Bu yöntem, mühendis vasküler büyüme dinamiklerinin izlenmesi ve uzun vadeli kültür boyunca yeniden biçimlenme gibi vasküler doku mühendisliği alanında anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Optik koherens tomografi, ya da OCT kullanmanın en büyük avantajı, mühendislik gemilerinyapısal özellikleri ve yeniden şekillendirme sürecini karakterize etmek için hazır, gerçek zamanlı ve tahribatsız görüntüleme stratejisi olmasıdır. Prosedürü gösteren de Shangmin Liu ve Wentao Ma, benim laboratuvar teknisyenleri olacaktır.
Bu prosedürü başlatmak için, bir dakika için bir mol-per-litre sodyum hidroksit metin protokolü Dip PGA iskeleler açıklandığı gibi PGA iskele imal, mesh aralıklı yapısını ayarlamak için. Daha sonra, her biri iki dakika doku-kültür sınıf su iskeleleri üç kez ıslatın. Her zaman, hafifçe bir kağıt mendil ile iskele kuru pat.
Sonra, bir saat için bir üfleyici ile bir başlık içinde iskelekuru. Oct görüntüleme için biyoreaktör ve y-kavşak monte etmek için, ilk olarak, kendi geliştirdiği cam silindirik biyoreaktör, PGA iskeleler, silikon tüp, biyo-uyumlu tüpler, konektörler, karıştırma çubuğu ve iki saat boyunca yüzde 95 etanol tankı montaj için ekipman ıslatın. PGA iskelesini, bir konektörle bir tarafa bağlanan biyoreaktörün yan kollarından ve OCT kılavuz kablosunu teslim etmek için kullanılan y-kavşağı ile başka bir tarafa çekin.
Biyoreaktörde aynı şekilde başka bir PGA iskelesi monte edin. Politetrafloroetilen'i 4-0 dikişle sıkarak biyoreaktör dudaklarına takın. Biyoreaktörü, üfleyici açık bir başlıkta bir gecede kurutmadan önce bir saat boyunca tekrar etanol tankına koyun.
Şimdi, standart explant teknikleri ile insan göbek arter düz kas hücrelerini izole PGA iskeleiçine hücreleri kurtarma nedeni, biyoreaktör altında hücre süspansiyon herhangi bir damlama önlemek. Ayrıca, kontaminasyonu önlemek için hücre oturma sonra en kısa sürede silikon-stoper kapağı ile biyoreaktör kapağı. Genişletmek ve düz kas büyüme orta hücreleri korumak.
Tohum insan göbek arter düz kas hücreleri pga iskeleler üzerine yukarıdaki kültür ortamda 5 milyon hücre başına mililitre konsantrasyonu. Biyoreaktör bir sir bar yerleştirdikten sonra, bir besleme tüpü ve gaz değişimi için takılı üç kısa boru segmentleri olan silikon stoper kapağı kapağı. Her hava değişim tüpüne PTFE 0,22 mikron filtreler takın ve besleme tüpüne bir heparin kapağı takın.
Karıştırma çubuğunu dakikada 13 mermi lik karıştırma hızıyla ayarlayın. Sonra, kültür sistemine cam biyoreaktör, silikon stoper kapağı ve PGA iskele monte. Hücrelerin biyoreaktörü her 15 dakikada bir sola ve sağa doğru bir duruşla yaslayarak 45 dakika yapışmasını bekleyin.
Şimdi, loo-OH-YEE pompa, fosfat tamponlu tuzlu çanta ve sürücü biyouyumlu tüpler ile profüzyon sistemi oluşturmak için bağlayın. Tüpleri PBS ile doldurmak için sürücüyü açın. Genel biyoreaktörü 37 santigrat derecede yüzde 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuvöze yerleştirin.
Kültür odasını 450 mililitre kültür ortamıile doldurun. Bir hafta boyunca statik kültür altında tohumlu iskeleler büyümek, beslenme tüpü ile eski ortamın yarısını spirating ve taze kültür ortamı eşdeğer miktarda reaktör doldurarak her üç ila dört günde bir kültür ortamı değiştirerek. OCT görüntüleme için profüzyon sistemi hazırlamak için, biyouyumlu tüpler aracılığıyla bunları sirküle ve geri çanta için PBS çanta sıvıları pompa.
Sürücünün gücünü açın ve dakikada 60 atım frekansı ve 120 milimetrecıcı lık bir çıkış sistolik basıncı ile pompa ayarını düzenleyin. Mekanik parametreleri doku mühendisliği vasküler kültürünün ihtiyaçlarına göre ayarlayın. Profüzyon sisteminin çalışması için çalıştır düğmesini tıklatın.
Statik kültür bir hafta sonra yinelemeli biyouyumlu tüpler basınç tarafından üç hafta boyunca gemilere düzeltme pulsatil simülasyon sağlayın. On ila yirmi mikron eksenel çözünürlüğü ve doku mühendisliği kan damarlarıveya TEVBs yapısını belirlemek için bir ila iki milimetre görüntü derinliği sağlamak için bir ışık kaynağı kullanın, frekans etki OCT intravasküler görüntüleme sistemine dayalı. Güç düğmesini açın ve görüntü yakalama yazılımını açın Fiber optik görüntüleme kateterini kateter otomatik geri çekilme fonksiyonu ile sürücü motoruna ve optik kumandaya bağlayın.
Görüntü edinme hızının parametrelerini saniyede on milimetre otomatik geri çekme hızıyla saniyede on kare olarak ayarlayın. Şimdi, görüntüleme kateterini 18 kalibrelik bir iğneyle heparin kapağı ile y-kavşağına takın. Kateteri silikon tüpün içine yerleştirin ve PGA iskelesini biyoreaktöre yüklemeden önce PGA kafesinin yapı sıkılığını belirleyin.
Şimdi, kateter ucunu ilgi alanının üzerine yerleştirin. Geri çekme aygıtını ayarlayın ve görüntü kalitesini kontrol edin. Her bir TEBV için bir, dört, yedi, on, 14, 17, 21 ve 28 günlük kültür görüntüleri edinin.
Yüzey morfolojisi, iç yapısı ve bileşimi de dahil olmak üzere TEBV mikroyapısının gerçek zamanlı gözlemi ile bu görüntüleri sırayla kaydedin. Her seferinde tasarlanmış gemilerin güvenilir bir ölçümünü almak için ölçümü üç kez tekrarlayın. Görüntü yakalama yazılımını kullanarak test boyunca bir dizi görüntü yakalayın.
Doku mühendisliği kan damarı duvar kalınlığıölçmek için görüntü analizi yazılımı kullanmak için, öncelikle analiz edilecek görüntü seçin. Ardından, doku mühendisliğiyle tasarlanmış kan damarının iç tarafını yazılımla otomatik olarak tanımlamak ve dış tarafı el ile çizmek için izleme aracını tıklatın. Ekranda kalınlık diyagramı görünür.
Yapıların güvenilir bir ölçüm almak için beş kez ölçüm tekrarlayın. Bilgi almak la yükümlü iki bağımsız araştırmacı kullanmayı düşünün. Kültür bittiğinde biyoreaktörün üzerine yerleştirilen silikon stoper kapağını açın ve kültür ortamını atın.
Biyoreaktör dudaklarından politetrafloroetilen gevşetin ve makas ile politetrafloroetilen dış tarafında silikon tüpler kesti. TebVs'leri biyoreaktörden toplayın ve tarama-elektron mikroskobu incelemesi için kesin. Destekleyici silikon tüp çekin ve yüzde 4 güç formaldehit ile bölümleri düzeltmek.
Kollajen ve PGA morfolojisini incelemek için masson'un trikrom ve sirious kırmızısı ile rutin histolojik boyama yapın. PGA içeriğini ve kollajen bileşenini değerlendirmek için, polarize mikroskop ta sirious kırmızı boyama ile histolojik örnekleri gözlemleyin. OCT görüntüleri dört haftalık kültürden sonra TEBV'lerin histopatolojik buluntuları ile karşılaştırılır.
OCT görüntüsü, histolojik değerlendirmeile karşılaştırıldığında kompakt mikroyapı ve belirli bileşenleri gösterir. Kültür ortamı, silikon tüp, TEBV ve PGA parçası görülebilir. Masson'un üç renkli boyama, tasarlanmış gemilerin medya katmanındaki PGA kalıntılarıyla birlikte belirli bir yönde dağıtılan kollajen lifleri göstermektedir.
Sirius kırmızı boyama polarize mikroskop kullanarak PGA kalıntıları ve kollajen bileşeni ortaya koymaktadır. Mühendislik yapılı gemilerin tarama-elektron mikrografları kompakt bir mikroyapı gösterir. Bu arada, bu intraluminal görüntüleme yöntemi, uzun soluklu kültürde remodeling süreci ve görsel morfoloji dahil olmak üzere TEBV'lerin zararsız ve kolay izlenmesini benimser.
Burada gösterildiği gibi, remodeling daha erken gerçekleşir ve morfolojik değişiklikler TEBV kalınlığı nın karşılaştırılması ile dinamik grupta daha belirgin bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Bu teknik, vasküler doku mühendisliği alanında araştırmacıların yapı özelliklerini ve mühendislik yapılarının uzun vadeli yeniden biçimlenme sürecini keşfetmelerinin önünü açtır. Polimerik kalıntıların polarize mikroskopi ile açık bir şekilde gösterilmesi, OKK görüntüleme siperatrinin değerlendirilmesinde yararlı olabilir.
