Bu prosedürün genel amacı, su çözünürlüğü veya hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özelliklere sahip fotokafesli bileşiklerin hazırlanması için pratik bir yöntem sağlamaktır. Basit bir sentetik prosedür kullanarak, bu teknik kafesli bileşikler üzerinde laboratuvar genişletmek ve onların Fotosensititi ödün vermeden ek özelliklere sahip kafesli bileşikler yapmak için kullanılabilir. Tıklanabilir kafesli bileşiklerimiz diklorometan veya dimetil sülfoksit gibi nükleofil olmayan organik çözücülerde çözündüğünde foto-ışınlamaya karşı kararlı olduğundan bu sentez standart bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir.
Hirona Sasaki ile prosedürü gösteren Akinobu Suzuki, bir post-doc, Hanami Aoki ve Rei Watahiki, laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri olacaktır. 30 mililitrelik yuvarlak dipli bir şişeye 709,6 miligram paBhc metanol ve 397,6 miligram n-karbonildiimidazol ekleyerek başlayın. Şişeye kuru altı mililitre diklorometan ekleyin ve çözeltiyi ortam sıcaklığında bir saat karıştırın.
Kuluçka sonunda, 4-Dimethylaminopyridine 342.8 miligram ve tert-butyl altı-amino heksil karbamate 552 mikrolitre ekleyin ve ek bir üç saat için ortam sıcaklığında çözelti karıştırın. Daha sonra çözücü ve diğer uçucu maddeleri çıkarmak için vakum altında bir döner evaporatör kullanın ve doğrudan kalıntı arındırmak için silika jel flaş sütun kromatografisi kullanın. Tıklanabilir kafes bileşkesine fonksiyonel bir ünite yerleştirmek için, 0,1 molar bakır sülfat çözeltisi vermek için 10 mililitre iyon-exchanged su bakır iki sülfat pentahidrat 249 miligram çözünür.
İki asal paBhc mock paklitaksel sekiz miligram çözün, tris 7.5 miligram (3-hidroksipropyltriazolylmethyl)amin, 162.4 miligram sodyum-l-askorbat ve 3.1 miligram 15-kloro-3, 6, 9-trioksipentyldecyl azit karışık bir çözücü içinde 2.5 mililitre 0.1 molar fosfat tampon ve dimetil sülfoksit 0.5 mililitre. Daha sonra reaksiyon karışımına 81,2 mikrolitre 0,1 molar bakır sülfat çözeltisi ekleyin ve karışımı 80 dakika ortam sıcaklığında karıştırın ve HPLC ile reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Reaksiyonsonunda, %75 asetil nitryl su çözeltisinin 3,5 mililitresi ile çökelticileri çözün ve elde edilen çözeltiyi istenilen ürünü arındırmak için doğrudan yarı preparative HPLC sistemine uygulayın.
Kuantum verimliliği ölçümleri için, UV ışık kesme filtresi ile kaplanmış floresan lambalar altında, 10 mililitre KMOPS tamponu ile 10 mikrolitre dimetil sülfoksit numune stok çözeltisini seyreltin. Çözeltinin bir aliquot'ünü kimyasal aktinometrenin fotoğraf reaksiyonunda kullanılan aynı test tüpüne aktarın. HPLC tarafından analiz edilmek üzere düzenli olarak ışınlanmış çözeltiden 50 mikrolitre aliquots kaldırarak, beş saniye boyunca 350 nanometre ışık ile örnek çözelti ışınlama.
Daha sonra, başlangıç malzemesinin %90'ının, başlangıç materyalinin zamana bağlı kayboluşunun çizimlerini takarak tepki verdiği ışınlama süresini saniyeler içinde belirleyin. HaloTag ligand tıklanabilir kafesli bileşik hedefleme için, uygun bir hücre bölünmesi reaktifi ile ilgi hedef hücre popülasyonu hasat ve dMEM konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere 2,5 kat 10 hücreleri yeniden askıya. Sonra 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir gecede kuluçka için 35 mililitre cam alt yemekleri içine çanak başına beşinci hücrelere yaklaşık 10 tohum.
Ertesi sabah, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 700 mikrolitre azaltılmış serum ortamı içeren bir pc DNA üç halo epidermal büyüme faktörü reseptör plazma DNA seyreltmek 14 mikrogram. Daha sonra, dört tüpün her birine 150 mikrolitre azaltılmış serum ortamına beş mikrolitre lipofection reaktifi ekleyin ve tüplerin ortam sıcaklığında beş dakika bekletin. Kuluçka sonunda, seyreltilmiş lipofection reaktif örneklerinin her birine 150 mikrolitre seyreltilmiş plazma DNA'sı ekleyin ve numuneleri beş dakika daha ortam sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, çanak başına pbs iki mililitre ile hücreleri durulayın ve her kültüre azaltılmış serum orta 1.5 mililitre ekleyin. Her çanağa 150 mikrolitre plazmid lipofection reaktif kompleksi ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, supernatants aspire ve her çanağa iki mikromolar paBhc hex fitzi halesi ile takviye taze hazırlanmış DMEM bir mililitre ekleyin.
37 santigrat derecede 30 dakika sonra, kafesli bileşiği içeren ortamı aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS artı ile iki kez durulayın ve herhangi bir bağlanmamış bileşikleri çıkarın. Her çanağa 500 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin ve hücrelere giren bileşikleri çıkarmak için hücreleri 30 dakika daha hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Kuluçka sonunda, hücreleri her çanak başına bir mililitre PBS artı ile iki kez durulayın ve her kültüre fenol kırmızısı olmadan bir mililitre orta ekleyin.
Daha sonra lazer tarama confocal florescence mikroskopi ile floresan görüntüleri kaydedin. Tıklanabilir kafesli bir bileşik kullanarak kizaz lokalizasyonufotoğraf aracılı modülasyonu için, tohum yaklaşık beş kez 10 ham F12 orta iki mililitre beşinci TOC-A-bir hücreleri için 35 mililitre cam alt çanak. Ertesi gün, sadece gösterildiği gibi 48 saat boyunca GFP diacylglycerol kigaz gama için plazmid kodlama ile hücreleri transfect.
Transfeksiyonun bitiminden sonra transfeksiyon supernatantını iki mililitre azaltılmış serum ortasıyla değiştirin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir beş ila 60 dakikalık kuluçka için hücrelere 100 kez paBhcAA çalışma çözümü 20 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, çift ışık kaynağı floresan aydınlatıcı ile donatılmış bir ters floresan mikroskop nesnel sahne üzerinde çanak yerleştirin.
Hücreleri 10 saniyede bir, hücreleri deneysel protokole göre uygun deneysel zaman noktalarında ve dalga uzunluklarında ışınlayarak 10 dakikada bir görüntüleyin. Gösterildiği gibi bu yöntem kullanılarak, paklitaksel ve araşidonik asit de dahil olmak üzere bazı biyolojik olarak ilginç moleküllerin tıklanabilir kafesli bileşikler, başarıyla sentezlenebilir. Su çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özellikler bakır bir katalize siklizasyon tıklama reaksiyonu ile paBhc mock paklisel içine tanıtılabilir.
Bu tıklanabilir kafesli paclitaxels sonra 350 nanometre ışınlama üzerine ana bileşikleri üretmek için fotoize edilebilir. Tıklanabilir kafesli bileşiklerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri tabloda özetlenmiştir. Canlı hücre deneylerinde, paBhc hex fitzi halo'nun kültürlü memeli hücrelerine hedefleştirilmesi geçici olarak HaloTagged proteinve epidermal büyüme faktörü reseptörünün hücre zarındaki floresan moiety PAHBHC hex fitzi halodan gelen yeşil floresan sinyaline neden olur.
Ayrıca, cho-K1 hücrelerinin tedavisi geçici araşidonik asit ile GFP diacyl gliserol kinaz gama ifade diacyl gliserol kinay gama subsellüler lokalizasyonu modülasyonu neden olur gedmislik gliserol kinazg gama. UV ışık maruziyetinden sonra paBhc-AA tedavi edilen hücrelerde de diacyl gliserol kiaz gama lokalizasyonunda benzer değişiklikler gözlenmektedir. Kültür ortamını artıran sulu çözeltilerde caging deneyleri yaparken, kısa dalga boyuna kapaklı filtreli floresan lamba altında her zaman çalıştığınızdan emin olun.
Bu prosedürü takiben, su çözünürlüğü, membran geçirgenliği veya hücresel hedefleme yeteneği eksikliği nedeniyle biyolojik deneylerde kullanılmak üzere bol olan kafesli bileşikler inceleyebilirsiniz.
