Tüm genom dizilemesi, genom madenciliği ve moleküler ağ, burada tanımladığımız genom madenciliği protokolünün kütle spektrometresi kılavuzunun temelini oluşturur. Ve doğal ürün keşfinde en çağdaş yaklaşımdır. Genom madenciliği ve moleküler ağ kümede eşleşir, tüm genom dizilimindeki kodlanmış ek açıklamalar ile ham maddelerden gelen kimyasal yeniden yapılanma imzaları aktif moleküller tarafından göbek ortaya çıkarmak için büyük umutlar sağlar.
Prensip olarak, genom madenciliği deney başına tek veya küçük bir molekül grubunu hedefler. Bu da yavaş bir keşif hızı ile sonuçlanır. Bu anlamda genom madenciliğinin moleküler ağ la birlikte kullanılması doğal ürün araştırmaları için önemli bir ilerlemeyi temsil eder.
Kütle spektrometresi kılavuz-genom madenciliği aynı anda bir ham ekstre den büyük miktarda veri bulunan çeşitli kemotiplerin bilgi yapısı çok yönlü bir yöntemdir. Bugün bakteri, mantar veya bitki dizisi sağlayan keşfetmek için yeteneğine sahip yüksek menzilli metodolojisi vardır. Kemotip, genotip ve genotip, kemotip biyoinformatik biyosentetik kümeler arasındaki bağlar ve küçük moleküller iner.
Protokolün dinlanması, streptomices türlerinin metabolik ekstrelerinde gözlenen peptid ürünlerinin göbek döngüsü derinliklerini karakterize etmek için gösterilmiştir. Ama mantar ve bitkiler dizisi ve özleri için de geçerlidir. Genom veri setinin güzel cereyan etmesi çok önemlidir ve günümüzde parçalanmış taslak dizileri giderek bitmiş dizi verilerinin yerini almıştır.
Ayrıca, farklı stratejiler yeni biyoaktif doğal ürünlererişmek ve kesinlikle MS-Guide yaklaşımı ile birleştirerek geliştirilmiştir. Doğal ürünlerin izolasyonve yapı yalıtımında iyileşmeye yol açacağız. Burada genotipi kemotip yaklaşımına bağladığımız için biyoinformatik kümeler ile küçük moleküllü ürünler arasındaki bağlantılar çok önemlidir.
bileşiklerin çeşitliliğini ve sınıfını tahmin etmek ve genomtarafından kodlamak. Bu da çoğaltma anlamına geliyor. Daha sonra, iyon benzerlikleri dayalı kümeleme GNPS kullanılarak önceden oluşturulabilir.
Prosedürü gösteren Dr Renata Sigrist ve Profesör Angolini bu çalışmada benim işbirlikçileri olacaktır. Sekonder metabolizma gen kümeleri ek açıklamaları hakkında silico bilgi elde etmek için tam bir dizi genom. Dizi dosyasını, gen bankası E-M-B-L veya daha hızlı bir biçimde, bir anti-smash platformuna gönderin.
Yani en benzer bilinen kümeye dayanan çıktı verilerinden gelen gen kümeleri gibi. BGC'nin DNA diziliyeti bilgilerine dayanarak, ecoli streptomices için gen kümesini çevreleyen 20 ila 25 nükleotit arasında tasarım ön seçimleri. Yapay kromozom kitaplığı taraması.
El yazmasına göre rekombinant heterolog organizma elde ettikten sonra, uygun fermantasyon ortamlarında suşların 100'de birini aşıla. Sıvı ISS2 ortamı gibi. Kültürü 7 gün boyunca 30 santigrat derece ve 220 RPM'de bir kuvöze yerleştirin.
Aşılamadan sonra kültürleri 2200 kez G'de 10 dakika santrifüj edin. Hücreleri atın ve bir ayırıcı huni içine supernatant aktarın. Etil asetat bir hacim ekleyin ve sallayın.
Organik ve kabul edilmiş katmanların ayrılması için 1-3 dakika bekleyin. Ve organik katmanı bir Erlenmeyer şişesinde topla. MS/MS verilerini elde etmek için.
Program uygun HPLC ve kütle spektrometresi yöntemleri kontrol yazılımı kullanarak. BU MS / MS ağ verilen kütle Spektrometrik koşullar altında tespit moleküler ağ olduğu unutulmamalıdır. Protea sihirbazından MS Convert'i kullanarak kütle spektrumlarını mzXML biçimine dönüştürün.
Dönüştürme için giriş parametrelerini ayarlayın. Dönüştürülmüş LC-MS/MS dosyalarını GNPS veritabanına yükleyin. İki seçenek mevcuttur.
Dosya aktarım protokolünü kullanarak veya doğrudan çevrimiçi platform üzerinden bir tarayıcıda. GNPS'de bir hesap oluşturduktan sonra oluşturulan hesaba giriş yapın ve moleküler ağ oluşturmayı seçin. Bir iş unvanı ekleyin.
Temel seçenekleri gerçekleştirmek için. Moleküler ağı gerçekleştirmek için mzXML dosyalarını seçin. Altı gruba kadar düzenleyin.
Çoğaltma rutini için kütüphaneler gibi. Sırasıyla 0,02 Dalton ve 0,05 Dalton kütle toleransı öncül iyon kütle toleransı ve parça Da seçin. Gelişmiş ağ seçenekleri gerçekleştirmek için, ağ kümesi boyutunu ve biçimini doğrudan etkileyen parametreleri seçin.
Gelişmiş parametreler GNPS belgelerinde bulunmaktadır. İş bittiğinde bir uyarı almak için bir e-posta adresi seçin ve işi gönderin. GNPS sonuçlarını analiz etmek için.
GNPS'ye giriş yapın. İş açmak için yapılan işleri, yayınlanmış işi seçin. Moleküler ağdan elde edilen tüm sonuçlar görüntülenirken bir web sayfası açılır.
Tüm ağ kümelerini görmek için tarayıcı ağı görselleştiricisinde spektral aileleri görüntüleyin. Bir liste, oluşturulan tüm moleküler ağ kümeleriyle birlikte görüntülenir. Geçici moleküler tanımlama tüm kimliklerde görüntülenir.
Bunları görselleştirmek için göster'i seçin. Moleküler ağ kümesini analiz etmek için, ağı görselleştir'i seçin. Düğüm etiketleri kutusunda, üst kitleyi seçin.
Kenar etiketleri kutusunda, ortak imza veya Delta Emz'i seçin. Düğüm benzerliğini veya düğümler arasındaki kütle farklarını gözlemlemek için. Çok gruplu çözümleme durumunda, düğüm boyama kutusunda pasta çiz'i tıklatın.
Her düğümün her grupta görünme sıklığını gözlemlemek için. Tüm kitaplıkları görmek için görünümü, tüm kitaplığı, isabetleri seçin. Parçalanma spektrumunu doğrudan GNPS platformunda açın.
Veya orijinal ham dosyaları el ile dereplication bileşikleri ve ilgili bileşiklerin yapı açıklaması onaylamak için. Protokol, genom madenciliği, heterolog ifade ve MS güdümlü kod yaklaşımlarının bir kombinasyonu kullanılarak başarıyla örneklendi. Yeni özel Valinomisin ve analog moleküllere erişmek için.
Hedef valinomisin için genomdan moleküle iş akışı burada sunulmuştur. Kromatogram, heterolog konakta biyosentetik gen kümeleri ekspresyonu olan valinomisin, montanastatin ve beş analogun valinomisin, biyosentetik gen kümeleri ekspresyonu tarafından üretildiğini gösterdi. Moleküler ağ iyonları valinomisin karşılık gelen, ilgili biyosentetik gen kümeleri ile zaten bilinen bir bileşik streptomyces türler, CBM AI iki sıfır dört iki genom açıklamalı.
Analoglarla ilgili iyonlarla kümelenirler, ilk olarak valinomisin biyosentetik gen kümesi için tanımlanır. Ms spektrumları ve valinomisin ve ilgili analoglar için kimyasal yapılar burada gösterilmiştir. Tüm genom dizilimi ve uygun veri seti küratörlüğünü gerçekleştirmek, MS-kılavuzu genom madenciliği için bir biyosentetik küme seçmenin ilk adımıdır.
Tüm yordam vahşi türleri dize ham ekstresi ile yapılabilir, ancak ilgi gen kümesi ni seçmek ve heterolog ifade teşvik seçebilirsiniz. Tüm biyosentetik gen kümesini bir DNA örneğinden yakalamak için farklı yöntemler tanımlanmıştır. Bu protokolün en güçlü avantajı, metabolik profilleri hızla çoğaltma ve genomik bilgiyi MS verileriyle üretme yeteneğidir.
Yeni moleküller gibi bu tür açıklamak için. Ve kitle kılavuz-genom madenciliği ilk olarak Doris Chime ve meslektaşları tarafından peptit genomik ve glikogenomik alanında tanımlanmıştır. NPS entegre metabolomik ve genom madenciliği yaklaşımının piyasaya sürülmesinden sonra moleküler ağları biyosentetik yeteneklerle buluşturmak için en çok yönlü yol haline gelmiştir.
