Bir hepatosellüler kanser kitle modeli geliştirmek için sadece bir model kullanarak insanların tümör kaynaklı immüntolerans ve özel tedavi kaynaklı açıklığa kavuşturmak yardımcı olabilir, herhangi bir tümör immünoresponses. Karaciğer fibrozis tekniği ile gelişen ortotopik tümör, insan karaciğer kanserinin klinik özelliklerini taklit eder. Bu yöntem hepatosellüler kanser immünolojik çalışmada yararlı bir araç sağlayabilir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için gerekli olan intrasplenik enjeksiyon gibi teknik açıdan daha zorlu adımları gösterebilir. Sonra, elle bir erkek dizginlemek, altı ila sekiz haftalık C57 siyah 6 fare sırt tarafı yukarı. Enjeksiyon bölgesini üç kez temizlemek için alternatif %70 etanol ve Betadine scrubs kullanın.
Daha sonra 160 mikrolitre karbon tetraklorürünü intraperitoneal enjeksiyonla fareye teslim edin ve hayvanı ev kafesine geri döndürün. Beş aylık simian virüsü 40 T antijen transgenik fare, parmak sıkışma yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, supine pozisyonda fare yerleştirin ve bant ile uzuvları güvenli. Linea alba uzunluğu boyunca bir orta hat laparotomi kesi olun, karaciğer yeterli bir maruz kalma sağlamak için yeterince büyük, ve soldaki bağırsakları yerinden.
Inferior vena kava maruz kalma karaciğer üzerinde diseksiyon. Damarı sıvılaştırmak için bir arter kıskaçı ikna edin. Portal vene damardan intravenöz erişim elde etmek ve kateteri manuel olarak sabitlemek için kelebek iğnesi kullanın.
Her çözelti için şırıngaları dikkatlice değiştirerek, 15 mililitre çözelti bir, 15 mililitre 0,75%kollajenaz çözeltisi iki ve 15 mililitre çözelti iki sini kateter yoluyla kollajenaz içermeyen dakikada yaklaşık 8,9 mililitre çözelti akış hızında başarıyla teslim edin. Perfüzyon sonunda, PBS 10 ila 15 mililitre içeren 50 mililitrelik konik tüp içine tümör kütlesi hasat. Bir sonraki MTD2 faresinden tümörü sadece gösterildiği gibi çıkar.
Küçük parçalar halinde karaciğer kesmek için makas kullanın. Doku parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmadan önce dokudaki diğer kanın tamamını çıkarmak için yeni bir pbs kabına dokuları aktarın. Yıkanmış karaciğer örneklerini, parçalar beş mililitrelik pipetin ucuna kolayca sığınana kadar doğrama.
30 mililitrelik son bir hacme ulaşmak için tüpe yeterli ortam ekleyin. Yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 70 mikrometresüzsüzlük yoluyla solüsyon filtreleme önce, doku parçaları triturate için beş mililitrelik pipet kullanın. Süzgeçi birkaç kez tam orta ile yıkayın.
Son hacmi 50 mililitreye, ek tam ortamla ayarlayın. Santrifüjü durdurmadan ve süpernatantı dekantmadan önce süspansiyonu maksimum 50 kez santrifüj ile hızlıbir şekilde döndürün. Sonra saymak için PBS 20 mililitre pelet resuspend.
MTD2 hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu için, fare başına 220 mikrolitre hepatosit içeren her alıcı hayvan başına 27 kalibrelik bir mililitrelik iğne ile donatılmış bir mililitrelik şırınga yükleyin. Anesteziedilmiş, karbon tetraklorürle tedavi edilmiş bir hayvanda ayak parmak kıskacına yanıt verilmemesini doğrulayın. Omurga kasının hemen altından başlayarak, bir sonraki, dorsal aşırı on üçüncü kaburga paralel sol kanadında bir santimetrelik kesi yapmak ve dalak dışa çıkarmak için künt sivri forceps kullanın.
Dalak, dalak ve ven arasında iki orta boy titanyum klipsleri ile klips, ve dalak inferior kutup içine hücrelerin 200 mikrolitre teslim. Pedikülün alt dalını orta boy bir kliple kesin ve başlangıçta yerleştirilen iki klip arasındaki dalağını kesin. Doğrudan tümör hücreleri ile enjekte edildi dalak inferior kutup çıkarın ve 3-0 poliglactin kullanın 910 iç kas tabakası kapatmak için dikiş kesildi.
Sonra dış deri tabakası kapatmak ve subkutan carprofen kilogram başına beş miligram yönetmek için sterilize çelik yara klipleri kullanın. Gösterildiği gibi T antijen transgenik farelerden izolasyon sonrası hem hepatositler hem de tümör infiltrasyon hücreleri görülebilir. Hücreler genellikle işlendikten sonra neredeyse% 100 canlılık göstermektedir.
Yabani tip karbon tetraklorür tedavi edilmiş hayvanlariçine intrasplenik aşılama sonra, nakledilen hepatositbaşarıyla ve güvenilir bir şekilde tümöre özgü simian virüsü ifade ortotopik hepatosellüler karsinom tümörleri büyümek 40 T antijen. MTD2 kitlesinden canlı ve saf hepatosit popülasyonumuzun hazırlanması ve intrasplenik enjeksiyonun doğru uygulanması işlemin başarısı için önemlidir. Ekibimiz intravasküler ve intraperitoneal enjeksiyon yoluyla alıcı farelere hepatosit aşılama test etmesine rağmen, bu diğer yöntemler ortotopik hepatosellüler karsinomu indüklemek mümkün değildi.
Bu model bağışıklık gözetimi ve erken ve tümör ilerlemesinin daha sonraki aşamalarında tolerans için soruşturma sağlayan benzersiz bir platform sağlar. Toksik olduğu için karbon tetraklorür kullanırken lütfen dikkatli olun.
