Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) tarafından F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M .), Amerikan Diyabet Derneği Yenilikçi Temel Bilim Ödülü (#1-19-IBS-192'den G.J..M.)'ye) ve NIDDK destekli Beslenme Obezitesi Araştırma Merkezi (DK-035816), Diyabet Araştırma Merkezi (DK-017047) ve Diyabet, Washington Üniversitesi'nde Obezite ve Metabolizma Eğitimi T32 DK0007247 (T.H.M) hibesi.

Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Rehberi uyarınca onaylandı ve washington Üniversitesi'nde hem Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hem de Çevre Sağlığı ve Güvenliği tarafından onaylandı.
1. Açılı koordinatların hesaplanması
<ol><li>Bir koronal beyin atlası kullanarak, hipotenüsün hedef ilgi bölgesinden geçmesi için sağ üçgeni işaretleyin. Temsili örnekte (Şekil 1), hipotalamik ventromedial çekirdek (VMN) koronal orta çizgiden 15 ° açıyla hedeflenmiştir. NOT: Şekil 1'de gösterilen dönme ekseninin yerleşimi (ve dolayısıyla C tarafının uzunluğu) rastgeledir ve herhangi bir beyin bölgesini hedef almak için değiştirilebilir. Bu mantıksız görünse de, protokoldeki daha sonraki adımlar başın z eksenindeki konumunu, bu noktanın stereotaktik dönme merkeziyle hizalanacak şekilde ayarlayacaktır (bkz. bölüm 6). Bununla birlikte, baş tutucu aparatının fiziksel kısıtlamaları nedeniyle 15 ° 'lik bir koronal dönüş açısını aşmamanız önerilir.</li>
	<li>İstenen açıyı (a) ve B tarafının tahmini uzunluğunu belirleyin ve A ve C taraflarının uzunluğunu hesaplamak için trigonometri kullanın. Bu adım, dönüş sırasında başın düzgün bir şekilde konumlandırılması için önemlidir. NOT: Şekil 1'dekiörnekte, atlas kılavuz çizgileri B tarafının uzunluğuna yaklaşık olarak kullanılır ve 7.576 mm uzunluk elde edilir. Bu bilgiler, A tarafının uzunluğunu hesaplamak için kullanılır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> Bu örnekte, 2,03 mm, baş 15° döndürüldüğünde fiberoptiküllerin beyne girdiği orta çizgiden R/M mesafesini gösterir.<ol>
<li>İsteğe bağlı olarak, D/V koordinatını yaklaşık olarak yaklaşık olarak C tarafının uzunluğunu hesaplayın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> NOT: 1) Hipotenozun uzunluğu (C) enjeksiyon derinliğini temsil etmez, ancak düz enjeksiyonlar için B tarafına karşı artan uzunluğa uyum sağlayacak şekilde ayarlanması gerekebilecek D /V koordinatının belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Bu nedenle, D/V koordinatını optimize etmek için test enjeksiyonlarının yapılması önerilir. 2) VMN'yi hedefleyen bu örnekte, iki koordinat kümesi elde edilir: biri açılı olmayan mikroenjeksiyon için (A/P = -1.4, R/L = 0°'de 0,4, D/V = -5,7) ve açılı fiberoptik implantasyon için bir tane (A/P = -1,4, R/L = 15°'de 0,0, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Açılı prosedür için stereotaksın hazırlanması
<ol><li>Stereotaktik çerçevenin ve mikromanipülatörnün kalibre edildiğini onaylayın (tam protokol için Kopf kılavuzuna bakın).</li>
	<li>Orta yükseklik göstergesini baş tutucu taban plakasının soketine yerleştirin.</li>
	<li>Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin, ardından kapsamı görün. Artılar hizalanana ve ölçer nişangahlara odaklanana kadar mikromanipülatörnün konumunu ayarlayın. NOT: Bu adım sırasında, kapsam baş tutucunun dönme merkezinin odak düzlemine yer almaktadır. Kurulduktan sonra, mikromanipülatör kalan adımlar sırasında hareket ettirilememelidir.</li>
	<li>Kulak çubuklarını tutuculara yerleştirin ve her iki taraftaki gösterge çizgileri 0'da olacak şekilde ortalayın (Şekil 3A).</li>
	<li>Merkez yükseklik göstergesinin çapraz işaretinin üzerindeki x veydüzlemlerindeki kulak çubuklarını orta hizalamak için baş tutucudaki medial-lateral ve ön-arka düğmeleri kullanın (Şekil 3A).</li>
	<li>Kulak çubuğu konumunu z ekseninde hizalamak için kulak çubuklarını tutucudan çıkarın ve orta yükseklik ölçeri çıkarın. Kulak çubuklarını değiştirin ve 0'da tekrar ortalayın.</li>
	<li>Dürbünle görün. Sırasıyla dikey vites değiştirme düğmesini (Şekil 3B) ve koronal eğim düğmesini kullanarak, dürbün çaprazları koronal dönüş boyunca kulak çubukları arasında ortalanana kadar kulak çubuklarını alçaltır ve döndürün.</li>
	<li>Stereotaks artık kalibre edilmiş ve hazırdır. Baş tutucunun pozisyonunda daha fazla ayarlama yapmayın.</li>
</ol>3. Enjeksiyon/implantasyon için malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm aletlerin, cerrahi aletlerin ve malzemelerin sterilize olduğundan ve stereotaksın yanındaki steril bir cerrahi alana yerleştirildiklerinden emin olun.</li>
	<li>Viral yapıları biyogüvenlik seviyelerine ve ilgili kurumsal biyogüvenlik düzenleyici gerekliliklerine göre ele alın ve saklayın.</li>
	<li>Uygun elleçleme uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanmaya özen ederek virüsü şırınna çekin.</li>
</ol>4. Anestezi
<ol><li>Ameliyattan önce farenin vücut ağırlığını kaydedin.</li>
	<li>Isoflurane kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturun.</li>
	<li>Kıtırlık tepkisi olmayana kadar bir parmak sıkışma testi yaparak farenin derinlemesine uyuşturulmasını sağlayın. Hayvan güçlü refleksler göstermeye devam ederse, anestezi konsantrasyonu ve / veya süresini artırın.</li>
	<li>Ameliyat sırasında nemli tutmak için her göze göz merhemi uygulayın.</li>
	<li>Saç kesme makinesi ile kafa derisini kulakların hemen arkasından gözlerin hemen arkasına tıraş edin.</li>
	<li>Fareye IACUC onaylı analjezik sağlayın.</li>
	<li>Cerrahi işlem boyunca hayvanı sürekli izleyin ve termal destek sağlayın.</li>
</ol>5. Cerrahi prosedür
<ol><li>Üst kesici dişleri ısırık çubuğundaki boşluğa yerleştirerek, dilin ısırık çubuğunun altında olduğundan emin olarak başı baş tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Kulak çubuklarını dış işitsel meatus'a hafifçe yerleştirerek başı kulak çubuklarına sabitleyin ve kulak çubuklarının simetrik olarak yerleştirilmesini sağlayın (yetişkin bir fare için genellikle üç ila dört). Bu adım, başın sabit ve dönme için ortalanmış olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir.</li>
	<li>Aseptik olarak traş kesi bölgesini üç alternatif betadin ve alkol sürüntümü ile veya alternatif kurumsal olarak onaylanmış cerrahi bölge hazırlığı ile hazırlayın.</li>
	<li>Steril bir cerrahi alanı korumak ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için hayvanın üzerine cerrahi bir örtü yerleştirin.</li>
	<li>Kafa derisinin sagittal orta çizgisi boyunca bir kesi yaparak kafatasını ortaya çıkarın. Herhangi bir fasyayı çıkarmak ve dikişleri açığa çıkarmak için kafatasının yüzeyini hafifçe kazıyın. NOT: Dikiş çizgilerinin görselleştirilmesi zorsa, dikiş görselleştirmesini iyileştirmek için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak kafatasına hidrojen peroksit uygulanabilir.</li>
	<li>Ortalama kapsamını tutucuya yerleştirin ve artı işareti bregma üzerine ortaleyin(Şekil 4, sol panel). Mikromanipülatör sıfır.</li>
	<li>Bregma-lambda (B-L) mesafesine dikkat ederek nişangahları caudally lambda'ya taşıyın. NOT: Dikiş çizgileri orta hat boyunca düz bir çizgi izlemezse, hem bregma hem de lambda aracılığıyla "en uygun çizgi" kullanılarak orta hattın kurulması önerilir. Bununla birlikte, yukarıdaki adımlar izlenirse, kapsam retikülünün ilk yerleşimi kulak çubukları arasında yarı yarıya olmalı ve B-L orta hat dikişine yakından yaklaşmalıdır.</li>
	<li>B-L mesafesi önemli ölçüde 4,21 mm'den küçük veya daha büyükse, 4,21 mm ± 0,2 mm B-L mesafesi elde etmek için atanan bregmayı kademeli olarak ayarlayın.</li>
	<li>Ortalama kapsamını hizalama göstergesiyle değiştirin. Probları lambda ve bregma üzerine yerleştirin ve baş tutucudaki sırt eğme düğmesini sagittal düzlemde (burun yukarı veya aşağı bakacak şekilde) hizaya ayarlayın, ardından bregma'yı yeniden atamak için merkezleme kapsamını kullanın.</li>
	<li>Koronal eğim düğmesini kullanarak koronal düzlemde seviyelendirmek için hizalama göstergesini kullanın. Kafatasındaki yüzey deformasyonlarını hesaba katmak için rostral/kaudal eksen boyunca birden fazla noktada ölçüm alın.</li>
	<li>0° dönüş konumu olduğu için koronal eğim düğmesinin kadranındaki konuma dikkat edin.</li>
</ol>6. Açılı koordinatlar için dönüşün merkezi eksenlerini hizalama
<ol><li>Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin ve mikromanipülatörü bölüm 1'den hesaplanan koordinata yerleştirin. Açılı implantasyon için R/M koordinatının A tarafının uzunluğuna karşılık geldiğini unutmayın.<ol>
<li>Şekil 1'dekiörnekte, VMN'yi hedefleyen fiberoptik yerleştirme için açılı koordinatlar (A/P = -1.4, R/L = [2.03] 0° koronal rotasyonda, [0.00] 15° koronal rotasyonda, D/V = -5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kapsamın aşağı doğru görülmesi ve bu koordinatın işaretlenerek (VMN örneği başına orta hattan R/L 2,03 mm; Şekil 4, orta panel). Bu işaret, kafa döndürüldüğünde canüllerin beyne gireceği noktayı temsil eder.</li>
	<li>Mikromanipülatörü orta hat üzerinde yeniden konumlandırın (R/L = 0,00). Başı bölüm 1'de hesaplanan açıya döndürmek için koronal eğim düğmesini kullanın.<ol>
<li>Kapsam artı işaretleri işaretle zaten hizalanırsa, bölüm 7'ye geçin.</li>
		<li>Kapsam artı işaretleri referans işaretiyle hizalanmazsa, çapraz artı işaretleri işarete mümkün olduğunca yakın hizalanana kadar dikey kaydırma düğmesini (Şekil 2) kullanarak z eksenindeki kafa konumunu ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başı 0° koronal konuma geri döndürün. Dikey kaydırma adım 6.3'te ayarlanmışsa, ortalama kapsamını kullanarak bregma'yı yeniden atayın.</li>
	<li>Kafa döndürüldüğünde artı işaretleri sürekli olarak referans işaretine çarpana kadar 6.3 ve 6.4 adımlarını yineleyin (Şekil 4C).</li>
	<li>Bu noktada, bölüm 1'de kurulan rastgele dönme noktası artık stereotaktik dönme merkezi ile hizalanmalıdır.</li>
</ol>7. Mikroenjeksiyon
<ol><li>Stereotaktik matkabı tutucuya yerleştirin ve mikromanipülatörü ilk enjeksiyon koordinatına manevra yap.<ol>
<li>VMN'yi hedefleme örneğine göre, kafa düzken A/P = -1.4 ve R/L = 0.4'te detaya gidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Matkabı, uç kafatasının hemen üstünde olana kadar diraye kadar dirdir. Matkabı açın ve uç kafatasını (dura değil) delinene kadar hafifçe diriltin.</li>
	<li>Kontrallateral enjeksiyon bölgesi için tekrarlayın.</li>
	<li>27-30G iğneye (örneğin, steril 0,5 mL insülin şırıngası) 90° büküm sokmak için steril bir iğne sürücüsü kullanın ve bükülen iğneyi dura mater'i hafifçe dürtmek için kullanın.</li>
	<li>NOT: Kanama meydana gelirse, steril pamuk uçlu bir aplikatör ile basınç uygulayın ve kanama durana kadar steril suyla temizleyin.</li>
	<li>Enjekte etmeye hazır olduğunuzda, stereotaktik tutucuya doldurulmuş bir Hamilton şırıncısını dikkatlice yerleştirin. NOT: Mikromanipülatördeki koordinatlar artık yeni bir araca geçtikten sonra geçerli değildir. Enjeksiyon için yeni hedef olarak çapak deliğinin merkezini kullanın.</li>
	<li>İğneyi çapak deliğinin üzerine dikkatlice yerleştirin.</li>
	<li>Çapak deliğinin ortasındaki dura hafifçe dokunana kadar iğneyi dira diri diri diri dürt. KRİtİk: Mikromanipülatöre sadece z ekseninde sıfır, böylece stereotaktik merkezleme kapsamı ve matkap için mikromanipülatördeki koordinatlar korunur.</li>
	<li>İğneyi yavaşça beyne diri olun, iğnenin çapak deliğinin kenarında sapmamasını sağlamak için yakından seyredemeyin. D/V enjeksiyon koordinatı için 0,05 mm ventral olana kadar alçalmaya devam edin ve 1 dakika bekleyin. Bu ekstra adım, iğne çıkarmada viral geri akışı en aza indirmek için küçük bir "cep" oluşturur.</li>
	<li>İğneyi yavaşça D/V koordinatlarına kaldırın ve enjeksiyona başlayın. NOT: Akış hızı ve hacmi hedef bölgeye ve deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. VMN nöronlarının optogenetik susturulması için yeterli kapsama alanı istenir, bu nedenle 1 nL / s hızında 200 nL virüs enjekte edilir.</li>
	<li>Mikroenjeksiyondan sonra, çekilme sırasında virüs efflux'ını en aza indirmek için enjeksiyon yerinde 10 dakika bekleyin.</li>
	<li>Mikropipti beyinden yaklaşık 1 mm/dk hızla yavaşça çekin.</li>
	<li>İğne kafatasından temizlendikten sonra, iğnenin kan veya doku ile tıkanmadığından emin olmak için küçük bir miktarda virüs fırlatın. Devam etmeden önce virüsü çıkarmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.</li>
	<li>Kontralteral taraf için 7.6–7.12 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>İyileşmeyi iyileştirmek için mikroenjeksiyon çapak deliklerini kemik balmumu ile kapatın (Şekil 5B).</li>
</ol>8. Fiberoptik implantasyon
NOT: Viral enjeksiyondan sonra bilateral fiberoptik kanüller bölüm 1 başına hesaplanan açıyla implante edilir. Bu koordinatların bölüm 6'dan kafatasında işaretlenmiş olması gerektiğini unutmayın.
<ol><li>Açılı koordinatlar için 7.1 –7.4 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Başı 0° seviyesi konumuna getirin.</li>
	<li>Daha sonra, kemik vidaları için dört ek delik üretmek için el matkabı kullanın: iki ön ve iki arka olarak yerleştirilmelidir (Şekil 5A). Bunlar, fiberoptikleri kafatasına yapıştırmak için çapa görevi görecektir (Şekil 5D). NOT: Delikleri, fiberoptiğin kafatasının üzerinde bulunan yüksük kısmını barındıracak şekilde açılı koordinat çapak deliklerinden yeterince uzağa boşluk açtığınızdan emin olun.</li>
	<li>Mümkün olduğunca hafifçe, kemik vidalarını kafatasına sıkıca oturacak şekilde ayarlamak için küçük düz başlı tornavidayı kullanın, ancak beyne nüfuz etmezler.</li>
	<li>Fiberoptik bir kanolü, kanon tutucuya kenetleyin ve stereotaktik tutucuya yerleştirin.</li>
	<li>Mikromanipülatördeki koordinatların yeni alet için geçerli olmadığını tekrar belirterek başı hesaplanan açıya döndürün. İmplantasyon hedefi olarak açılı çapak deliklerinin merkezini kullanın.</li>
	<li>Fiberoptiği, çapak deliğinin ortasındaki duraya dokunana kadar küçümseyin (Şekil 5C). Mikromanipülatöre z ekseninde sıfır, ardından fiberoptiği yavaşça D/V açılı koordinata (VMN örneği başına-5,4) yavaşlatın.</li>
	<li>Fiberoptik yüksükleri ipsilateral ankraj vidalarına bağlamak için siyanoakrilat jeli kullanın, ardından bir mikropipette ucu ile bir hızlandırıcı uygulayın (Şekil 5D).</li>
	<li>Siyanoakrilat jel tamamen sertleştikten sonra, kanolün tutucuyu hafifçe gevşetin ve fiberoptik yüksükten temizlenene kadar yükseltin.</li>
	<li>Kontralatör açılı koordinat için 8,5–8,9 arası adımları tekrarlayın, sonra başı düzleştirin. Ekstra güvenlik için, siyanoakrilat jel ve hızlandırıcı ile iki açılı fiberoptik kanolün arasında ek bir bağlantı yapın (Şekil 5D).</li>
	<li>Küçük, nispeten ince miktarda diş çimentosu hazırlayın. Fiberoptik kanonların çapa vidalarını ve tabanını iyice örttürdklerinden emin olarak kafatasının yüzeyine uygulayın. Fiberoptik yama kabloları ile sonraki çiftleşme için yeterince yüksük açık bırakın.</li>
	<li>Çimento kuruduktan sonra fareyi stereotaktik aparattan çıkarın.</li>
	<li>Fareyi termal destek ile bir kurtarma kafesine yerleştirin. Uyanık, hareketli ve tımarlı göründüğünde iyileşmesine ve ev kafesine aktarılmasına izin verin.</li>
</ol>9. Ameliyat sonrası bakım
<ol><li>Hayvanları ameliyat sonrası 3 gün boyunca davranış, duruş, aktivite ve tımar için günlük olarak izleyin ve yiyecek alımı ve vücut ağırlığı kayıtlarını tutun.</li>
	<li>Hayvanlar ağrı veya kötü sağlıkla ilgili herhangi bir genel gösterge sergilerse, veteriner hizmetlerine danışın.</li>
	<li>Davranışsal çalışmalara başlamadan önce farelere iyileşme ve viral ifade için en az 2 hafta izin verin.</li>
</ol>10. Optogenetik
<ol><li>Optogenetik çalışmaların performansı için Sidor ve ark.8.</li>
	<li>Çalışmaların tamamlanmasında viral ekspresy anlatım ve lif yerleşimini doğrulayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise,+fall,+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight.">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+Neuroscientists.">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li><li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices.">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).</li><li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing,+packaging,+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection.">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).</li><li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors.">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).</li><li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food,+Water,+and+Salt.">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li><li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system.">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).</li><li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects.">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+foundations+of+optogenetics:+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity.">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li><li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain.">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li><li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice.">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).</li><li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+topic+in+optogenetics:+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating.">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nörobilimdeki son gelişmeler, beyin nörositlerinin aktivitesi ve işlevi hakkında ileri içgörü ve anlayışı desteklemiştir. Bu, ayrık nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyon alanlarını in vivo etkinleştirmek veya susturmak için optogenetik ve kemogenetik teknolojilerin uygulanmasını içerir. Daha yakın zamanlarda, bu, serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış bir hücre tipinde nöronal aktivitenin in vivo kaydı için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (örneğin, GCaMP, RCaMP) ve diğer florometrik biyosensörlerin (örneğin, dopamin, norepinefrin) geliştirilmesini içermektedir. Bununla birlikte, bu teknolojilerin etkin istihdamı, ilgi çekici bölgeyi hedeflemek için başarılı stereotaktik cerrahiye dayanmaktadır. Birçok beyin bölgesini hedeflemek için uygun olan bu yöntemleri açıklayan birkaç yerleşik protokol olsa da, orta hat boyunca derin beyin bölgelerini hedeflemek önemli ek zorlukları temsil eder. Burada, açılı stereotaktik bir yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için ayrıntılı bir cerrahi teknik gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu teknik çeşitli nörobilim tekniklerine (örneğin optogenetik, kemogenetik ve fiber fotometri yaklaşımları) uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Bu yaklaşımı kullanarak, nöronal nitrik oksit sintazını (VMNNOS1 nöronları) ifade eden VMN nöronlarının akut optogenetik susturulmasının farelerde insülin kaynaklı hipoglisemiye glukagon yanıtlarını körelttiği gösterilmiştir9. Biraz değiştirilmiş bir yaklaşım kullanılarak, VMN NOS1 nöronlarının1) tek taraflı aktivasyonunun, normalde hipoglisemiye yanıt için ayrılmış karşıt yanıtlar tarafından yönlendirilen sağlam hiperglisemiyi ortaya çıkardığı ve 2) savunma hareketsizliği davranışını ortaya çıkardığı gösterilmiştir. Ayrıca, bu davranışsal ve metabolik yanıtlar farklı beyin bölgelerine nöronal projeksiyonları içerir. Özellikle, stria terminalilerin ön yatak çekirdeğine yansıtan VMNNOS1 nöronlarının aktivasyonu glisemik yanıtlarda yer larken, periaqueductal griye yansıtan VMNNOS1 nöronları korku kaynaklı davranış yanıtlarına bağlıdır9.
Protokolün Kopf Model 1900 stereotaks ve beraberindeki aksesuarlara son derece özel olduğu belirtilmelidir. Bu sistem, beyin bölgelerini ayırmak için hassas, tekrarlanabilir implantasyonun yanı sıra mikroenjeksiyon sağlarken (birden fazla araç arasında ortak bir merkez çizgisi konumu ile), strateji ve yaklaşım diğer stereotaksik çerçevelere uyacak şekilde uyarlanabilir. Özellikle, açılı mikroenjeksiyonlar ve implantasyonlar yapmak için başı döndürmek yerine, alternatif bir yaklaşım aynı ilkeleri kullanmak ve bunun yerine dorsal-ventral manipülatörü döndürmektir (bkz. Correia vd.12).
Her yeni yöntemde olduğu gibi, bireylerin bir deneyin güvenilirliğini, tutarlılığını ve doğruluğunu geliştirmek için tekniği optimize etmesi kritik öneme sahiptir. Ek olarak, verilerin uygun analizi ve yorumlanması için gerekli uygun kontrollerin dahil edilmesi önemlidir. Bunlar arasında Cre-negatif çöp arkadaşı kontrollerinin kullanımı, viral muhabir kontrolleri (yani AAV-GFP), elektrofizyoloji kullanılarak ışığa bağımlı nöronal ateşleme modülasyonunun doğrulanması ve (çalışma tamamlandığında) ilgi çekici bölgede viral hedefleme ve fiberoptik yerleşimin doğrulanması sayar. Teknik hususların ve önerilen kontrollerin ayrıntılı bir incelemesi için Cardozo ve Lammel13 tarafından yayına başvurmanız önerilir.
Özetle, daha gelişmiş ve hassas sinirbilim tekniklerinin tanıtılması, beynin davranış, biliş ve fizyolojideki rolünün önemli bir ilerlemesini ve anlaşılmasını desteklemiştir ve bu gelişmeler CNS ile ilgili bozukluklar için potansiyel tedavilere yol açabilir.

Davranış, beslenme ve metabolizmanın sinirsel kontrolü, son derece karmaşık, bütünleştirici ve gereksiz nörosürücülerin koordinasyonunu içerir. Nörobilim alanının itici bir amacı, nöronal devre yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi parçalamaktır. Klasik sinirbilim araçları (yani lezyonlama, lokal farmakolojik enjeksiyonlar ve elektriksel stimülasyon) davranışı ve metabolizmayı kontrol eden belirli beyin bölgelerinin rolü hakkında hayati bilgileri ortaya çıkarmış olsa da, bu araçlar özgüllük ve geri döndürülebilirlik eksikliği ile sınırlıdır1.
Nörobilim alanındaki son gelişmeler, devre fonksiyonunu yüksek mekansal çözünürlükle hücre tipi spesifik bir şekilde sorgulama ve manipüle etme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Örneğin optogenetik2 ve kemogenetik3 yaklaşımları, serbestçe hareket eden hayvanların genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde aktivitenin hızlı ve geri dönüşümlü manipülasyonuna izin verir. Optogenetik, nöronal aktiviteyi kontrol etmek için channelrhodopsins olarak adlandırılan ışığa duyarlı iyon kanallarının kullanımını içerir. Bu tekniğin anahtarı, channelrhodopsin'in gen iletimi ve opsin'i aktive etmek için bir ışık kaynağıdır. Gen iletimi için ortak bir strateji, 1) ayrı nöronlarda Cre-rekombinaz ifade eden genetik olarak tasarlanmış fareler ve 2) Channelrhodopsin kodlaması için cre-dependent viral vektörler kombinasyonudur.
Optogenetik nöronal aktiviteyi kontrol etmek için zarif, son derece hassas bir araç sağlarken, yöntem viral vektörün başarılı stereotaktik mikroenjeksiyonuna ve tanımlanmış bir beyin bölgesine fiberoptik yerleştirmeye dayatılır. Stereotaktik prosedürler modern sinirbilim laboratuvarında yaygın olmasına rağmen (ve bu prosedürü tanımlayan birkaç mükemmel protokol vardır)4,5,6, orta hat boyunca ayrı beyin bölgelerini tutarlı ve tekrar tekrar hedefleyebilmek (yani, homeostatik fonksiyonların düzenlenmesi için kritik bir beyin alanı olan mediobaz hipotalamus) ek zorluklar sunar. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüsten, üçüncü ventrikülden ve bitişik hipotalamik çekirdeklerden kaçınmak yer almaktadır. Ek olarak, inhibisyon çalışmaları için gerekli olan donanımın bilateral implantasyonunda önemli mekansal sınırlamalar vardır. Bu zorlukları göz önünde bulundurarak, bu protokol burada açılı bir stereotaktik yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için değiştirilebilir bir prosedür sunar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fiberoptic Cannulae</td>
			<td>Doric Lenses</td>
			<td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td>
			<td>Customizable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1900-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1905 Alignment Indicator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1915 Centering Scope</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kopf Model 1940 Micro Manipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>Model 1940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse bone screws</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>00-96 X 1/16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>XCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>Ideal Micro Drill</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptable angled stereotactic approach for versatile neuroscience techniques

Stereotaktik cerrahi, modern sinirbilim laboratuvarında önemli bir araçtır. Bununla birlikte, ulaşılması zor beyin bölgelerini tam ve doğru bir şekilde hedefleme yeteneği, özellikle orta hat boyunca beyin yapılarını hedeflerken hala bir zorluk teşkil etmektedir. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüs ve üçüncü ventrikülden kaçınmak ve seçici ve ayrık beyin çekirdeklerini sürekli olarak hedefleme yeteneği yer almaktadır. Ek olarak, daha gelişmiş sinirbilim teknikleri (örneğin, optogenetik, lifli fotometri ve iki foton görüntüleme) beyne önemli donanımların hedefli implantasyonuna dayanır ve mekansal sınırlamalar yaygın bir engeldir. Burada, açılı bir koronal yaklaşım kullanılarak kemirgen beyin yapılarının stereotaktik olarak hedeflimi için değiştirilebilir bir protokol sunulmaktadır. 1) fare veya sıçan modellerine, 2) çeşitli sinirbilim tekniklerine ve 3) birden fazla beyin bölgesine uyarlanabilir. Temsili bir örnek olarak, bir optogenetik inhibisyon deneyi için fare hipotalamik ventromedial çekirdeğinin (VMN) hedeflanması için stereotaktik koordinatların hesaplanmasını içerir. Bu prosedür, adeno ilişkili bir virüsün (AAV) ışığa duyarlı bir klorür kanalını (SwiChR++) Cre'ye bağımlı bir fare modeline kodlaması ve ardından fiberoptik kanonun açılı bilateral implantasyonu ile başlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bulgular insülin kaynaklı hipoglisemiye karşı sağlam glikoz karşı-gülatör yanıtları için VMN nöronlarının bir alt kümesinin aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu protokol, hipotalamik VMN nöronlarının glisemik kontrol9'dakirolünü sorgulamak için optogenetik çalışmaları yapmak için cerrahi bir prosedürü açıklar. İlk olarak VMN'ye inhibitör bir channelrhodopsin virüsünün bilateral mikroenjeksiyon için standart (açılı olmayan) stereotaktik bir yaklaşım kullanılmıştır. Açılı bir yaklaşım da uygun olsa da, ilgi çekici beyin bölgesini hedeflemek yeterli olduğu ve kolay, güvenilir ve tutarlı bir yaklaşım olduğu için standart (açılı olmayan) yaklaşım seçilmiştir. Bununla birlikte, VMN'nin orta çizgiye yakınlığı göz önüne alındığında, uzay kısıtlamaları bilateral fiberoptiklerin açılı olmayan implantasyonuna izin vermemiş ve fiberoptiklerin bir açıyla hassas bir şekilde implante edilmesi için cerrahi bir strateji geliştirilmesinigerektirmiştir (Şekil 6).
Bu cerrahi stratejiyi kullanarak, "SwiChR++" virüs10olarak adlandırılan floresan muhabirle kaynaşmış modifiye bir channelrhodopsin anion-iletken kanalını ifade eden Cre'ye bağımlı bir AAV'yi mikroenjaktize ettik , nos1-cre farelerinin VMN'sine iki taraflı olarak. Bunu, her enjeksiyon bölgesine orta çizgiden 15° açıyla optik fiber dorsolateral implantasyonu izledi. Beklendiği gibi, viral ekspresyon VMN ile sınırlıydı ve diğer beyin bölgelerinde tespit edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig01.jpg"> Şekil 1: Hipotalamik ventromedial çekirdeği hedefleyen açılı koordinatların hesaplanması için temsili örnek. Açılar ve çizgi parçaları ölçeklemek için çizilmez. (A) Bu uzunluk temel trigonometri kullanılarak hesaplanmalıdır. Bu örnekte, A = 2,03 mm. (B) Rasgele döndürme ekseninin atanmasına dayalı tahmini uzunluk. Bu örnekte, B = 7.576 mm. (C) Hesaplanan hipotenoz. Fiberoptik/iğne yerleştirme derinliğinin optimizasyon gerektiren hedef bölgeye istenilen yakınlığa bağlı olduğu unutulmamalıdır. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig02.jpg"> Şekil 2: Stereotaktik kafa tutucu aparatı için ayar düğmeleri. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig03.jpg"> Şekil 3: Baş tutucunun dönme merkezini hizalama. (A) Kulak çubuklarının yerleştirilmesi. (B) 0° seviye koronal dönüş sırasında (solda), dikey kaymayı ayarlamadan önce 15° dönüş sırasında ve dönüş merkezi yanlış hizalanır (ortada) ve dikey kaymayı ayarladıktan sonra 15° döndürme sırasında ve dönüş merkezi düzgün bir şekilde hizalanır (sağda). Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig04.jpg"> Şekil 4: Bregma atama ve hayvan başını merkezi dönme eksenleriyle hizalama. (A) Tipik bregma yerleşimini gösteren temsili resim. (B) Hizalamadan önce, kafa düzken bir referans işareti çizme. (C) Dikey kaymayı ayarladıktan ve bregma'yı yeniden ayarladıktan sonra düzgün hizalanmış dönme ekseni. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig05.jpg"> Şekil 5: Fiberoptik implantasyon prosedürü. (A) Mikroenjeksiyon (m), fiberoptik (f) ve çapa vidaları (*) için pilot deliklerin ortalama kapsamı görünümü. (B) yerleştirilen çapa vidalarının ve kemik balmumu kaplı mikroenjeksiyon matkap deliklerinin ortalama kapsamı görünümü. (C) Açılı implantasyon sırasında fiberoptiğin yerine yerleştirilmesi. (D) Temsili bilateral açılı fiberoptik yerleştirme. Noktalı siyah oklar, fiberoptiği ankraj vidalarına ve ipsilateral fiberoptiklere tutturmak için süper tutkalın kullanıldığı alanları gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60965/60965fig06.jpg"> Şekil 6: Ventromedial hipotalamusun bilateral hedeflemesi için temsili sonuçlar. (A) VMN'yi hedeflemek için bilateral mikroenjeksiyon ve açılı fiberoptik stratejiyi temsil eden şematik. (B) SwiChR-GFP'nin bilateral ekspresyonını ve açılı fiberoptik sistemlerden doku hasarını gösteren temsili görüntü. 3V = üçüncü ventrikül, ARC = arcuate çekirdeği ve VMN = ventromedial çekirdek. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/60965/60965fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques at JoVE.com

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.9K Görüntüleme.  University of Washington. Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Video: Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

A Novel Approach for Documenting Phosphenes Induced by Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical stimulation of the occipital cortex, but also by non-invasive Transcranial Magnetic Stimulation (TMS)1 of the same cortical regions. The intensity at which a phosphene is induced (phosphene threshold) is a well established measure of visual cortical excitability and is used to study cortico-cortical interactions, functional organization 2, susceptibility to pathology 3,4 and visual processing 5-7. Phosphenes are typically defined by three characteristics: they are observed in the visual hemifield contralateral to stimulation; they are induced when the subject s eyes are open or closed, and their spatial location changes with the direction of gaze 2. Various methods have been used to document phosphenes, but a standardized methodology is lacking. We demonstrate a reliable procedure to obtain phosphene threshold values and introduce a novel system for the documentation and analysis of phosphenes. We developed the Laser Tracking and Painting system (LTaP), a low cost, easily built and operated system that records the location and size of perceived phosphenes in real-time. The LTaP system provides a stable and customizable environment for quantification and analysis of phosphenes.

Phosphenes are transient percepts of light that can be induced by applying Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to visually sensitive regions of cortex. We demonstrate a standard protocol for determining the phosphene threshold value and introduce a novel method for quantifying and analyzing perceived phosphenes.

Transkraniyal Manyetik Uyarım İndüklenmiş Phosphenes Belgelenmesi için Yeni Bir Yaklaşım

Stimulation of the human visual cortex produces a transient perception of light, known as a phosphene. Phosphenes are induced by invasive electrical ...

Nörobilim

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part because fMRI data acquisition and analysis techniques are readily available. Because fMRI has excellent spatial resolution but poor temporal resolution, this method can only be used to identify the spatial location of brain activity associated with a given cognitive process (and reveals virtually nothing about the time course of brain activity). By contrast, event-related potential (ERP) recording, a method that is used much less frequently than fMRI, has excellent temporal resolution and thus can track rapid temporal modulations in neural activity. Unfortunately, ERPs are under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and low density ERP recording has poor spatial resolution. In an effort to foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition. Critically, high density ERPs offer the promise of excellent temporal resolution and good spatial resolution (or excellent spatial resolution if coupled with fMRI), which is necessary to capture the spatial-temporal dynamics of human brain function.

Event-related potential (ERP) recording is under utilized in Cognitive Neuroscience because data acquisition techniques are not readily available and this method often has poor spatial resolution. To foster the increased use of ERPs in Cognitive Neuroscience, the present article details key techniques involved in high density ERP data acquisition.

Yüksek Yoğunluklu Olay ilgili Kognitif Nörobilim Potansiyel Veri Toplama

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Behavioral Neuroscience Kemirgen Stereotaksik Cerrahi ve Hayvan Refahı Sonuç İyileştirmeler

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, Okülomotor Analizi Yenilikçi Otomatik Yaklaşım

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Multi-bilişsel işlevler Test ve Kemirgenler Nöronal Etkinlikler kayıt için Tam Otomatik ve Çok Yönlü Sistemi

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Saldırganlık incelenmesi için Handling ortadan kaldırır Yeni Bir Yaklaşım ve &quot;Loser&quot; Etkisi içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Endoskopik Endonasal Trans-sfenoidal yaklaşım: Hipofiz adenomları için minimal invaziv cerrahi

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün nörite fonksiyonel ve Neuropathological değerlendirmeler için ikna etmek için basit bir yaklaşım

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...