Merhaba, bu videoda viral enfeksiyon üzerine m6A ve m5C epitranscriptomes'i nasıl keşfedebileceğinizi göstereceğiz. Deneye başlamak için, enfekte olmayanlar için 50 milyon hücreye ve enfekte olan durum için 50 milyon hücreye ihtiyacınız olacak. Analiz sırasında yüksek kaliteli bir veri kümesi elde etmek için evrensel bir enfeksiyon elde etmeniz gerekir.
Burada bu hücrelere HIV bazlı bir vektör bulaştırıyoruz ve FACS tarafından viral olarak kodlanmış GFP'yi ölçüyoruz. Bu durumda, enfekte hücrelerin% 80'ine sahiptik ve toplam RNA ekstraksiyonu ile başlayan iş akışına devam ettik. Bu yüzden hücreleri her biri 10 milyonluk aliquotlarda böldük ve 1 mL Trizol'a böldük.
Daha sonra hücre lisatine 200 mikroliner kloroform ekledik ve ters çevirme ile karıştırdık. Bu noktada, lilatın oda sıcaklığında üç dakika oturmasına izin verdik ve daha sonra tüm örnekleri dört derecede 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj ediyoruz. Burada gösterildiği gibi üç farklı aşamada bir faz ayrımı görmeyi bekleyeceksiniz.
RNA üst fazda oturur, bu nedenle organik tabakayı aktarmamaya dikkat ederek sulu fazı dikkatlice taze bir tüpe aktarın. Bu noktada, sulu faza 0,5 mL izopropanol ekleyin ve ters çevrilerek dikkatlice karıştırın. Numuneler daha sonra RNA yağışını sağlamak için 80 derecede bir saat kukübe edilebilir.
Yüksek hızda santrifüjleme üzerine, burada gösterildiği gibi güzel bir RNA pelet görebilmelisiniz. Peletin bozulmamasına dikkat ederek, ters çevrilerek veya pipetleme ile süpernatantı dikkatlice atın. Daha sonra RNA peletini% 75 moleküler sınıf etanol bir mL ile yıkayın.
Ve örneği kısaca girdapla. Santrifüjleme üzerine, güzel beyaz bir RNA peletini geri aldığınızı unutmayın. Üstnatan atın ve RNA peletini oda sıcaklığında 15 dakika kurutun.
Her peleti 20 mikroliter su ve havuza yeniden sunun, tüm numuneler aynı durumdan birlikte. Toplam RNA artık poli-A seçimi ile mRNA yalıtımı için hazırdır. 75 mikrogram RNA'nın her örneği için 200 mikroliter oligo-DT manyetik boncuk hazırlayın ve bir mL bağlama tamponunda yıkayın.
Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve bir karışım sırasında boncukların mıknatısa bağlanmasını izin verin. Üstnatant atın ve ikinci bir yıkama için prosedürü tekrarlayın. Daha sonra boncukları manyetik standlardan çıkarın ve 100 mikroliter bağlama tamponunda dikkatlice yeniden diriltin.
Bu noktada RNA örneğini 100 mikroliter suya yeniden sulanan aliquot başına 75 mikrogram RNA'ya bölerek hazırlayın. 100 mikroliter bağlama tamponu ekleyin ve 65 derecede iki dakika kuluçkaya yatırın. Sonra örnekleri aşağı çevirin ve buzda kuluçkaya yaslanın.
Daha sonra her RNA örneğine 100 mikroliter yıkanmış manyetik boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir tekerlek üzerinde bağlamaya izin verin. Kuluçkadan sonra, tüpü tekrar manyetik bir rafa yerleştirin ve bir dakika kuluçkaya yatmalarına izin verin. Sonra süpernatant taze bir tüp içine kurtarmak ve izolasyon ikinci bir tur için bir kenara tutun.
Boncukları 200 mikroliter yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından elution'a geçin. Manyetik boncuklardan poli-A seçilen RNA'yı elüte etmek için, her numuneye ve pipete dikkatlice 20 mikroliter buz gibi TRIS HCl ekleyin. Daha sonra RNA'yı boncuklardan serbest bırakmak için numunelerinizi iki dakika boyunca 80 derecede kuluçkaya yatırın.
Poli-A'nın seçili RNA'sını içeren süpernatantı, boncuk taşımayı önlemede dikkatli olarak taze bir tüpe aktarın. MRNA verimini artırmak için elüasyon adımı ve izolasyon adımı iki kez tekrarlanmalıdır. mRNA artık parçalanma adımında meRIP-Seq işlem hattına girmeye veya doğrudan bisülfit dönüştürmeye gitmeye hazırdır.
meRIP-Seq ardışık düzenine girmek için ilk adım mRNA parçalanmasıdır. Bunun için, 0.2 mL tüplerde 18 mikroliter aliquots bölünmüş beş mikrogram mRNA gerekir. Tutarlı veriler sağlamak için, hızlı ve o anda yalnızca birkaç örnekle çalışmak önemlidir.
Bu deney için, parçalanma 115 ila 200 nükleotid arasında bir boyutta parça elde etmek için optimize edilmiştir. Daha sonra, damlacığın tüp duvarına depolanmasında dikkatli olmak için 18 mikroliter mRNA içeren her tüpe iki mikroliter parçalanma reaktifi ekleyin. Reaktif ve RNA arasında aynı anda temasa izin vermek için tüm örnekleri döndürün ve 15 dakika boyunca 70 derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka bittikten sonra, 0,5 M EDTA'nın iki mikroliterini ekleyerek reaksiyonun durdurulması. Bu noktada, parçalı mRNA'nızı seçtiğiniz yöntemle arındırabilir ve parça analizörü ile bir RNA kalite kontrolüne devam edebilirsiniz. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak RNA yağışını uygulamadan önce parçanın boyutunu değerlendirmeye izin verir.
Burada dördüncü şeritte gördüğünüz gibi, her biri yaklaşık 150 nükleotidden oluşan örnek parçamız için de elde ediyoruz. Daha sonra meRIP-Seq ile devam ettik. İlk adım, anti-m6A antikorları veya IgG kontrolleri olan çift A / G manyetik boncuklardan oluşur.
Her reaksiyon planı için, 25 mikroliter manyetik boncukları taze bir tüpe aktarın. En az bir m6A'ya özgü koşula ve bir kontrol koşuluna ihtiyacınız olacağını lütfen unutmayın. Her 25 mikroliter boncuku 250 mikroliter IP tamponu ile yıkayın.
Boncukların yukarı ve aşağı borusunu açarak hafifçe yeniden depolayın ve boncuk ayrımına izin vermek için tüpü bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Manyetik boncukları aspire etmemeye dikkat ederek süpernatant'ı çıkarın ve atın ve yıkama adımını bir kez tekrarlayın. Daha sonra manyetik boncukları, orijinal boncuk hacminin her 25 mikroliteri başına 100 mikroliter IP arabelleği halinde yeniden diriltin.
Her koşul için bir tüp hazırlayın ve etiketleyin. Bizim durumumuzda, enfekte durum için iki tüp, m6A için bir ve IgG kontrolü için bir tüp ve enfekte olmayan durum için iki tüp olacak. Daha sonra her tüpe 100 mikroliter yıkanmış boncuk ekleyin.
Boncuklar artık spesifik antikorlar veya IgG kontrolleri ile birleştirilecek şekilde hazırdır. 100 mikroliter yıkanmış manyetik boncuk içeren her tüpe beş mikrogram spesifik anti-m6A antikoru veya anti-IgG kontrol antikoru ekleyin. Tüpü dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırarak antikor boncuklarının konjugasyonuna izin verin.
Bu arada, örnek hazırlamaya devam edin. Planlanan her durum için, m6A'ya özgü veya IgG kontrolü, başlangıç malzemeniz 2,5 mikrogram parçalanmış mRNA resüspended 100 mikroliter su olacaktır. 500 mikroliterlik son reaksiyon hacmine sahip olmak için her numuneye 295 mikroliter su ekleyin.
Daha sonra numune başına toplam 200 birim için mikroliter başına 40 birim olarak konsantre beş mikroliter RNAase inhibitörü ekleyin ve hafifçe karıştırın. Son olarak her tüpe 100 mikroliter 5X konsantre IP tamponu ekleyin. Bağışıklık çökelttirilmiş reaksiyon için numuneler hazır.
Dönen tekerlekten antikor ile birleştirilmiş manyetik boncukları alın ve aşağı çevirin. Daha sonra, önceden hazırlanmış örneklerin 500 mikroliterini, spesifik antikorlarla birleştirilmiş her 100 mikroliter boncuk için ekleyin. Boncukları tamamen yeniden çıkarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın.
onları veya meRIP reaksiyonunuzu iki saat boyunca dört derecede dönen bir tekerlekte kuluçkaya yatırın. Kuluçka bittikten sonra, her tüpü aşağı çevirin ve boncuk ayrımına izin vermek için bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Daha sonra ilişkisiz fraksiyonu çıkarın ve taze bir tüpe yerleştirin ve gerekirse daha fazla analiz için saklayın.
Mıknatısı raftan çıkarın ve tüm numuneleri 500 mikroliter IP tamponunda yeniden depolayın. Yukarı ve aşağı pipetleme ile her numuneyi dikkatlice yeniden dirildi. Mıknatısı rafa yerleştirin, bir dakika kuluçkaya yatırın ve ardından süpernatant'ı dikkatlice çıkarın.
Yıkamayı iki kez tekrarlayın ve ardından elution ile devam edin. Her bir örnek, m6A spesifik ve kontrol çifti için, 20 milimoler saflaştırılmış m6A içeren 225 mikrolitrelik elution tampon hazırlayın. Ardından numune başına 100 mikroliter elütion tampon ekleyin.
Tüm örnekleri bir rocker'da dört derecede bir saatte kuluçkaya yatır. Daha sonra tüm m6A zenginleştirilmiş RNA numunesini taze bir tüpte toplayın ve ikinci bir elution turu ile devam edin. m6A zenginleştirilmiş RNA'yı tercih yönteminizle arındırın ve bu noktada numuneler kütüphane hazırlığı ve dizileme için hazırdır.
m5C değişikliğini araştırmak için bisülfit dönüşümünü kullanıyoruz. Deneye 500 nanogram poli-adenilasyonlu RNA ile başlayın. İsteğe bağlı olmasına rağmen, ribozomal temsili ve piyasada bulunan sentetik sıranın 0,5 mikroliterini sağlamak için poly-A tükenmiş RNA'nın örnek 500 pikogramını eklemek, sıralama sırasında bisülfit dönüşüm oranını değerlendirmenizi sağlayacaktır.
Numunenizi suda 20 mikroliterlik son hacme ayarlayın ve ardından her numuneye 130 mikroliter RNA dönüştürme reaktifi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın ve tüplerin yan tarafında damlacık kalmadığından emin olmak için tüm numuneyi aşağı çevirin. Tüm numuneleri bir PCR makinesinde beş dakika boyunca 70 derecelik üç denatürasyon döngüsü ve 45 dakika boyunca 54 derecede bisülfit dönüşümü için kuluçkaya yatırın.
Doğrudan boş bir sütuna, 250 mikroliter RNA bağlama arabelleğine, 150 mikroliter bisulfite dönüştürülmüş numunenize ekleyerek sütun içi deaminasyon gerçekleştirin. Numuneyi yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırın, ancak sütun filtrelerine dokunmamaya dikkat edin. Örnek RNA bağlama tampon karışımına doğrudan sütuna 400 mikroliter% 95-100 etanol ekleyin.
Kapağı kapatın ve ters çevrilerek hemen karıştırın. Örneğinizi 30 saniye döndürün ve akışı atın. Kolonunuzu yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından her sütunun ortasına 200 mikroliter desülfonasyon çözeltisi ekleyin.
Tüm numunenizi oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Numuneyi 30 saniye döndürün ve ardından iki tur yıkama ile devam edin. Her numuneye 400 mikroliter yıkama tamponu ekleyin, tam hızda 30 saniye santrifüjleyin ve akışı atın.
Sütunu yeni bir boş tüpe yerleştirin ve ikisülfit dönüştürülmüş RNA'yı 20 mikroliter suya dökün. RT-qPCR ile bisülfit dönüştürme verimliliğini kontrol edin ve ardından kütüphane hazırlama ve sıralamaya geçin. Biyo-enformatik analiz üzerine, bu iş akışıyla elde edebileceğin sonuçlara bir örnek aşağıda verilmiştir.
Burada HIV ile enfekte olmuş hücrelerin epitranscriptom'ını enfekte olmayan hücrelere karşı karşılaştırıyoruz. Enfeksiyondan 24 saat sonra. A panelinde, m6A epitranscriptome'yi keşfederken elde ettiğimiz sonuçları görebilirsiniz.
Bu grafikte, m6A zenginleştirilmiş okumaları meRIP-Seq analizi üzerine çiziyoruz. Çinko parmağın enfeksiyondan 24 saat sonra hipermetilasyona sahip olduğunu güzelce görebiliyoruz. Paneldeki m5C epitranscriptome araştırması için aynı analiz türünü gerçekleştirdik B.In bu grafikte, metillenmiş olmayan her sitozin kırmızı renkte görüntülenirken, m5C metillenmiş sitozin oranı mavi renkte gösterilmiştir.
Gördüğünüz gibi PHLPP1, HIV sonrası enfeksiyondan 24 saat sonra hiper metillenmiş üç sitozin. Genel olarak, bu iş akışı enfekte hücrelerin hem M6A hem de m5C epitranscriptomlarını araştırmaya izin verir ve viral parçacıklara da uygulanabilir. Viral enfeksiyonun anlaşılması konak epitranscriptomic manzarayı değiştirebilir, bize yeni bir düzenleme katmanına erişim sağlayacaktır.
Viral enfeksiyon üzerine diferansiyel metillenmiş transkriptlerin araştırılması elbette yeni terapötik müdahale için değerli bir kaynak sağlayacaktır. Aşağıdaki bağlantıda, zaman içinde HIV enfeksiyonu üzerine diferansiyel metillenmiş transkriptin araştırılması için açık erişim kaynağımızı bulabilirsiniz.
