Bu makalenin amacı sonraki metabolome analizi için kültürlü kanser hücrelerinden sulu metabolitleri ayıklamak için ayrıntılı, adım adım görsel protokol sağlamaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı yapışık hücrelerden metabolitleri ayıklamak için sadeliği ve güvenilirliğidir. Ama her şeyden önce, kılcal elektroforez-kütle spektrometresi veya CEMS kullanarak metabolom analizi için iyi optimize edilmiş.
Metabolomik biyobelirteçleri belirlemek veya erken evre kanser tespit etmek ve kanser hastalarına kemoterapi yanıtı tahmin etmek için güçlü bir tekniktir. Bu gösteride kanser hücrelerini kullanıyoruz. Ancak, bu teknik aynı zamanda iPS hücrelerinde fibroblastlar gibi diğer yapışık hücrelerden metabolitleri hasat için uygulanabilir.
Metabolit konsantrasyonları canlı hücre sayısına göre normalleşir. Kültürün çok dikkatli hazırlanması, bu iyi tekrarlanabilir veri elde etmek için anahtardır. Prosedürü gösteren Ami Maruyama, laboratuvarımdan bir teknisyen olacak.
Başlamak için, plaka HCC827 ve PC-9 hücreleri 100 milimetrelik yemekler de RPMI-1640 orta 10% fetal sığır serumu ile takviye 10 mililitre içeren. Kültürlere 24 saat boyunca bulaşıkları %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede bir kuvöze yerleştirin. Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını aspire etmek için 100 milimetrelik kültür yemeklerini yavaşça yatırın.
Kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu tuzlu çözeltisi iki mililitre kullanarak her çanak hücreleri yıkayın. PBS çözeltisi tamamen çanak yüzeyini kaplar, sonra yıkama tampon aspire için bulaşıkları yatırın, böylece yavaşça her çanak kaya. Sıcak 0.25%tripsin-EDTA çözeltisi 37 santigrat derece.
Beş mililitrelik serolojik pipet ile, her çanağa ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisinin iki mililitresini ekleyin. Tripsin tamamen çanak yüzeyini kaplar, böylece yavaşça her çanak kaya. Kültür yemeklerini yaklaşık beş dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Sonra, her yemek için önceden ısıtılmış tam büyüme orta dört mililitre ekleyin. Ve yavaşça orta hücreleri yeniden askıya almak için birkaç kez pipet. Her hücre süspansiyonunu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Santrifüj 800 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve önceden ısıtılmış tam büyüme orta iki mililitre her hücre pelet yeniden askıya. 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte 10 mikrolitre lik hücre süspansiyonu ile %0,4 trippan mavisi çözeltinin 10 mikrolitresini karıştırın.
Kapiller eylem yoluyla bir hücre sayma odası slayt içine karışımın 10 mikrolitre yükleyin. Odayı otomatik hücre sayacına yerleştirin ve görüntüyü yakalamak için yakalama düğmesine basın ve hücrelerin toplam sayısı ve yüzde canlılığının sonuçlarını görüntüleyin. Toplam hücre sayısı mililitre başına 0,5 milyon hücrenin üzerinde ise, istenilen hücre konsantrasyonu elde etmek için 15 mililitrelik konik tüp daha fazla büyüme orta ekleyin.
Şimdi, her 100 milimetrelik hücre kültürü yemeğine 2 ila 5 mililitre kültür ekleyin ve her yemek başına yaklaşık 1 ila 2,5 milyon hücre yiyelim. Kültür yemeklerini 37 derecede %5 karbondioksitle 18 saat kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 15 mililitrelik hacimsel bir şişede, L-Metiyonin sülfone ve D-Camphor-10-sülfonik asit 1, ultrasaf suda 000 kat içeren ticari bir iç standart çözelti seyreltmek.
Ultra saf suda mililitre mannitol çözeltisi başına 0,05 gram yıkama tamponu olarak hazırlamak için ultra saf suda mannitol çözün. Daha sonra, her santrifüj filtre ünitesinin filtre kabına, pipet 250 mikrolitre ultra saf su. Filtre ünitelerini sıkıca kaplayın ve 9, 100 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Her filtrate hacmini kontrol edin. İlk kısa dönüş sırasında önemli bir filtrat birikmişse, filtre ünitesi arızalı olabilir. Filtre ünitesini atın ve bunun yerine yeni bir filtre birimi kullanın.
Filtre ünitelerinin kapaklarını sıkıca kapatın ve 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede 9, 100 kez g'de tekrar santrifüj edin. Filtre kaplarının hiçbirinde ultra saf su kalmadığından emin olun ve her toplama tüpündeki filtrelenmiş ultra saf suyu pipetle çıkarın. Filtre kaplarını toplama tüplerine geri yerleştirin ve kurutma nın ardından zarar görmesini önlemek için bir saat içinde santrifüj filtre ünitelerini kullanın.
100 milimetrelik kültür yemeklerini kuvözden alın ve her yemekten hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücre tabakasını rahatsız etmemeye özen terek, her çanağa 250 mikromolar diamid içeren veya olmayan 10 mililitre PBS kültür ortamı ekleyin. Kültür yemeklerini 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, her 100 milimetrelik kültür çanamı hücre kültürü ortamını aspire edin. Biraz çanak tilt ve yavaşça hücre tabakası rahatsız değil dikkat, hücreleri yıkamak için her yemeğin kenarına% 5 mannitol yıkama tampon iki mililitre ekleyin. Her kültür çanağı yıkama tampon aspirate ve biraz çanak yatırarak ve yavaşça çanak başına yıkama tampon 10 mililitre ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın.
Sonra, tamamen her kültür çanak kenarından yıkama tampon aspire. Şimdi, kültür çanak başına% 99.7 metanol 800 mikrolitre ekleyin ve yavaşça ileri geri her kültür çanak rock, tüm yüzeyini kapsayacak şekilde. Bulaşıkları oda sıcaklığında 30 saniye bekletin.
Pipetin ucunu metanolün içine batırarak ve birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak çanak başına seyreltilmiş iç standart çözeltinin 550 mikrolitresini yavaşça ekleyin. Yavaşça tüm yüzeyini kapsayacak şekilde ileri geri her kültür çanak rock ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca bulaşıkbırakın. Daha sonra, her kültür çanağı çıkarılan çözeltiyi ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
Tüpleri 2, 300 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Her süpernatantın 700 mikrolitresini birim başına 350 mikrolitre ile iki santrifüj filtre ünitesine aktarın. Filtre tüplerini filtre kaplarında sıvı kalmayana kadar yaklaşık iki saat boyunca 4 santigrat derecede 9, 100 kez g olarak santrifüj edin.
Filtre kaplarını çıkarın ve toplama tüplerinin kapaklarını sıkıca kapatın. Bu çalışmada, HCC827 ve PC-9 hücreleri eşit üç saat büyüdü. CEMS analizi, her iki hücre hattı için diamid ile tedavi edilen hücreler ile PBS ile tedavi edilen hücreler arasındaki farkı gösterir.
Bunlar arasında, pentoz fosfat yolu ve üst glikoliaz birkaç ara diyamid tedavi edilen koşullarda önemli ölçüde daha yüksek, birkaç trikarboksilik döngüsü ara tedavi koşullarında ise daha düşük tükenir. Hücre içi metabolitlerin metabolom profillerinde HCC827 ve PC-9 hücrelerinde sırasıyla 175 ve 150 diferansiyel metabolit saptandı. Diamid tedavisinden sonra, glukonik asit ve okside glikoz düzeyi HCC827 hücrelerinde 12 kat, PC-9 hücrelerinde 10 kat arttı.
Benzer şekilde, ilk heksosinaz katalize glikoliz ürününde fosfori glukoz 6-fosfat düzeyi de HCC827 ve PC-9 hücrelerinde sırasıyla 6.3 ve 3.5 kat artmıştır. Buna ek olarak, pentoz fosfat yolunun ilk ara orta seviyesi olan 6-fosfat kotonat düzeyleri HCC827 hücrelerinde 89 kat, PC-9 hücrelerinde ise 231 kat artmıştır. Buna karşılık, diyamid deneysel durumda fruktoz 6-fosfat gibi diğer glikolitik ara düzeyleri değişmedi.
Total nikotinamid adenin dinükleotid fosfat düzeyleri diyamid tedavisi ile PBS kontrol koşulları arasında neredeyse eşdeğerdi. Yıkama hücreleri için yıkama tamponu CEMS analizi için çok önemlidir, çünkü tuz bazlı tamponlar analizi bozar ve ölçümü olumsuz yönde etkiler. Bu protokol lipidler gibi hidrofobik metabolitleri ayıklamak için uygun değildir, bu yüzden daha kapsamlı metabolom analizi için hem hidrofilik hem de hidrofobik metabolitleri rahatlıkla çıkarmak için bir protokol geliştirmemiz gerekir.
Bu teknik hemen hemen her yapışık hücrelerden metabolitlerin kolay bir ekstraksiyon ufark eder, ve böylece, kanser gibi çeşitli araştırmalar için geçerlidir, kök hücreler, farmakoloji, beslenme, ve kozmetik bilimi.
