Tümör organoidleri yaygın tümör biyolojisi çalışmak için bir in vitro kanser modeli olarak kullanılmaktadır. Protokolümüz, kanser biyolojisinde çeşitli yönlerini incelemek için kritik bir araç olarak hizmet veren mesane tümörü organoidlerini izole etmek, kültürü ve genetik olarak manipüle etmek için ayrıntılı bir prosedür sağlamaktadır. Protokolümüzü kullanarak, mesane tümörü organoidlerini genetik olarak manipüle edip ilgi alanımızın genini ifade edebiliriz ya da yok edebiliriz.
Ayrıca, ortotopik transplantasyon yöntemimiz ile sağlam bir tümör mikroçevre tümör organoidleri oluşturabiliriz. Prosedürü gösteren Yubin Kim, bizim laboratuvardan bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Murine mesane tümöründen mesane tümörü organoidleri oluşturarak başlayın.
Tümör parçalarına DMEM'de bir mililitre 10 milimolar HEPES ekleyin ve sterilize jiletle dokuyu doğuzlayın. Hücre süspansiyon içine parçaları ayrıştırmak için, HEPES ile DMEM dokuz mililitre ekleyin, kollajenaz tip bir ve iki, ve tümör parçaları için termolizin, ve 37 santigrat derece ve orbital shaker üzerinde% 5 karbondioksit 1,5 ila iki saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Tüpü 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. ACK lysing tampon beş mililitre pelet resuspend ve herhangi bir kırmızı kan hücreleri lyse için oda sıcaklığında tüp kuluçka 3-5 dakika. Bu arada, 150 mikrolitre buz gibi büyüme faktörüile 24 kuyuluk bir kuyuyu katlayın ve plakayı 30 dakika boyunca bir kuluçka makinesine yerleştirin.
Hücrelerle birlikte tüpe 20 mililitre DMEM ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın. Süpernatant aspire ve bir mililitre pelet resuspend 0.25% tripsin EDTA ve 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür. Tüpü 37 derecelik bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra %10 FBS ile 10 mililitre DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin. Sindirilmemiş enkaz kaldırmak için yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerinde 100 mikrometre hücre süzgeci ile hücre süspansiyon filtre. Tüpü 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.
Sonra dmem bir mililitre ile pelet resuspend ve bir hemositometre ile hücreleri saymak. Dört tümör hücresine 3-4 kez 10 tane buz üzerinde 1,5 mililitrelik mikrotüp aktarın ve 400 kez g dört santigrat derece üç dakika santrifüj. Dikkatle supernatant kaldırmak ve önceden ısıtılmış organoid orta ve 10 mikromolar Y-27632 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.
Hücre süspansiyonuna daha önce hazırlanmış membran matrisine iyi kaplanmış şekilde aktarın ve 24 kuyuluk plakayı tekrar kuvöze yerleştirin. Orta yı her iki günde bir 500 mikrolitre önceden ısıtılmış organoid ortamla değiştirin. Lentivirus aracılı transdüksiyondan 12 saat önce tümör organoidlerini ayırın.
Ertesi gün, hızlı bir şekilde 37 derece Santigrat su banyosunda aliquot içeren bir virüs eritmek. 10 mikromolar Y-27632 ve hexadimethrine bromür mililitre başına sekiz mikrogram ile organoid orta 250 mikrolitre çözülmüş virüs ekleyin. 24 kuyulu plakadaki organoid ortamı orta içeren virüsün 500 mikrolitresiyle değiştirin ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 12 ila 16 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
Ortotopik transplantasyon için mesane tümörü organoidleri hazırlamak için, 24-iyi plaka organoid orta kollajenaz dispase 500 mikrolitre ekleyin. Pipet bodrum membran matris ve orta yukarı ve aşağı sonra 37 santigrat derece 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.
Sonra 400 kez g dört santigrat derece üç dakika için tüp santrifüj ve supernatant aspire. Bir mililitre DMEM ile peleti yeniden askıya alın ve çözeltiyi 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Bir mikroskop altında, p200 pipet ile 10 ila 100 tümör organoidler almak ve buz üzerinde bir mikrotüp içine toplamak.
Mikrotüpü santrifüj edin ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Sonra fareler ameliyat için hazır olana kadar buz üzerinde pelet korumak. Submukozal mesane duvarı naklinden önce, şırıngaları, pipet uçlarını ve bazal membran matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
Fare anestezi edildikten sonra, bir supine pozisyonda yatıyordu ve% 2 buharlaşmış izofluran maske teneffüs ile anestezi korumak. Steril bir gazlı bez ile povidon iyot uygulayın ve% 70 etanol ile aşağı silin. Steril cerrahi makas ile alt orta batık karın deri ve kas duvarında küçük bir enine kesi yapın.
Karın boşluğundan mesane maruz ve tuzlu bir tuzlu pamuklu bez ile destek. %50 yüksek konsantrasyonlu bazal membran matriks içeren 80 mikrolitre organoid ortamda organoid peletleri yeniden askıya alın ve insülin şırınga kullanarak mesane kubbesinin ön yönüne süspansiyon enjekte edin. Kesiyi 4-0 naylon dikişle kapatın ve cerrahi bölgeyi povison iyot ve %70 etanol ile dezenfekte edin.
Farenin kızılötesi ışınlayıcı altında 10 ila 15 dakika boyunca kurtarmasına izin verin. Sonra bilinci yeniden kazanana kadar fareyi tekrar izleyin. Fare mesane tümörü organoidleri kuruldu ve dokuz gün boyunca kültürlendi.
Tümör hücreleri tümör organoidleri oluşturmuyorsa, dissosyasyon adımı sırasında potansiyel olarak öldürülürler ve enzimatik sindirim süresinin ayarlanması gerekebilir. Mesane tümörü organoidleri başarılı lentiviral enfeksiyon ile güçlü GFP sinyalleri sergiledi. Konsantrasyondan sonra, toplam 250 mikrolitre media içeren virüs, bazal membran matrisindeki 30.000 tek tümör hücresini enfekte etmeye ve %90 ila %100 enfeksiyon verimliliğini korumaya yetti.
Mesane tümörü allografları ortotopik transplantasyondan üç hafta sonra alındı ve h&E boyama ile tümör histolojisi incelendi. Tümör organoidlerinin ortotopik nakli 2-3 hafta boyunca mesane tümörü olarak büyüyebilir. Bu prosedürü takiben, araştırmacılar ortaya çıkan tümör organoidlerinin immünohistokimyasını yapabilir veya ilgi çeken genler için kantitatif RT-PCR gerçekleştirebilirler.
Bu deneyler tümör organoidlerini daha da karakterize edebilir. Protokolümüz, mesane kanseri tümörigenezde yer alan çeşitli genlerin spesifik fonksiyonlarını incelemek için tümörlerin in vivo özelliklerini korurken, fare modeline göre kanser hücrelerindeki genleri kolayca manipüle etmemizi sağlar.
