Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) dan gelen hibe için H-JZ tarafından desteklenmiştir. TMBW Avustralya hükümeti bir Avustralya yüksek lisans Ödülü ve Ann Henderson kontör Burs Avustralya Rotary sağlık bir alıcı Templestowe Rotary ve Dine tedavi için ortak olduğunu.

Tüm hayvan deneyleri Melbourne hayvan Etik Komitesi üniversite tarafından kabul edildi.
Not: PReklam-CMV-Td-Tomadenoviral için sıra, inşaat ve üretimi iletişim kuralı vektörler, pReklam-CMV-GFP ve pReklam-SIÇ12- Luc/Td-Tom yukarıda açıklanan11,12olmuştur, 13. Piyasada bulunan tüm vektörleridir.
1. virüs titresi belirlenmesi % 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID50) kullanma
<ol><li>1 x 106 DMEM + % 10 FBS medya 10 mL HEK293A hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon, 100 µL 96-şey düz-alt hücre kültür plaka her kuyuya tohum.</li>
	<li>1 mL 1: 100 seyreltme tam orta virüs stokunun hazırlayın. 11 µL seyreltilmiş şunun sütun 1 her şey için ekleyin.</li>
	<li>Seri 10 kat dilutions doğrudan 96 iyi tabak içinde seyreltilmiş şunun 11 µL hücre süspansiyon 100 µL ile 1 son bir seyreltme kadar karıştırılarak gerçekleştirmek12 ulaşıldığında x10. Yapışık olmayan hücreleri olmasına rağmen bu aşamada kuyular arasında transfer hücre sayısı sabit kalır.</li>
	<li>10 en yüksek seyreltme ile başlayan her sütuna her seyreltme 11 µL pipet4. Pipet ipuçları dörtlü viral parçacıkların sınırlamak için her seyreltme ile değiştirin.</li>
	<li>Virüs tam ortam 11 µL sütununu 12 negatif bir denetim ekleyin.</li>
	<li>7-10 gün 37 ° c % 10 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Bir mikroskop kullanarak, her sütunda cytopathic ya da sitotoksik efekt belirtileri wells sayısı puanı. Herhangi bir enfeksiyon belirtisi varsa iyi bir pozitif düşünün.</li>
	<li>Reed ve Muench (1938) istatistiksel yöntem14kullanarak her seyreltme için olumlu wells kısmını hesaplayın.</li>
	<li>Orantılı uzaklığı (PD) kullanarak hesaplama: (A-50)/(A-B), nereye A yüzde yanıt yukarıdaki veya % 50 eşit ve B % 50'in altında yüzde yanıttır.</li>
	<li>50 TCID kullanarak hesaplama: 10X-PDX seyreltme nerede, % 50'den büyük bir yanıt veriyor.</li>
	<li>Aşağıdakileri kullanarak viral titresi hesaplamak: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. adenovirus MOI belirlenmesi
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplamda 6 kuyu).</li>
	<li>Birimler gerekli 0, 250, 500, 2500 için Reklam-CMV-Td-Tom stok ve 5000 MOI formülü kullanarak hesaplar: MOI = (birim [μL] PFU/μL x) / hücre sayısı. 1 x 1010 (PFU/mL), virüs enfeksiyonu hacimleri titresi ile Reklam-CMV-Td-Tom için gerekli MOIs 0, 3,75, 7.5, 37.5 ve 75 μL sırasıyla vardır.</li>
	<li>Bölüm 2,2 Reklam-CMV-Td-Tom hesaplanan miktarda hücrelerle doğrudan viral stok ayrıntılı karıştırma ile kuyu içine pipetting tarafından bulaştırmak.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Kuyulardan medyayı çıkarın ve hücrelerin % 10 formalin 5 min için 500 μL ile sorunu hemen.</li>
	<li>Formalin kuyulardan Aspire edin ve PBS 500 μL Wells'le bir kez yıkayın.</li>
	<li>Hücre çekirdeği Höchst çözüm 5 min için 500 μL ile leke.</li>
	<li>Höchst çözümü kaldırmak ve wells PBS 3 kez 500 μL ile yıkayın.</li>
	<li>Görüntü 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak Td-domates protein ve hücre çekirdeği sinyal. TD-domates protein 554, heyecanlandırmak nm ve Höchst boya 352, nm.</li>
	<li>MOI Td-domates%15100 enfeksiyon için gerekli çalışma belirlemek için ImageJ kullanarak görüntüleri analiz.</li>
</ol>3. çift-adenovirus iletim canlı tek kişilik hücrelerde
<ol><li>Tohum 1.0-1.5 x 500 μL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 12 de plaka içeren medya (% 35 hücre confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-CMV-GFP 75 μL içeren hücreleri enfekte (titresi = 5 x 109 PFU/mL) ve Ad-SIÇ12-Td-Tom 7.5 μL (titresi = 5 x 1010 PFU/mL) % 100 enfeksiyon pozitif elde edebilirsiniz bir 2500 MOI elde etmek için.</li>
	<li>Hücreleri veya TGF-β 0,25 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) ücret olmadan hemen sonra adenovirus enfeksiyonu tedavi.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü faz kontrast floresans mikroskobu ile canlı hücreler. 470 nm ve Td-domates protein 554, GFP heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>Hücreleri tamir ve adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi hücre çekirdeği leke.</li>
	<li>Görüntü Td-domates protein ve Höchst floresan mikroskop kullanarak leke. Höchst boya 352, heyecanlandırmak nm.</li>
	<li>ImageJ kullanarak, GFP ve Td-domates pozitif yüzdesi15hücreleri hesaplama.</li>
</ol>4. canlı tek hücre sinyallemesi olarak tahlil yaranın
<ol><li>Tohum 4-5 x 1 mL 105 MDA-MB-231 hücrelerle DMEM kültür %5 FBS her iyi bir 6 de plaka içeren medya (% 50 cep confluency, toplam 2 kuyu).</li>
	<li>Reklam-SIÇ12-Td-Tom 22.5 μL hücrelerle bulaştırmak (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>İki çapraz çizgiler P200 pipet ucu kullanarak her şey hücre tabakası kaşı.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırın ve FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.5 μL iyi (10 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 5 ng/μL) başına 2 mL taze %5 ile değiştirin.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 5 min için plaka yerleştirin ve 100 X büyütme bir faz kontrast mikroskop kullanarak seçili yara alanlarda görüntüleri al.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Daha önce aynı alanları olarak yara kapatma görüntülerini atın.</li>
	<li>Hücreleri tamir, hücre çekirdeği adımları 1,6 - 1,9 açıklandığı gibi leke ve Td-domates sinyal yara alan ve sigara-yara alan 200 X büyütme bir floresan mikroskop kullanarak görselleştirmek.</li>
	<li>Td-domates pozitif hücrelerinin yüzdesi, yara ve sigara-yara alan ImageJ yazılım15kullanarak ölçmek.</li>
</ol>5. Vitro Luciferase tahlil
<ol><li>3-5 x 1 mL % 5 içeren DMEM medya 104 MDA-MB-231 hücrelerde hücre süspansiyon hazırlamak FBS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 2.5 μL ile enfekte Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =).</li>
	<li>Tohum 96 içine enfekte hücreleri de 3.000 hücreler/100 µL/kuyuda plaka.</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Eski medya kuyulardan kaldırmak ve taze %5 FBS medya ile ya da ezelî TGF-β 0.1 μL iyi (1 mg/mL hisse senedi, son konsantrasyonu olarak 1 ng/μL) başına 100 µL yerine ve iyi (hisse senedi 7 mg/mL başına inhibitörü TGF-β, 0,17 μL olup Son konsantrasyonu olarak 12 ng/μL) (yayımlanmamış bir roman TGF-β ligand tuzak protein, Chen ve ark., iş).</li>
	<li>% 10 CO2 37 ° C'de kuluçka 24 h için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Luciferase tahlil sistem yüzey çözülme ve 1 x hücre kültür lizis reaktif Çift Kişilik distile su (DDW) hazırlayın.</li>
	<li>96 kuyulardan medyayı çıkarın ve 1 x hücre kültür lizis arabelleği için 30 dk nazik ajitasyon ile bir orbital çalkalayıcı kullanarak buz üzerinde 50 μL Wells'le parçalayıcı.</li>
	<li>Lysate, 30 μL her kuyudan bir opak luciferase plaka aktarmak ve oda sıcaklığında sıcak plaka izin.</li>
	<li>Luminometer yazılım, yeni bir iletişim kuralı oluşturun. Ölçümleri ile 1 enjektör için önce ve sonra enjeksiyon seçin. Ayarla ölçümleri enjeksiyon önce 1 için ölçüm gecikme ve Entegrasyon zamans. Enjeksiyon ölçüm sonra ayarlamak Enjeksiyon birim için bir ölçüm gecikme 1 40 µL enjeksiyon ve 5 sonra s s Entegrasyon zaman. Tamamseçerek ayarları onaylayın.</li>
	<li>Enjektör tüp DDW yerleştirin ve enjektör tüp kullanmadan önce temizlemek için Prime ayarları altında enjektör 1 düğmesini tıklatın. Sonraki enjektör boru DDW ve iki daha fazla asal tüm çözüm tüm tüpünden temizlemek için 1 enjektör, ardından hava yerde kaldırın. Enjektör tüp Firefly substrat ve yine iki kere belgili tanımlık substrate hazırlamak için Prime içine yerleştirin.</li>
	<li>Opak luciferase plaka örnekleri ile luminometer yerleştirin ve yazılım seçenekleri belirleyin. Faiz kuyu vurgulayın ve Uygula' yı tıklatın. Luciferase sinyal ölçmek için Başlat tuşuna basın.</li>
	<li>Ölçümler tamamlandıktan sonra kaldırma ve plaka su ile durulayın. Kalan herhangi bir yüzey enjektör tüpün içine hava ve Prime enjektör 1 firefly substrat tüp içine geri içine tüp yerleştirerek yeniden elde etmek. Enjektör tüp DDW yerleştirin ve kalan herhangi bir yüzey enjektör tüp temizlemek için iki daha fazla asal gerçekleştirmek.</li>
</ol>6. hücre hazırlık için canlı sinyal görüntüleme Vivo içinde
<ol><li>48 tümör İmplantasyondan önce s 175 cm2 şişeler (Toplam 10 şişe) içine 2-3 x 106 MDA-MB-231 hücre tohum. Kültür DMEM medya % 5 içeren 20 mL hücrelerde FBS 37 ° c, % 10 CO2.</li>
	<li>24 saat sonra 300 μL eklemek Ad-SIÇ12- Luc (titresi 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500 =) her şişeyi içine. Hücre kültürü için başka bir 24 saat tutun.</li>
	<li>İmplantasyon günü, eski medyayı çıkarın ve adenovirus enfekte hücreleri kez PBS, pH 7.4 20 mL ile yıkayın. 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA balonun ekleyin ve biraz tripsin tüm şişeyi yüzey kapsayacak şekilde izin vermek için şişeyi sallayın. 37 ° C, % 10 CO2 3 dk için kuluçka için şişeye koyun.</li>
	<li>Tripsin FBS içeren DMEM medya 8 mL şişe ekleyerek gidermek. Tüm hücre süspansiyonlar cam reaktif şişe aktarın.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak hücre saymak ve 4.8 x 107 hücrelerde iki 50 ml santrifüj tüpleri aktarın.</li>
	<li>Senaryo Özeti 400 x g tripsin kaldırmak ve 720 mL taze FBS-DMEM medya hücrelerde resuspend RT, 5 min için santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlar steril 5 mL tüp içine nakletmek ve 160 μL eklemek Matrigel (% 10 toplam matrigel süspansiyon).</li>
	<li>Hücreler buz implantasyon kadar tutmak.</li>
</ol>7. Orthotopic implantasyon
<ol><li>12 SCID fareler tartmak ve rastgele fare kontrol ve tedavi gruplara (6 fare/grup) ayırır.</li>
	<li>İmplantasyon bir steril biyo-steril bir ortam sağlamak için kabine içinde gerçekleştirin. 1 L/dak yeri bir ısı yastık üzerinde fareyi bir oksijen akış hızı % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak fare uyuşturan ve kornea zarar görmemesi için her iki gözde üzerine göz merhem yağlama bir damla dağıtmak. Burun burun konisi yerleştirerek anestezi korumak için isoflurane bağlıyken ısı pad fare sırtüstü pozisyonda düzeltmek.</li>
	<li>Anestezi başarısı çimdik tırnağa tepki eksikliği onaylayın. İdame dozu implantasyon hatırlatılması için 1 L/dak oksijen ile % 1.5-2.5 için İsoflurane azaltın.</li>
	<li>Dördüncü meme iki cilde orta hat % 80 etanol batırılmış pamuk bez kullanarak temizleyin.</li>
	<li>4th meme yağ yastığı palpasyonla aracılığıyla bulmak ve daha fazla doku ortaya çıkarmak için yağ yastığı sıkmak.</li>
	<li>Hücre süspansiyon de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. Yavaşça hücre karışımdan 50 µL 27 G insülin enjektör Aspire edin ve her iki fare meme yağ yastığı içine enjekte.</li>
	<li>Başarılı bir enjeksiyon yağ yastığı şişlik için duygu tarafından onaylayın. Yağ yastığı hafifçe yayın ve fare kafesin içine yerleştirin.</li>
	<li>Kafesleri ısı panelindeki fareler bilinç kazanmak ve sonra 3 gün boyunca holding odanın kafesleri yerleştirmek izin vermek en az 30 dk için bırakın.</li>
</ol>8. IVIS görüntüleme
<ol><li>Görüntü yaşayan yazılımını açın.</li>
	<li>IVIS Sistem Denetim Masası IVIS sistem başlatma butonuna basarak başlatın. Sıcaklık işareti yeşile kadar bekleyin.</li>
	<li>Luminescent görüntüleme modunu kontrol panelinde seçin.</li>
	<li>İsoflurane anestezi odası ve IVIS sistemi açın.</li>
	<li>Fareler 1 L/dak oksijen ile % 2.5-4.5 isoflurane kullanarak uyuşturan. Bir kez anaesthetized, isoflurane 1,5-%2,5 bakım için ayarlamak. 150 mg/kg vücut ağırlığı ile D-biyoluminesans mayi (IP) enjeksiyonu ile fareler enjekte.</li>
	<li>Hemen fareler IVIS sisteme aktarmak, ısı kontrollü görüntüleme platformu koyup ve onların burun burun konisi içine yerleştirin.</li>
	<li>Denetim Masası Sıra Kur düğmesini tıklatın ve Orta Binningseçin.</li>
	<li>Görüntüleme çekim hızı kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s ve 120 başlangıç yaklaşık 3 dakika sonra biyoluminesans enjeksiyon görüntüleme s. ve sinyal düşmeye başlayıncaya kadar görüntü devam (normalde bu yaklaşık 20 dakika sürer).</li>
	<li>Fareler isoflurane anestezi burun konisi ile korunarak IVIS kaldırın ve fare ile 50 µL PBS ya da 50 µL TGF-β sinyal inhibitörü (50 μg/tümör) içi tümör enjeksiyon yolu ile tedavi.</li>
	<li>Fareler geri koyarlar ve ısı yastık en az 30 dk için açık bırakırım. Sonra kafes geri tutarak Odaya yerleştirin.</li>
	<li>IVIS tedavi ertesi günü açıklanan yordamı Imaging yineleyin.</li>
</ol>9. veri analizi
<ol><li>Açık dosyaları içinde Yaşayan görüntü yazılım kaydedilir.</li>
	<li>Görünümü ' nü kullanarak görüntü bilgileri bulmak | Görüntü bilgileri.</li>
	<li>Aynı çekim hızı ile benzer bir zaman noktasında çekilen fotoğrafları seçin. Fotoğrafları bir grup olarak yükleyin.</li>
	<li>Yoğunluğu normalleştirmek için Görüntü ayarı içinde bireysel kutunun işaretini kaldırın.</li>
	<li>Yoğunluk analiz için foton modu seçeneğini belirleyin. Yatırım getirisi araçları' nda Faiz bölge (ROI) düğmesini seçerek sinyalin yoğunluğunu ölçmek.</li>
	<li>Yatırım getirisi daire kollarındaki sinyal içeren bölgesine sürükleyin ve sinyal yoğunluğu elde etmek için ölçü birimi düğmesini tıklatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation.">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+in+context.">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li><li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease.">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li><li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling.">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+Cancer.">TGF&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+live+cell+TGF-beta+signaling+imaging:+breast+cancer+cell+motility+and+migration+is+driven+by+sub-populations+of+cells+with+dynamic+TGF-beta-Smad3+activity.">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50 (2015).</li><li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling.">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+of+Estimating+Fifty+Per+Cent+Endpoints.">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity.">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li><li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines.">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4, 43-63 (2017).</li><li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies.">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li><li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+adenoviral+vector:+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase.">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li><li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+adenovirus+vectors.">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li><li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue.">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li><li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR.">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li><li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+vaccine+applications.">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li><li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism.">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li><li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins.">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li><li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları rapor.

Biz tek canlı hücreler TGF-β/Smad3 sinyal, gerçek zamanlı görüntüleme için izin vermek için bir teknik geliştirdi. Roman bu yöntemi kullanarak, biz daha önce hücre alt nüfus gelişmiş işgali ve geçiş8ile ilişkili dinamik TGF-β/Smad3 transkripsiyon aktivite ile belirledik. Bu yöntem TGF-β, Smad3 fosforilasyon Batı lekesi gibi sinyal için geleneksel deneyleri geliştirir ve TGF-β heterojenite yakalayarak gen ekspresyonu, hedef, TGF-β/Smad3 tümör nüfus içinde sinyal ve ...

Transforming büyüme faktörü β (TGF-β) olduğunu bir heterodimeric tip II oluşan karmaşık sinyaller insan gelişiminde karıştığı bir temel sitokin ve reseptörleri1yazın. Bağlama II reseptör yazın sonuçları işe alım ve fosforilasyon türü ben sırayla aşağı akım Smad2/3 proteinler2,3phosphorylates reseptör. Bunlar Smad4, Smad2/3 proteinler bağlama çekirdeği translocates ve Gen transkripsiyonu4düzenleyen bir kompleksi oluşturan aktif. Homeostatik koşullarda TGF-β/Smad sinyal sıkı bir şekilde düzenlenmiştir; Ancak, birçok hastalığın, sinyal yolu kuralsız ve genellikle ilerleme hastalık5,6,7' nin önde gelen overexpressed. Son yıllarda yapılan çalışmalarda altgrupları TGF-β/Smad etkin hücre bir saat-bağımlı bir şekilde8,9biyolojik işlev sorumludur ve TGF-β hücresel yanıt hànzú gösterdi. TGF-β/Smad sinyal yaygın hücresel Analizi hücresel hareketlilik sadece bir görüntüsünü sağlayan ve ortalama TGF-β/Smad etkisi10kez quantitate sabit bitiş noktası deneyleri kullanımını gerektirir. Bu yöntemler, ancak, doğru bir şekilde TGF-β/Smad fizyolojik durumda hastalık ilerlemesi sırasında sinyal moleküler davranışları temsil etmeyebilir. Yansıma tabanlı canlı hücreleri yakalama bir kayma ve zamansal anlayış ile hücresel ve biyolojik süreçlerin dinamiği analizi.
Amacımız TGF-β/Smad adenovirus tabanlı reaktifler kullanarak sinyal canlı hücre görüntüleme için hassas bir yüksek-den geçerek yöntemi geliştirmekti. Burada, bir adenovirus Smad3 SIÇ motifi bağlama sırası ve bir luciferase (Luc) veya Td-domates (Td-Tom) muhabir gen ifade insan meme kanseri hücre satırında MDA-MB-231 bulaşmış. Adenoviral muhabir sistemleri % 100 enfeksiyon oranını kanser hücre hatlarında sonuçlanabilir plazmid giriş için hızlı ve ucuz bir yöntem sağlar. Adenoviral muhabir sistemleri de başarıyla geleneksel plazmid11ile transfect zor olan hücre hatları için uygulanmış. Bu protokol için tekrarlanabilir ve noninvaziv bir süreç canlı hücre görüntüleme TGFβ/Smad sinyal yolu elde etmek için anlatacağız içinde in vitrove in vivo .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>1881024</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Scientifix Life</td>
			<td>FBS500-S</td>
			<td>Heat inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#946;1</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>100-21</td>
			<td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>5117</td>
			<td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &#956;L/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Reporter Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>197897</td>
			<td>Dilute 5x in PBS before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9100-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast fluorescence microscopy</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoGl Luciferin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E153A</td>
			<td>Dilute to 1x in DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R70507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRM-HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRKDC-SCID</td>
			<td>Animal Resources Centre</td>
			<td>SCIDF6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chem-supply</td>
			<td>EA043-10L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Night Time</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>1750D</td>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS-DMEM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5% heat inactivated FBS; 10 &#956;g/mL penicillin; 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

Büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştüren hücresel homeostazı için gerekli birçok önemli işlevleri düzenleyen ve yaygın kanser de dahil olmak üzere birçok hastalıklarda overexpressed bulunur. TGF-β şiddetle geç sahne kanseri ilerleme sırasında metastaz göçmen ve invaziv tümör hücre alt grubunu aktive karıştığı. Sinyal yolu analiz için geçerli yöntemleri kez sinyal post-hoc biyolojik olay ölçmek girişimi ve hastalık ilerici doğası yansıtmamaktadır bitiş noktası modellerde odaklanmak. Burada, canlı hücrelerde transkripsiyon harekete geçirmek algılayabilir TGF-β/Smad3 sinyal yolu için belirli bir roman adenovirus muhabir sistemi göstermektedir. Bir Reklam-SIÇ12-Td-Tom muhabir kullanmak, MDA-MB-231 hücre içinde 24 saat içinde in vitrobir % 100 enfeksiyon hızı elde edebilirsiniz. Floresan muhabir canlı tek hücre içinde görüntüleme için kullanılmasına doğrudan kimlik transcriptionally etkin hücre ile gerçek zamanlı. TGF-β ile enfekte hücreleri uyarılması yalnızca bir alt kümesini transcriptionally aktif ve belirli Biyolojik işlevleri dahil olan hücreleri görüntüler. TGF-β sinyal vitroiçin ilgili biyolojik fonksiyonlar anlayışı geliştirmek için yüksek özgüllük ve bir tek hücre düzeyinde duyarlılık için bu yaklaşım sağlar. Transkripsiyon etkinliği de olabilir Smad3 bildirilen in vivo olarak uygulanması yoluyla gerçek zamanlı bir Ad-SIÇ12- Luc muhabir. Reklam-SIÇ12- Luc ve geleneksel stabil transfected luciferase hücre hatları ile aynı şekilde ölçülebilir. İmplante hücreleri içinde vivo Smad3 transkripsiyon faaliyet geleneksel IVIS görüntüleme ile analiz ve canlı tümör ilerleme, TGF-β sinyal yolu dinamikleri içine benzersiz fikir veren sırasında izlenen. Canlı hücre sinyal yolları hızlı yüksek üretilen iş görüntüleme için izin veren bir avantajlı gazeteci dağıtım sistemi bizim protokolünü açıklar vitro ve içinde vivo. Bu yöntem bir dizi görüntü dayalı deneyleri ve temel biyoloji ve terapötik geliştirme için hassas ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak hediye için genişletilebilir.

Vitro Imaging tek hücreli canlı
TGF-β/Smad dayalı adenovirus reaktifler kullanarak tek kişilik hücrelerde sinyal aktif doğru değerlendirmek için ilk en iyi çokluğu, enfeksiyon (MOI) her hücre satırı için belirlemek önemlidir. %100 hücre mevcut hiçbir cytopathic veya sitotoksik etkisi ile adenoviral enfeksiyon için pozitif olduğunda en iyi MOI belirlenir. Bunu belirlemek için biz pozitif enfeksiyon bir ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of the TGF-	ÃŽÂ²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System at JoVE.com

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Hücre görüntüleme TGF-β/Smad3 sinyal yolu Vitro ve Adenovirus muhabir sistemiyle Vivo içinde yaşamak

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K Görüntüleme.  University of Melbourne. Burada, TGF-β/Smad3 sinyal faaliyet bir adenovirus muhabir sistemi kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu sistem gerçek zamanlı olarak transkripsiyon etkinlikleri izler ve her iki tek hücreleri vitro ve canlı hayvan uygulanabilirmodelleri.

Video: Live Cell Imaging of the TGF-	β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Kanser Araştırmaları

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis remains incomplete. In vivo models are paramount for metastasis research, but require refinement. Tracking spontaneous metastasis by non-invasive in vivo imaging is now possible, but remains challenging as it requires long-time observation and high sensitivity. We describe a longitudinal combined radionuclide and fluorescence whole-body in vivo imaging approach for tracking tumor progression and spontaneous metastasis. This reporter gene methodology employs the sodium iodide symporter (NIS) fused to a fluorescent protein (FP). Cancer cells are engineered to stably express NIS-FP followed by selection based on fluorescence-activated cell sorting. Corresponding tumor models are established in mice. NIS-FP expressing cancer cells are tracked non-invasively in vivo at the whole-body level by positron emission tomography (PET) using the NIS radiotracer [18F]BF4-. PET is currently the most sensitive in vivo imaging technology available at this scale and enables reliable and absolute quantification. Current methods either rely on large cohorts of animals that are euthanized for metastasis assessment at varying time points, or rely on barely quantifiable 2D imaging. The advantages of the described method are: (i) highly sensitive non-invasive in vivo 3D PET imaging and quantification, (ii) automated PET tracer production, (iii) a significant reduction in required animal numbers due to repeat imaging options, (iv) the acquisition of paired data from subsequent imaging sessions providing better statistical data, and (v) the intrinsic option for ex vivo confirmation of cancer cells in tissues by fluorescence microscopy or cytometry. In this protocol, we describe all steps required for routine NIS-FP-afforded non-invasive in vivo cancer cell tracking using PET/CT and ex vivo confirmation of in vivo results. This protocol has applications beyond cancer research whenever in vivo localization, expansion and long-time monitoring of a cell population is of interest.

We describe a protocol for preclinical in vivo tracking of cancer metastasis. It is based on a radionuclide-fluorescence reporter combining the sodium iodide symporter, detected by non-invasive [18F]tetrafluoroborate-PET, and a fluorescent protein for streamlined ex vivo confirmation. The method is applicable for preclinical in vivo cell tracking beyond tumor biology.

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical challenges, it remains difficult to assess the activity of this signaling pathway and interpret it within a biological context. The existing literature on large tumor suppressor (LATS) relies on methods that are qualitative and cannot easily be scaled-up for screening. Recently, we have developed a bioluminescence-based biosensor to monitor the kinase activity of LATS-a core component of the Hippo kinase cascade. Here, we describe procedures for how this LATS biosensor (LATS-BS) can be used to characterize Hippo pathway regulators. First, we provide a detailed protocol for investigating the effect of an overexpressed protein candidate (e.g., VEGFR2) on LATS activity using the LATS-BS. Then, we show how the LATS-BS can be used for a small-scale kinase inhibitor screen. This protocol can feasibly be scaled-up to perform larger screens, which undoubtedly will identify novel regulators of the Hippo pathway.

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Here we present a luciferase-based biosensor to quantify the kinase activity of large tumor suppressor (LATS)-a central kinase in the Hippo signaling pathway. This biosensor has diverse applications in basic and translational research aimed at investigating Hippo pathway regulators in vitro and in vivo.

Hippo Luciferase tabanlı büyük tümör baskılayıcı (Latı) biyoalgılayıcı kullanarak yolu etkinliğini sinyal izleme

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.