Bu yöntem, serebral mikro kanama nın etiyolojisi, dağılımı ve saptanması gibi serebral mikro kanama alanında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı LPS enjeksiyonları stably inflamasyon neden olmasıdır. Buna ek olarak, LPS enjeksiyon oldukça basit, ekonomik, ve maliyet-etkin.
Bu yöntem beyin kanaması indüksiyonu hakkında bilgi sağlasa da, depresyon, şizofreni, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve prion hastalığı gibi diğer beyin hastalıklarına da uygulanabilir. 10 haftalık erkek Sprague Dawley sıçanlara vücut ağırlığının kilogramı başına bir miligram dozda intraperitoneal enjeksiyon ile LPS uygulayın, sonra her sıçanı ev kafesine geri döndürün. Altı saat 16 saat sonra LPS enjeksiyonu tekrarlayın.
SD sıçanlarına kilogram başına bir miligram dozda LPS enjekte edilmesinin %5 mortaliteye yol açabileceğini lütfen unutmayın. Mortalite daha genç veya yaşlı sıçanlar veya hamile dişi sıçanlarda artabilir. LPS enjeksiyonundan sonra fareleri kafeslerine geri getirin ve yiyecek ve içeceklere libitum erişimi sağlayın.
Terminal anestezi altında, her sıçanda 5-8 milimetre derin kardiyak delik yapın. Delinme noktası, üçüncü ve dördüncü interkostal alanda göğüs kafesinin sol kenar boşluğuna beş milimetre olmalıdır. İğneyi yerinde tutun ve boş tüpü Evans mavisi içeren bir tüple değiştirin.
Kan iyileşmesi gözlenene kadar bekleyin ve sonra sol kalp ventrikül içine vücut ağırlığı 100 gram başına 0.2 mililitre bir dozda Evans mavi enjekte edin. Immünoresans görüntüleme ile kan / beyin bariyerinden Evans mavi sızıntı değerlendirirken 10 dakika boyunca bir supine pozisyonda sıçan tutun. Serebral vaskülatür ve beyintemizlemek için% 0.9 tuzlu çözeltisi buz gibi 200-300 mililitre kullanarak kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
Fiksasyon için buz gibi %4 paraformaldehite geçin. Sonra, beyni izole ettikten sonra, en az altı saat veya beyin tüpün dibine batana kadar PBS'de %20 sakaroza batırın. Çözeltiyi %30 sakarozla değiştirin ve altı saat daha düzeltin.
Son olarak, bir kriyostat kullanarak 10 milimetre kalınlığında beyin dokusu bölümleri hazırlamak. Slaytları PBS ile üç kez beşer dakika yıkayın, ardından 4, 6'diamidino-2-fenilindole veya DAPI çözeltisi ile oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha önce olduğu gibi PBS slaytlar yıkadıktan sonra, PBS-gliserol çözeltisi ile slaytlar monte.
Floresan mikroskobunda görüntüleri yakalayın. EB birikimi kırmızı floresan ile gösterilir, çekirdekler mavi floresan ile gösterilir. Damıtılmış suda slaytlar yıkayarak H & E boyama başlayın.
Sonra sekiz dakika hematoksilin çözeltisi batırın. Alternatif olarak, Perl Prusya mavi boyama için, 10 dakika boyunca ferrosiyanid ve hidroklorik asit eşit parça karışımı ile reaksiyon çözeltisi leke. Boyama sonra, beş dakika boyunca akan musluk suyu yıkayın.
30 saniye boyunca %1 asitalkolü ayırt edin. Bir dakika boyunca akan musluk suyunda yıkandıktan sonra, %0,2 amonyağ suyunda veya doymuş lityum karbonat çözeltisinde 30 saniye ile bir dakika arasında lekeleyin. Daha sonra, beş dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın.
30 saniye ile bir dakika arasında eozin çözeltisi ile karşı lekesi. % 90 alkol, daha sonra% 95 alkol ve 0,5-2 dakika her biri için mutlak alkol ile dehydrate. Dehidratasyondan sonra, ksilenin içinde 30 saniye boyunca temizleyin.
Monte ettikten sonra, parlak alan floresan mikroskobu kullanarak H&E boyama analiz edin. CmH'lerin bileşenleri olan kan damarlarından salınan kırmızı kan hücreleri H&E boyama altında kırmızı-turuncu renkte görünür. Yüzey CMH'leri, kırmızı oklarda belirtildiği gibi brüt gözlem le tespit edilebilir.
Evans mavi boyama evans mavi molekülleri yaralı bir kan-beyin bariyerinden sızan görünür kırmızı floresan ortaya koymaktadır. H&E boyama kılcal damarlar dışında bulunan kırmızı kan hücreleri gösterir, ve Prusya boyama kırmızı kan hücrelerinin lysis türetilen ferrik iyon noktaları gösterir. Bu prosedürü çalışırken, bu serebral mikro kanama neden LPS dozu Parkinson hastalığı veya şizofreni modelinde kullanılan daha büyük olduğunu hatırlamak önemlidir.
Bu nedenle, hayvanların çevre mortalite oranını azaltmak için temiz tutulmalıdır. Bu işlemden sonra, serebral mikro kanamada kan-beyin bariyerinin dış yapısına verilen zararı belirlemek, beyin paranilinde beyin parankiminin in vivo'da serebral mikro kanamaların dağılımı ve glial hücre aktivasyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.
