanser gibi farklı koşullarda insanlara çevrilebilir. Aynı lifleri paralel kesitte tanımak zor olabilir, ancak akson tweaks veya kas iğleri gibi dikkat çekici yapılar, araştırmacının her iki slaytta da aynı lifleri bulmasına yardımcı olacak iyi işaretlerdir. Kas örneğinin iki seri kriyo dondurulmuş enine kesitini önceden etiketlenmiş iki yapışma slaytına yerleştirmeye başlamak için.
Bir slayt lif tiplerini belirlemek için, diğeri lipit içeriğini ölçmek için. Kas lifi tipinin immünohistokimyasal tespiti için, bölümleri hidrofobik bir kalemle çizilmiş bir taslak ile çevreleyin. Nemli bir odaya koyun ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca buz gibi soğuk 0.1 molar PBS ile durulayın.
Ardından, PBS'yi çıkarın, engelleme çözeltisini slayda ekleyin ve 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Daha sonra bloke edici çözeltiyi çıkarın ve slaytları birincil antikorları içeren çözelti ile 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları PBS ile oda sıcaklığında her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
İkincil antikorları içeren çözeltiyi ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin, bundan sonra slaytı ışıktan uzak tuttuğunuzdan emin olun ve PBS'de her biri beş dakika boyunca üç yıkamaya devam edin, ardından slaytı çift damıtılmış suda durulayın, fazla suyu çıkardıktan sonra, slaytı antifade reaktifi ile monte edin ve ışıktan korunan dört santigrat derecede saklayın. Lipit damlacığını gövdeyle boyamak için, kas bölümünü 10 dakika boyunca buz gibi soğuk 0.1 molar PBS ile durulamadan önce hidrofobik bir kalem tarafından çizilmiş bir taslak ile çevreleyin. Her iki slayt da aynı anda boyanmalıdır.
Bölümü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metanol içermeyen soğuk yüzde dört paraformaldehit ile sabitleyin. İlk hızlı durulamadan sonra, slaytları beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Slaytı PBS'de% 5 normal keçi serumu ile insan odasında bir saat boyunca bloke edin.
Bunu takiben, slaytın PBS'de% 2 normal keçi serumu ve sıçan anti-lamininden oluşan birincil antikor çözeltisi ile 90 dakika boyunca inkübe edilmesi. Slaytları PBS'de üç kez yıkadıktan sonra, bir sonraki inkübasyonu PBS'de keçi, anti-sıçan, Alexa fluor 647 antikoru içeren ikincil antikor çözeltisi ile bir saat boyunca oda sıcaklığında gerçekleştirin. Slaytın ışıktan korunduğundan emin olun.
Kuluçkadan sonra slaytı PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, bölümü dapi ve bodipy çözeltisi ile 20 dakika inkübe edin. Hızlı bir durulamadan sonra, PBS ile üç kez ve bir kez çift damıtılmış suyla yıkayın, ardından fazla suyu çıkarın ve bölümü bir anti-solma reaktifi ile monte edin.
Kas tarandıktan sonra, yakalanan dijital görüntüleri yeniden yapılanma için herhangi bir görüntü işleme yazılımına yükleyin. Fiber morfolojisine ve kas bölümünün histolojisine dayanarak, görüntüyü tüm kanallar birleştirilerek uygun bir biçimde kaydedin. Bodipy görüntü gözlemi ve elde etmek için, makalede açıklandığı gibi, 40 X yağ daldırma objektif lensi ve 1.4'lük sayısal diyafram açıklığı ile bir konfokal mikroskop için parametreleri ayarlayın.
Bodipy ile 558, 568 ve laminin Alexa fluor 647 arasındaki çapraz konuşmayı önlemek için; Konfokal yazılımdaki sıralı tarama modunu kullanın. 488 nanometre lazer çizgisini veya argon lazer hattını kullanarak bodipy ve 493, 503'ü heyecanlandırın ve 561 nanometre diyot lazer hattını kullanarak bodipy ve 555.568'i heyecanlandırın. Son olarak, seçilen boyaya bağlı olarak 640 nanometre diyot lazer hattı ile laminin Alexa fluor 647'yi tespit edin, emisyon oranlarını bodipy için 570 ila 650 nanometre ve 493, 503 olarak ayarlayın.
Ve bodipy ve 558, 568 için 565 ila 620 nanometrede. Laminin için emisyon aralığını 656 ila 700 nanometre olarak ayarlayın. Ardından, aralık göstergesinde doymuş piksellerin algılanmasını önlemek için kazancı ve dijital kazancı uygun şekilde ayarlayın.
Ofseti ayarlayarak arka plan sinyalini düzeltin. Konfokal mikroskoptaki fiber tipini tanımlamak için, fiber tipi immün algılama ile daha önce yeniden yapılandırılmış slaytın görüntüsünün kontrol edilebileceği bir dizüstü bilgisayar kullanın. Bir grup lif doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, bodipy ve laminin kanalları ile görüntüyü elde edin.
Her görüntüyü, biyoformatın Fiji'den içe aktarıcısının yardımıyla açın. Görünüm yığını seçeneğinin altında hiper yığını, ardından renk modunu ve varsayılanı seçin. Otomatik ölçeklendirme penceresinin seçili olduğundan emin olun.
Laminin kanalına bağlı olarak lifin sarkolemasını manuel olarak seçmek için serbest el seçim aracını kullanın. Ayrıca, yatırım getirisi penceresinde ilgilenilen bölgeyi kaydetmek için klavyedeki T düğmesine basın. Fiji'nin ana penceresine gidin ve analizleri analiz et ve ölçümleri ayarla'ya tıklayın.
Ardından açılır pencerede alanı seçin ve yükseltilmiş çap için, kalan kutuları ve diğer parametreleri varsayılan olarak göründükleri gibi işaretlemeden bırakın. Seçilen elyafın yükseltilmiş çapı için alanı ve minimum alanı elde etmek için ROI penceresindeki ölçüye tıklayın ve daha sonra kullanmak üzere not edin. Elyafın orta kısmını sınırlamak için yükseltilmiş çap için minimumun altıda birinin değerini hesaplayın.
YG penceresine tıklayın, ilk YG'nin bir kopyasına sahip olmak için ekle'ye tıklayın ve pencerede görünen ikinci YG'yi seçin. Fiji'nin ana penceresinde, düzenle'yi tıklayın, ardından seçin ve büyütün. Daha önce hesaplanan değeri, sayıdan önce eksi işareti ile tanıtmak ve Tamam'a tıklamak için.
YG penceresinde, ekle'ye tıklayın, Üçüncü bir YG görünmelidir ve ikinci YG'yi silmek için silin. ROI penceresinde her iki ROI'yi de seçin ve ZOR'dan daha fazlasına tıklayın ve ekleyin, fiberin çevresine karşılık gelen üçüncü bir ROI'nin görünmesini bekleyin. Aynı liflerin yeniden analiz edilmesi gerekiyorsa, daha fazlasını tıklayarak yatırım getirilerini kaydedin ve ardından kaydedin.
Bodipy kanalını seçin ve Fiji'nin ana penceresindeki resim, ayar ve eşik sekmelerine tıklayarak eşik aracını açın. Eşik açılır penceresinde değerleri 70 ve 255 olarak ayarlayın. Ardından YEN ve siyah beyaz yöntemi seçin.
Koyu arka plana tıklamadan önce. Sonunda uygula sekmesine basın. Fiji'nin ana penceresine gidin ve analizleri analiz et ve ölçümleri ayarla'ya tıklayın.
Açılır pencerede, alan, alan kesiri ve eşik sınırını seçin. Kalan kutuları ve parametreleri varsayılan olarak bırakın. YG penceresine gidin ve ilk YG'yi seçin.
Fiji'nin ana penceresinde analiz et'e tıklayın, ardından parçacıkları analiz edin aracı. Analiz edilen parçacıklar penceresinde değerleri ikiden sonsuzluğa ayarlayın ve piksel kutusunu işaretleyin. Varsayılan döngüsellik değerini koruyun ve Tamam'ı tıklatmadan önce özetle'yi seçin.
Lifin merkezinin ve çevresinin değerlerini elde etmek için, her seferinde ikinci ve üçüncü ROI'nin seçimini tekrarlayın. Ardından, dosyayı tıklayarak sonuçları kaydedin, ardından özet penceresindeki gibi kaydedin. Dosya adına fiber türünü ekleyin.
Bu immünohistokimyasal protokol, farelerin, tip 1 ve 2A gibi yavaş oksidatif liflerin, tip 2X ve 2B gibi hızlı glikolitik liflerin ve hibrit liflerin varlığının tanınmasına izin verir. Kas lifinin yükseltilmiş çapı için alanı ve minimum alanı ölçerek, her bir lifin merkezi ve periferik alanlarını elde etmek için boyuta bağlı bir küçültme uygulandı. Akson dalları veya kas iğleri gibi her kas bölümünün dikkat çekici yapıları, her iki tarafta da aynı liflerin bulunmasına yardımcı olabilecek iyi işaretlerdir.
Konfokal mikroskopi ile bodipy laminin boyama elde etmek için açıklanan ayarlar. İzin verilen, lipit damlacıklarının boyutunun, sayısının ve dağılımının aynı anda üç ila altı lif arasında görselleştirilmesi ve analizi. Yöntem aynı zamanda üç önemli parametrenin, yani lipit damlacıklarının kapladığı lif alanının yüzdesinin, yoğunluğunun ve lipit damlacıklarının ortalama boyutunun nicelleştirilmesine izin verdi.
Yanlış dondurma prosedürü ve doğru izopentan sıcaklığına ulaşılamaması, kas liflerinin içinde buz kristali oluşumuna neden oldu. Kesitler enine hizalanmadığında, lipid damlacığı nicelleştirmesi ve lifler, kaslar veya hayvanlar arasında karşılaştırma yapılamadı. İkinci slaytın işlenmesi birincisiyle aynı anda yapılmalıdır.
Kriyoseksiyondan sonra slaytın 15 dakika boyunca hava ile kurutulması, lipit damlacıklarının boyutunu ve sayısını önemli ölçüde azaltacaktır. Bodipy, lipit damlacıklarının diğer hücre altı organellerle veya protein yığınının farklı bir spektrumun floresansı veya genetiği değiştirilmiş GFP modelleriyle etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Miyostoeatozun birçok hastalık için kötü bir prognostik faktör olduğu bildirilmiştir.
Bu nedenle, bu teknik bir hastalığın ilerlemesini izlemek veya bir tedavinin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
