Bu eser bir NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü (Ödülü No tarafından finanse edildi DP2HD091793). Q.D.M. NSF yüksek lisans araştırma bursu Program tarafından (Grant No desteklenir DGE-1650044). B.A.H Georgia Tech Başkan'ın bursu yanı sıra ulusal kurumları sağlık GT BioMAT eğitim Grant'ın ödülü numarası 5T32EB006343 altında tarafından desteklenir. G.A.K. tutar bir kariyer Ödülü Burroughs hoş geldiniz fondan bilimsel arayüz. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kurumsal onayını araştırmacı kurumu aşağıdaki hayvan deneyleri yapmak gereklidir. Ayrıca, standart hayvan bakım tesisleri (konut chambers, steril hayvan davlumbaz, isofluorane salonları için anesthetization ve CO2 salonları etik bitiş noktası euthanization içinÖrneğin, ) düzgün bunları gerçekleştirmek için gereken deneyler. Özel eğitim ve yardım bu tesisler ile kişinin Kurumu fizyolojik Araştırma Laboratuvarı (PRL) tarafından sağlanabilir. Tüm hayvan iş IACUC Georgia Tech tarafından kabul edildi (protokol: A14100).
1. demir oksit nanoparçacık (IONP) sentezi
Not: Emanet: tüm demir oksit nanoparçacık sentezi kişisel koruyucu donanımları kullanarak yapılmalıdır ve kaputun altında bir kimyasal duman.
<ol><li>15 mL konik tüp buz kovası 30 dk için % 30 amonyum hidroksit 1 mL soğuk.</li>
	<li>250 mL Erlenmeyer flask deiyonize su ile yıkama ve 10 mL Çift Kişilik distile su (GKD2O) ekleyin. Bir heyecan/ısı plaka üzerinde dinlenme bir buz banyosu şişeye dýþýna daldırın. GKD2O balonun içinde içine akış N2 gaz için plastik bir pipet kullanın. Kabarcık deoxygenate N-2 ile 15 dakika.</li>
	<li>224 µmol (4.5 gram) dextran tartmak (Moleküler ağırlığı (MW) = 20 kDa) 50 mL konik tüp içine. Öyle ki son hacim karışımı dextran dahil olmak üzere 20 mL H2O ekleyin. Girdap şiddetle dextran geçiyoruz.</li>
	<li>290 µmol (78.5 gram) demir(III) klorür hekzahidrat tartmak, dextran çözüm ve çözülmeye girdap için ekleyin.</li>
	<li>Elde edilen çözüm 0.2 µm filtreden filtre.</li>
	<li>1 soğutulmuş mL amonyum hidroksit 9 mL deoxygenated su aktarın. 4 ° C'ye dön</li>
	<li>İron(II) klorür tetrahydrate 367 µmol (73,0 gram) tartmak, 1 mL oksijensiz GKD2O geçiyoruz ve 0.2 µm filtreden filtre.</li>
	<li>Dextran-iron(III) çözüm 250 mL Erlenmeyer şişesi aktarmak ve N2 ile 15 dakika boyunca buzda deoxygenate. 1600 devir/dakika, iplik bar manyetik bir heyecan ile karıştırın.</li>
	<li>Homojen azot atmosfer yaratmak için balon lastik septum ile kap. Ponksiyon bir 18 ile septum balonun iğne akış N2 için ölçmek. Ayrı 18 gauge iğne bir akış çıkış gibi ekleyin.</li>
	<li>467 µL iron(II) çözüm dextran-iron(III) 1600 devir/dakika bir manyetik heyecan çizgiyle karıştırarak 1 mL şırınga ile ekleyin. Bu oran demir(III) iron(II) manyetit veya Fe3O4üretecek dengeli bir tepki olarak sonuçlanır.</li>
	<li>Soğutulmuş amonyum hidroksit dropwise çekirdekleşme süreci21başlatmak için demir (II) - demir (III) - dextran çözümde seyreltik ekleyin. Emin olun her damlacık de diğerinde silmeden önce karışımları. Amonyum hidroksit 1-2 mL ilavesi sonra reaksiyon bitirmek.</li>
	<li>N2 akışını durdurmak ve kauçuk septum kaldırın. Buz banyosu kaldırın ve çözüm karıştırmaya devam ederken sıcak su, banyo ile değiştirin. Çözüm sıcaklığını 75 ° C ulaştığından emin olmak ve 75 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
	<li>Şişeye heyecan/sıcak plaka kaldırmak ve iki kat iri parçacıklar kaldırmak için 0.2 µm sonra 0,1 µm filtreleri yoluyla çözüm filtre.</li>
	<li>Arabellek Döviz aşırı dextran çok yapışkan olması gereken çözümden kaldırmak için (m.w.c.o.) yoğunlaştırıcıları parçacıklar halinde GKD2100 kDa moleküler ağırlık kullanarak O kesti. Aracılığıyla akış bile 2-3 tur sonra filtre kırık gösterir karanlık kalırsa filtreler yerini alır.<ol>
<li>Exchange spin filtreleri ile tampon, 4800 X g de 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi, akış yoluyla atmak ve yeni tampon IONP çözüm için. 3 - 5 kez tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spektrofotometre/plaka okuyucu kullanarak nano tanecikleri konsantrasyonu belirlemek. Almak absorbans ölçümleri 400 nm ve kullanım IONP molar absorptivity, bu dalga boyu (ε 2,07 106 cm-1 M-1x =) g/ç parçacıklar konsantrasyonu belirlemek için.</li>
	<li>IONPs 10 mg/ml GKD2içinde (genellikle toplam ~ 3 mL birimdir) O resuspend ve kimyasal uyumluluk için bu adım için polipropilen borular kullandığınızdan emin olun. 5 M NaOH 1.6 birimleri ekleyin, sonra hidrin 0.65 hacimleri ekleyin. Titizlikle crosslink dextran için 12 saat üzerinde oda sıcaklığında bir plaka shaker karıştırın.</li>
	<li>20 mL şırınga bir 18'lik iğne ile IONP çözüm 50 kDa m.w.c.o. diyaliz membran aktarmak için kullanın. Diyaliz membran 4 L GKD2O yerleştirin ve H2O bir kaç kez (her 2-3 saat) değiştirin. Gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Konsantrasyonu ölçümü ve IONPs 5 mg/mL (bkz. Adım 1,15) getirin. Amonyum hidroksit %20 (v/v) ulaşmak ve IONPs yüzey aminate için > 12 saat oda sıcaklığında sallamak için ekleyin. (Bkz: 1.14) 30 kDa m.w.c.o. filtreleri kullanarak exchange tampon.</li>
	<li>Ses seviyesini aşağı 2,5-3,5 mL hızlı Protein sıvı kromatografi (FPLC; jel filtrasyon sütun için bkz: Tablo reçetesi ) tarafından son arıtma önce.</li>
	<li>Dinamik ışık saçılma (DL) IONPs (beklenen aralığı 10-100 nm, ortalama boyutu 40-50 nm) hidrodinamik çapını belirlemek için kullanın. Aliquoting 1 mL 100 X seyreltilmiş IONP örnek bir küvet içinde bunu, içinde belgili tanımlık makine yerleştirin ve ölçüm almak için üreticinin yazılımını kullanın. Not: IONPs toplam nüfusu DLS ölçümleri tarafından 10 ve 100 nm arasında olacak, ama 40-50 nm aralıkları ortalama çapı nüfusun çoğunluğu civarındadır. Bir boyut aralığı sınırlamak istiyorsa, bir daha da farklı çaplarda kesirler yalıtmak için boyut dışlama Kromatografi kullanabilirsiniz. IONPs 4 ° C'de muhafaza edilmelidir</li>
</ol>2. peptid tasarım, konjugasyon IONP ve Vitro doğrulama
<ol><li>Bir hedef proteaz için (Örneğin, bir çekirdek tesis veya ticari olarak) peptid substrat thiol aracılı bağlantı izin veren bir N-terminal floresan muhabir floresein isothiocyanate (FITC) gibi ve C terminal sistein kalıntıları ile sentez. Not: MMP9 Bu çalışmada söz konusu olduğunda, kullanılan peptid FITC-PLGVRGK-C, kkedi/Km ile oldu ~ 2.0 x 105 M-1s-1.</li>
	<li>Aliquot IONP (, 1 mg/mL) ve arabellek kaplin içine arabellek Döviz 0.5 mg (1 mM EDTA ile 50 mM sodyum borat, pH 8,5 =) 10 kDa m.w.c.o. spin filtre (bkz. Adım 1.14) kullanarak.</li>
	<li>Dimethylformamide (DMF) ~ 30 mg/mL bir konsantrasyon ulaşmak için Succinimidyl iodoacetate (SIA) dağıtılması ve SIA IONP için 500 SIA:IONP bir köstebek oranında ekleyin. Not: SIA bir heterobifunctional olduğunu çapraz bağlayıcı kaplin peptid substrat sulfhydryl gruplara IONPs üzerinde aminlerin aracılık eder.</li>
	<li>1-2 saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya. Gecede bırakarak, 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Tampon unreacted SIA kaldırmak için arabellek kaplin içine 10 kDa m.w.c.o. spin filtresi kullanma exchange (bkz. Adım 1.14).</li>
	<li>Nihai ürün çözüm 1 mg/mL (0.5 mL solüsyon) getirin. 20 kDa thiol sonlandırılmış Polietilen glikol (PEG) molar oranını 20:1 (PEG: IONP), 90:1 (peptid: IONP) molar oranında faiz peptid karıştırın. Bu peptid-PEG çözüm IONP ile karıştırın.</li>
	<li>Gecede, oda sıcaklığında en yüksek hız, floresan moleküllerin photobleaching önlemek için folyo tüplerde kapsayan bir plaka shaker üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>L-sistein herhangi bir unreacted SIA molekülleri etkisiz hale getirmek için 500:1 (C:IONP) bir molar oranı ekleyin. Bir shaker, oda sıcaklığında en yüksek hızda üzerinde 25 ° C'de 1 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Via FPLC arındırmak (bkz. 1.1.19). Bir spektrofotometre örnek çözümü absorbans ölçümü ve peptid: IONP oranı aşağıdaki göre hesaplamak için kullanın. Arıtma sonra ürün 1 mg/mL 4 ° C'de, PBS içinde saklayın.<ol>
<li>Örnek çözüm 400 absorbans ölçmek için bir spektrofotometre kullanın nm (birörnek, 400) ve dalga boyu 488 olan maksimum absorbans için kullanılan, fluorophore nm FITC (birörnek, 488) için. Aynı iki dalga boylarında bir hisse senedi Amin IONP çözüme absorbans ölçmek (400 nm ve 488 nm), hangi sırasıylaNP, 400 veNP, 488gösterilir.</li>
		<li>Denklemler normalleştirilmiş hesaplamak için 1 ve 2 A400 ile488 değerlerini kullanın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">Denklem 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">Denklem 2</li>
		<li>Bir400 ve488 örnek normalleştirilmiş değerini temsil eder. Peptid: IONP Denklem 3 ile oranını hesaplamak için bu değerleri kullanın. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">Denklem 3</li>
		<li>Nerede <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> ve <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> IONP ve fluorophore molar absorptivities sırasıyla vardır. Bu parçacıklar için <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> 2,06 106 M-1cm-1 x ve FITC için = <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72.000 M-1cm-1, yani değerini <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> 28,75 olmalıdır. Tipik peptid: IONP oranları 20:1-50: 1 aralığında olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir vitro bölünme tahlil gerçekleştirerek sondalar işlevselliğini doğrulayın.<ol>
<li>PBS ile (% 1 BSA), 18 µL nanopartikül çözümünü peptid 200 nM konsantrasyon ile yapmak. Mix proteaz ilgi 2 µL ile (MMP9; 0.1 - 1 mg/mL).</li>
		<li>Bir plaka okuyucu 37 ° C'de 1 saattir floresans ölçümleri alarak, kuluçkaya (485 olan uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında kullanarak, nm ve 528 nm FITC için sırasıyla) bölünme izlemek için her 1-2 dakika.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nanosensors ve idrar algılama kanser İdaresi
Not: bizim önceki rapor13örnek modeli hakkında daha fazla bilgi için bkz:.
<ol><li>İdrar koleksiyonu için metabolik bir kafes 96 iyi plaka tepesine silindirik bir kol güvence tarafından oluşturun. İdrar toplama sırasında bir fare iç kol ve hayvan kaçış önlemek için bir Petri kabına kapaklı kapağı yerleştirin.</li>
	<li>Nanosensors, 3000 mg/kg (~ 50 µmol) bir konsantrasyon içeren bir enjeksiyon çözüm (200 µL maksimum ses) steril serum fizyolojik içinde peptid hazırlayın.</li>
	<li>Xenograft LS174T Kolorektal tümörler ~ 100-300 bir yük taşıyan kadın, 8 - hafta eski, çıplak farelerde mm3üzerinde yaklaşık oluşması, gün 10, nanosensor eriyik yolu ile kuyruk ven enjeksiyon yönetmek. Hemen sonra enjeksiyon, fareler metabolik kafesler yerleştirin ve enjeksiyon zaman her fare için unutmayın.</li>
	<li>60-90 dakika sonra enjeksiyon, silindirik kol 96-şey tabaktan kaldırın. Fare dizginlemek ve fareler plaka üzerine kalan herhangi bir idrar geçersiz kılmak için ikna etmek için mesane hafif basınç uygulayın. Tüm idrar (200-500 µL) toplamak.</li>
	<li>İdrar numuneleri FITC idrardan arındırmak ve duyarlılığı artırmak için immunoprecipitation tarafından analiz. Manyetik boncuklar Anti-FITC antikorlar ile birleştiğinde kullanın.<ol>
<li>İlk olarak, 25 mg 3 kez ile kaplama arabellek manyetik boncuklar yıkama ve son hacim için 225 µL getir. Not: Kaplama tampon (0.1 M sodyum borat, pH 9,5), engelleme arabellek (PBS, % 0.5 BSA, %0.05 Ara 20, pH 7,4) ve çamaşır tampon (PBS, % 0,1 BSA, %0.05 Ara 20, pH 7,4) taze her zaman ve her yaklaşık 20 mL gereklidir yapmak önemlidir.</li>
		<li>200 µL anti-FITC (5 mg/mL) ve amonyum sülfat (3 M) 200 µL ekleyin. 16-24 saat 37 c bir rotator üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Çözüm için manyetik ayırıcı eklemek, süpernatant kaldırmak, 625 ile yerine <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> </img>tampon ve 37 C gecede kuluçkaya Λ engelleme. Sonra 3 kez yıkama arabellek ile yıkayın ve 1,25 mL yıkama arabelleğinde depolar.</li>
		<li>İdrar 2 µL 5 µL manyetik boncuklar (20 mg/mL) ile kuluçkaya ve PBS ile 50 µL toplam bir birime getirmek (% 0.01 arası 20). 60 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>İki kez 50 µL PBS ile yıkama (% 0.01 arası 20) manyetik ayırıcı her yıkama sonra manyetik boncuklar toplamak için kullanıyor.</li>
		<li>İki kez 32,5 µL % 5 buzul asetik asit ile elute. Havuza alınan elüsyon (70 µL) 2 M ~ 7 son pH elde etmek için Tris 35 µL ile etkisiz hale getirin.</li>
		<li>Bir plaka okuyucu okumak ( Tablo malzemelerigörmek), idrar floresans ölçmek için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında. Ücretsiz fluorophore bilinen konsantrasyonları merdivenden karşı Floresan muhabir konsantrasyonu hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez-Otin, C., Bond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases:+Multifunctional+enzymes+in+life+and+disease.">Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).</li><li>Hua, Y., Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteases+in+cardiometabolic+diseases:+Pathophysiology,+molecular+mechanisms+and+clinical+applications.">Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).</li><li>Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+role+of+proteases+in+cancer.">Unraveling the role of proteases in cancer.</a> Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).</li><li>Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+proteases+or+protease+system+components+in+blood+to+enhance+prediction+of+disease+risk+or+outcome+in+possible+cancer.">Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+surface+acoustic+wave+resonators+built+on+disposable+plastic+film+for+electronics+and+lab-on-a-chip+applications.">Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications.</a> Scientific Reports. 3, 2140 (2013).</li><li>Ma, W., Liu, H. -. T., Long, Y. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dopamine+quinone-induced+dopaminergic+neurotoxicity+using+dopamine+functionalized+quantum+dots.">Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).</li><li>Zhang, W. -. H., Ma, W., Long, Y. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-mediated+indirect+fluorescence+immunoassay+for+the+detection+of+disease+biomarkers+using+dopamine-functionalized+quantum+dots.">Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+electron-transfer+processes+using+a+biomimetic+hybrid+bilayer+membrane+system.">Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system.</a> Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).</li><li>Holt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+microparticles+can+modulate+the+physical+extent+and+magnitude+of+complement+activity.">Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity.</a> Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).</li><li>Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteases:+Recent+advances+in+the+design+and+application+of+substrate-based+and+activity-based+probes.">Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).</li><li>Kleifeld, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+proteolytic+events+and+the+natural+N+terminome+by+terminal+amine+isotopic+labeling+of+substrates.">Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).</li><li>Sanman, L. E., Bogyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+profiling+of+proteases.">Activity-based profiling of proteases.</a> Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease.">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).</li><li>Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained-release+synthetic+biomarkers+for+monitoring+thrombosis+and+inflammation+using+point-of-care+compatible+readouts.">Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts.</a> Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).</li><li>Meester, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+impact+of+achieving+80%+colorectal+cancer+screening+rates+in+the+United+States+by+2018.">Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018.</a> Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).</li><li>Mehner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-produced+matrix+metalloproteinase+9+(MMP-9)+drives+malignant+progression+and+metastasis+of+basal-like+triple+negative+breast+cancer.">Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).</li><li>Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+molecular+target+assessment+of+matrix+metalloproteinase+inhibition.">In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition.</a> Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).</li><li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers.">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li><li>Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+noncommunicable+diseases+using+synthetic+urinary+biomarkers+and+paper+microfluidics.">Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+framework+for+activity-based+cancer+biomarkers.">Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).</li><li>Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+spatiotemporally-responsive+nanosensors+of+in+vivo+protease+activity.">Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity.</a> ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).</li><li>Palmacci, S., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+polysaccharide+covered+superparamagnetic+oxide+colloids.">Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids.</a> US patent. , (1991).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+nanoparticles.">Renal clearance of nanoparticles.</a> Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+actuation+of+nanoparticle+self-assembly.">Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly.</a> Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).</li><li>Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+tumour-penetrating+nanosensors+of+protease+activity.">Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li><li>Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Peptidase+activities+in+complex+proteomes+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).</li><li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+exoprotease+activities+confer+tumor-specific+serum+peptidome+patterns.">Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).</li></ol>

Dr. Kwong kurucularından ve danışman Glympse Bio, ürün geliştirme için bu makalede açıklanan araştırma ile ilgili olarak hizmet vermektedir. Bu çalışmada kişisel finansal durumu etkileyebilir. Bu düzenleme şartları gözden geçirilmiş ve Georgia Tech tarafından kendi çıkar çatışması ilkelerine uygun olarak onaylanmış

Bu yöntem bir nanopartikül çekirdek Birleşik proteaz yüzeylerde oluşan etkinlik tabanlı nanosensors gelişimi anlatılmaktadır. Çünkü i ciddi peptid ürünleri böbrek filtrasyon boyutunda 5 nm23 ve noninvaziv bir sinyal üretmek için idrar içine filtre daha küçük olay proteolitik dekolte "farmakokinetik anahtarı" lakaplı. Bu nedenle, 5'ten daha büyük bir hidrodinamik RADIUS içeren nano tanecikleri veya taşıyıcıları kullanmak önemlidir nm, daha küçük bir şey gibi hızla böbrekler tarafından temizlenir ve idrar sinyalleri yıkmak. Çünkü onlar FDA onaylı, iyi tolere ve 3-5 saat dolaşan bir yarı ömrü var pegile IONPs kullanın. 13 peptid substrat molar oranı PEG nanosensors formüle başka bir önemli unsurlardan biridir. 24 , 25 oranı artan belirsiz göğüs arası steric peptidler26tane koruyucu aracılığıyla hedef proteaz azaltmak, ancak potansiyel hedef üzerinde etkinlik de azaltmak. Diğer taraftan, daha düşük bir PEG peptid oranı proteaz erişilebilirlik ve algılama sinyali yükseltmek ama aynı zamanda arka plan gürültü artırabilir peptidler, bölünme artacaktır. Vivo, PEG bir alt yüzey konsantrasyon da retiküloendotelyal sistemi (RES) tarafından nanosensor alımını artırmak ve dolaşım zamanı azaltmak.
Diğer hastalıkları teşhis etmek için bu teknolojiyi uygulamak için upregulated bir hastalık durumunda olan proteaz edebiyat17tespit edilmelidir. Bu nanosensors anlamda hücre içi etkinlik hücrelerine nüfuz için tasarlanmış değildir çünkü bulma çabaları ekstraselüler proteaz üzerinde odaklanmalıdır. Bu nanosensors Ayrıca hedeflemek için birçok aday hastalığın sağlayan peptid ortasında, bölmek mantıklı endoproteases şekilde tasarlanmıştır. Hücre dışı endoproteases yalnız hedefleyerek teşhis için karaciğer fibrozis, kanser ve tromboz13,19,20,21birden çok türde geliştirdik. Bu platform daha sonra endoprotease bölünme bağlamında hastalığı26,27, exoprotease etkinlik için soruşturma için tasarlanabilir. Faiz proteaz için belirli bir peptid substrat tasarlamak önemlidir. Bu aday peptid diziler vitro bölünme tahlil (adım 2.10-2.11) ile eleme tarafından başarılı olabilir. Olası belirsiz proteaz bölünme de peptid tasarım sırasında test edilmelidir. Örneğin, MMP9 söz konusu olduğunda, substrat özgüllüğü Trombin, kan yüksek konsantrasyonda bulunan bir koagülasyon proteaz ile test ettik. Etkinlik nanosensors vivo içindekullanmak için en uygun idrar toplama zamanı görüntüleme veya idrar ayrık örnekleme nanosensors İdaresi sonra kinetik sinyal üretim izleyerek tespit edilmelidir. Fareler de steril serum fizyolojik ile hayvan overhydrate ve idrar üretimi artırmak için ilham. Pratik olarak, bu teknoloji ile upregulated veya downregulated ekstrasellüler proteaz aktivitesi herhangi bir hastalık için genişletilebilir. Bu platform gücünü hedef proteaz sinyal, amplifikasyon için sağlanmıştır yalnızca hastalık-site proteaz nüfusun bir kısmı ankete olsa bile, önemli bir eşleştirmeyi ölçülebilir bu yüzden. Geçerli platform anlamda hücre dışı endoproteases için tasarlanmıştır. Öyle ki bu platform ilgi anlamda proteaz için ayarlanan bu platform için diğer hastalıklar uygularken, bir proteaz biyoloji bu hastalığın tanımlamak gerekiyor.
Bu çekirdek teknolojisi daha fazla uygulama sayısını artırmak için farklı analitik platformlara tespit edilebilir dekolte gazetecilere tasarlanmış. Örneğin, ligandlar antikor bağlama için içeren dekolte gazetecilere kağıt testler için düşük maliyetli bakım noktası tanılama19tarafından tespit edilebilir. Ayrıca, yüzeylerde kitle gazetecilere etiketleme birden çok proteaz aynı anda idrardan kütle spektrometresi13tarafından tespit edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem hastalık bir noninvaziv idrar biyomarker proteaz aktivitesi vivo içinde anlamaya formüle etkinlik tabanlı nanosensors açıklar.

Proteaz peptid bağları hidroliz içinde uzmanlaşmak ve önemli homeostazı, allostasis ve hastalık1de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin kontrole sahip çok fonksiyonlu enzimlerdir. Bir değişmiş devlet proteaz aktivitesinin hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, proteaz çekici adaylar için geliştirme klinik biyolojik2,3içine yapım da dahil olmak üzere çeşitli korelasyon. Ayrıca, proteaz işlevsel olarak bağlantılı ayrı pathogeneses, hasta sonuçları ve hastalık4prognozunda faaliyettir. Geniş, biyosensörler çeşitli biyolojik olayları algılamak için geliştirilmiştir ve hastalıklar, kanser, nörodejeneratif hastalık ve Elektron transferi gibi işler5,6,7,8 , 9. daha ayrıntılı olarak, substrat tabanlı proteaz sensörler proteaz bir etkinlik tespit ve fluorogenic sondalar10 görüntüleme tanı için eklemek için geliştirilen edilmiş ve isotopically peptid yüzeylerde içinde vitro için etiketli Algılama işlemi, kütle spektrometresi11tarafından. Buna ek olarak, hangi bağlamak veya değiştirme hedef proteaz12substrat benzeri bölgeleri içeren etkinlik tabanlı probları geliştirilmiştir. Bu yöntemde, hedef proteaz geri dönüşümsüz aktif değiştirilir ve in vivo uygulamaları sınırlayan dokusunun hasat analiz gerektirir engellenir. Ancak, yönetmelik proteaz aktivitesinin ağır endojen inhibitörleri varlığı gibi diğer biyolojik etkinlikler kapsamında bağlı olduğundan proteaz aktivitesi in vivo, anlamda önemlidir.
Amaç bu eserin idrarda ölçülebilir bir sinyal üreterek proteaz aktivitesi vivo içinde algılamak etkinlik tabanlı nanosensors formülasyonu tarif etmektir. Bu platform bir noninvaziv tanı dysregulated proteaz aktivitesi işlevsel bir biyomarker kullanarak karmaşık hastalıklar kanser gibi ayrımcılık için kullanılır. Nanosensor platformumuz proteaz yüzeyler için Birleşik demir oksit nano tanecikleri (IONP) oluşur. Bu yüzeylerde proteaz substrat ayırmak bağlandığınızda serbest floresan bir muhabir tarafından sonlandırılır. Bu IONPs vivodolaşımını, hastalık sitelere yerelleştirilmesine ve yüzeylerde aktif hastalık ilişkili proteaz için maruz. Bölünme sonra floresan gazetecilere serbest bırakılır ve IONP üzerinde uncleaved yüzeylerde vücutta kalır kendi küçük boyutu nedeniyle idrar içine, filtre uygulanır. Bu nedenle, proteaz faaliyetleri vivo içinde artış bir muhabir için idrar (Şekil 1) daha yüksek konsantrasyonlarda neden olur. Bizim idrar testi platformdur, hiçbir görüntüleme platformu gereklidir ve tanılama sinyalleri idrarda zenginleştirilmiş.
Bu platform hastalıkları kanser, fibrozis ve tromboz13,14dahil olmak üzere çeşitli algılamak için tasarlanmış. Burada yükselmeler matris metallopeptidaz 9 (MMP9) tespit etmek için nanosensors tasarımını açıklamak bir biyomarker kolorektal kanser olarak faaliyet. Kolorektal kanser kanser ölüm ikinci önde gelen nedenidir bir tahmini 136,800 Yeni olgu ve 2014 yalnız15dakika sonra 50,300 ölümlerini ile Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. Kolorektal tümör hücreleri malign ilerleme, matris bozulması gibi metastaz16sürücü için gösterilen MMP9 üretmek. Ayrıca, biz edebiyat17MMP9 için uygun peptid substrat (PLGVRGK) tespit. Bu platform erken kanser teşhis ve düşük maliyetli bakım noktası tanılama13,14,18,19,20,21için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> Şekil 1: Nanosensor aktivite içinde vivoşematik. Nanosensors vücuda geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve hastalık sitelere yerelleştirilmesine. O zaman, proteaz hastalığı ile ilgili IONPs tarafından sunulan peptid yüzeylerde ayırmak. Renal izni, onları idrarda yerelleştirmek neden i ciddi parçaları boyutunu sağlar. Hayvan idrara sonra bu peptid parçaları kendi muhabir molekül tarafından çözümlenebilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">0.2 &#181;m syringe filters</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">4652</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">18G needle</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89134-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL conicals</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89039-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">250 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Stir bar</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">58949-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hot Plate/Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97042-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:233px;">97064-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Albumin from Bovine Serum (BSA)</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:233px;">A13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">236489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Iron (II) chloride tetrahydrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">44939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Epichlorohydrin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">45340-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">DMF</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ammonium Hydroxide</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">320145-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Hydroxide pellets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">221465-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sodium Borate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">168149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris base</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dextran</td>
			<td style="width:171px;">Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0020 9006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:233px;">UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:171px;">Malvern Panalytical</td>
			<td style="width:233px;">NanoZS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">66130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Dynabeads MyOne Tosylactivated</td>
			<td style="width:171px;">LifeTech</td>
			<td style="width:233px;">65501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">SIA</td>
			<td style="width:171px;">Life Tech</td>
			<td style="width:233px;">22349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PEG 20k</td>
			<td style="width:171px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:233px;">MPEG-SH-20K-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fluorescein Antibody [2A3]</td>
			<td style="width:171px;">GeneTex</td>
			<td style="width:233px;">GTX10257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Hiload 16/600 superdex 200</td>
			<td style="width:171px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:233px;">45-002-490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:171px;">Fisher</td>
			<td style="width:233px;">BTCYT5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD Insulin Syringes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher</td>
			<td style="width:233px;">NC0872854</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanosensors to detect protease activity in vivo for noninvasive diagnostics

Proteaz peptid bağları hidroliz içinde uzmanlaşmak ve homeostasis ve allostasis dahil olmak üzere geniş biyolojik süreçleri kontrol çok fonksiyonlu enzimlerdir. Ayrıca, dysregulated proteaz aktivitesi Patogenez sürücüler ve kanser gibi hastalıkların işlevsel bir biyomarker olduğunu; Bu nedenle, proteaz aktivitesi in vivo algılama yeteneğini Biyomedikal teşhis için klinik olarak ilgili bilgi sağlayabilir. İdrarda ölçülebilir bir sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo için yoklama nanosensors oluşturmak için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu proteaz nanosensors iki bileşenden oluşur: bir nanopartikül ve substrat. Hedef hastalığı sitelere dolaşım yarılanma ömrü ve substrat teslimat artırmak için nanopartikül işlevleri. Belgili tanımlık substrate belirli bir hedef proteaz veya proteaz grubu olmak üzere tasarlanmış bir kısa peptid (6-8 AA), sırasıdır. Belgili tanımlık substrate nanopartikül yüzeye Birleşik ve algılama için floresan bir işaret gibi bir gazeteci tarafından sonlandırıldı. Dysregulated proteaz peptid substrat ayırmak gibi muhabir proteaz aktivitesinin bir biyomarker olarak miktar için idrar içine süzülür. Burada bir nanosensor matriks metalloproteinaz 9 (MMP9), tümör ilerleme ve metastaz, bir fare modeli kolorektal kanseri tespiti ile ilişkili için inşaatı tarif.

IONPs nüfusun çoğunluğu 40-50 nm aralıkları ortalama çapı civarındadır. Pegylation sonra bu boyut aralığı yaklaşık 6 saat13 vivo dolaşımını yarı ömrü vardır (bkz. Şekil 2a). Bir belirli boyut aralığı için seçin istiyorsa, bir boyut dışlama Kromatografi IONP kesirler farklı çaplarda yalıtmak için kullanabilirsiniz. Nano tanecikleri TEM tarafından bireysel küresel demir oksit nano tanecikleri çapraz birlikte dextran dış tabakası tarafından görüntülenir. 13  IONPs bir çözüm yok acele ve hafif kahverengi renkli saydam görünür. Başarılı peptid konjugasyon sonra spektral absorbans analiz floresan muhabiri maksimum uyarma dalga boyu farklı absorbans zirve ortaya çıkaracaktır. FITC söz konusu olduğunda, bu civarında 488 ortalanacaktır nm (bkz. Şekil 2b). Bir tipik peptid konjugasyon tepki bir peptid FPLC arıtma sonra 20-50 IONP molar oranı neden olur. Sonda anlamda proteaz aktivitesi için yeteneğini test etmek için nanosensors bir aliquot rekombinant proteaz ile inkübe ve fluorimetry tarafından izlenir. Bölünme etkinlik nanopartikül - yüzeyi çözüm içine başka türlü homoquenched ve örnek floresans artırmak floresan gazetecilere - sürümde neden olur. Bunun Michaelis-Menten kinetik izleyin bölünme hızları substrat gözlemlemek için tipik (bkz. Şekil 2 c).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig2.jpg"> Resim 2: yapısı ve fonksiyonu Nanosensors içinde vitrodoğrulanıyor. (a) bir IONP nüfus sonrası sentez boyutu dağılımı gösteren A DLS grafiği. (b) absorbans spektrum IONPs sonrası konjugasyon FITC etiketli MMP-9 yüzeyler ile. (c) MMP9 sürekli bir saat boyunca nanosensor tarafından sunulan peptid cleaves gösterilen vitro bölünme tahlil. 0,5 mg/mL bir proteaz konsantrasyon PBS içinde kullanıldı (%1 BSA) arabellek. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57937/57937fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu peron içinde kanser fare modelleri uygulamak için yakın kızılötesi floresan muhabir ile kaplı nanosensors farmakokinetik görselleştirme tarafından bütün hayvan Floresan (Şekil 3a) görüntüleme izin vermek için kullanın normaldir. LS174T Kolorektal tümörler taşıyan farelerde, floresan bir sinyal peptid yüzeylerde nanosensors üzerinde MMP9 bölünme nedeniyle nanosensors, intravenöz yönetimi sonra 60-90 dakika içinde idrar içine yerelleştirmek. Buna karşılık, (bkz. Şekil 3a) kontrol grubu farelerde mesane içinde alt floresan sinyallerini olacak. Bu parçacıklar sonunda monosit ve makrofajlar tarafından retiküloendotelyal sistemi, karaciğer, dalak ve lenf bezleri yaygın olarak bulunan yaşlandırma çünkü karaciğerde gözlenen sinyal doğar olması gerekmektedir. Bu nedenle, Şekil 3a karaciğerde gelen sinyal nano tanecikleri boşluk nedeniyle. 13 immunoprecipitation tarafından idrar floresans miktarının zaman önemli ölçüde yükseltilmiş bir sinyal LS174T tümörler (bkz. Şekil 3b) sağlıklı kontrollere göre taşıyan farelerde gözlenir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig3.jpg"> Resim 3: bir fare modelinde kolorektal kanser tespit. farelerin sitelere IONP lokalizasyonu hastalığı, hem de idrar yerelleştirme tümör ilerlemesi nedeniyle gözlemleyerek tümör ve kontrol grubu, (a) vivo içinde görüntüler. (b) idrar floresans miktar LS174T tümör modelindeki denetim farelerde tümör. Hata çubukları standart sapma çizilen (*p < 0,05 iki-kuyruklu eşleştirilmiş t testi). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57937/57937fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics at JoVE.com

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteaz sıkıca düzenlenmiş temel biyolojik süreçlerin ve dysregulated proteaz aktivitesi sürücüler ilerleme kanser gibi karmaşık hastalıkların katılan enzimlerdir. Bu yöntemin hedef ana bilgisayar idrardan algılanabilir ve hastalık ayrımcılık bir bölünme sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo ölçmek nanosensors oluşturmaktır.

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

nanosensors-to-detect-protease-activity-vivo-for-noninvasive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

16.2K Görüntüleme.  Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine. Proteaz sıkıca düzenlenmiş temel biyolojik süreçlerin ve dysregulated proteaz aktivitesi sürücüler ilerleme kanser gibi karmaşık hastalıkların katılan enzimlerdir. Bu yöntemin hedef ana bilgisayar idrardan algılanabilir ve hastalık ayrımcılık bir bölünme sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo ölçmek nanosensors oluşturmaktır.

Video: Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Biyomühendislik

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A Tam Cilt Hata Modeli Biyomateryallerin vaskülarizasyonunu değerlendirin<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Hastalık Teşhis için Taşınabilir Görüntüleme ve Analiz ile birleştiğinde Manyetik Levitasyonunun

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Katı, sabit ve lekeli, genel olarak, milimetre ölçekli örnekler için bölüm ücretsiz 3D Histoloji mikro bilgisayarlı tomografi tarafından katıştırma

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes have the potential to serve as biomarkers for disease diagnosis and to monitor disease progression and treatment response. However, most exosome analysis procedures require exosome isolation and purification steps, which are usually time-consuming and labor-intensive, and thus of limited utility in clinical settings. This report describes a rapid procedure to analyze specific biomarkers on the outer membrane of exosomes without requiring separate isolation and purification steps. In this method, exosomes are captured on the surface of a slide by exosome-specific antibodies and then hybridized with nanoparticle-conjugated antibody probes specific to a disease. After hybridization, the abundance of the target exosome population is determined by analyzing low-magnification dark-field microscope (LMDFM) images of the bound nanoparticles. This approach can be easily adopted for research and clinical use to analyze membrane-associated exosome biomarkers linked to disease.

Clinical translation of exosome-derived biomarkers for diseased and malignant cells is hindered by the lack of rapid and accurate quantification methods. This report describes the use of low-magnification dark-field microscope images to quantify specific exosome subtypes in small volume serum or plasma samples.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Human Neural Organoids for Studying Brain Cancer and Neurodegenerative Diseases

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models is crucial both to better understand the pathological mechanisms of these diseases and identify new therapeutic targets and strategies. To be pertinent, an in vitro model must reproduce the pathological features of a human disease. However, in the context of neurodegenerative disease, a relevant in vitro model should provide neural cell replacement as a valuable therapeutic opportunity. 
Such a model would not only allow screening of therapeutic molecules but also can be used to optimize neural protocol differentiation [for example, in the context of transplantation in Parkinson's disease (PD)]. This study describes two in vitro protocols of 1) human glioblastoma development within a human neural organoids (NO) and 2) neuron dopaminergic (DA) differentiation generating a three-dimensional (3D) organoid. For this purpose, a well-standardized protocol was established that allows the production of size-calibrated neurospheres derived from human embryonic stem cell (hESC) differentiation. The first model can be used to reveal molecular and cellular events occurring during in glioblastoma development within the neural organoid, while the DA organoid not only represents a suitable source of DA neurons for cell therapy in Parkinson's disease but also can be used for drug testing.

This study introduces and describes protocols to derive two specific human neural organoids&#160;as a relevant and accurate model for studying 1) human glioblastoma development within human neural organoids exclusively in humans and 2) neuron dopaminergic differentiation generating a three-dimensional organoid.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

The lack of relevant in vitro neural models is an important obstacle on medical progress for neuropathologies. Establishment of relevant cellular models ...

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo Eğitim

Viral Nanopartiküller