Bu proje NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 ve bölümü Klinik Bilimler yayma fon tarafından desteklenmiştir

Bu deneyler için tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kültür için hazırlık
Not: Tüm reaktifler Malzemeler tablolistelenir. Belirli büyüme faktörü konsantrasyonları Tablo 1' de listelenmiştir.
<ol><li>0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltilerine saf deiyonize su (GKD2O) hazırlayın. Yeterince mix ve pH 7.4 NaOH ve/veya HCl çözümleri kullanarak için ayarlayın. Not: EDTA hisse senedi çözüm kadar her deneme önce taze olun.</li>
	<li>Ayrılma reaktif #1 (DR #1) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer buza: birleştirin fosfat tamponlu serum Ca2 + ve Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X antibiyotik Antimycotic çözüm (Anti-Anti) Penisilin, streptomisin ve amfoterisin b içeren Not: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin.</li>
	<li>Ayrılma reaktif #2 (DR #2) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer bir 37 ° C su banyosunda: birleştirmek PBS Ca2 + ve Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X Anti-Anti. Not: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bağırsak epitel kök hücre (IESC) ortam hazırlamak: Mix 25 mL 1 X N2 ek ile DMEM/F12 Orta İleri, 1 X B-27 ek, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax ve 1 X Anti-Anti. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi düşük büyüme faktörü membran matris (matrix) ve tamamlayıcı büyüme faktörleri ana karışımı hazırlar: matris buz çözme. Bir microcentrifuge tüp 100 ng/mL eklemek rekombinant insan kafa, 500 ng/mL rekombinant insan R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL rekombinant insan Wnt3a, 10 mM nikotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 ve 2.5 µM glikojen sentaz 3 kinaz inhibitörü (GSK3i, CHIR99021). Matrix çözdürülen (ana mix yapma) büyüme faktörü karışımı ile ek ve buz üzerinde depolamak. Not: Bu kaplama sırasında artifakı içinde matris patty yaratacak gibi hava kabarcıkları tanıtımı önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>24-iyi doku kültürü çanak hücre izolasyon yordamları başlatmadan önce 37 ° C kuluçka önceden ısıtmak.</li>
</ol>2. cerrahi modeli iskemi ve doku Takibi
<ol><li>Kullanım sekiz on haftalık Yorkshire için (önerilen) her iki cinsiyetten domuzlar olacak. Ameliyat öncesi tüm yem 16-18 h kaldırın. Domuzlar her zaman su erişimine izin verir.</li>
	<li>Varmak için domuz zamanlamak en az 48 saat önce deneyler için çevre calıştıkları izin vermek için. Not: eğitimli veteriner ve/veya Laboratuvar teknisyenleri lisanslı bir veteriner tarafından denetimli rutin hayvan bakımı ve anestezik yordamları ile ilgili yardım sağlar.</li>
	<li>Xylazine domuzla premedicate (1.5 mg/kg intramüsküler (IM)) ve ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. Sonra kullanan kişi, domuz orotracheally tüp takacağım.</li>
	<li>%100 O2 ötenazi zamana kadar buharlaşmış isoflurane (% 2-5) ile genel anestezi altında domuz korumak.</li>
	<li>Bir intravenöz (IV) kateter (önerilen kulak ven) yerleştirin ve bir yedek sıvı lactated ringers çözüm 15 mL/kg bakım oranında gibi yönetmek/s.</li>
	<li>Rutin Nabız oksimetri, elektrokardiyografi ve dolaylı tansiyon ölçümleri15de dahil olmak üzere izleme anestezik gerçekleştirin. Domuzun solunum hızı ve çaba izlemek ve el ile veya bitiş tidal CO2 55-60 mmHg üzerinde çıkarsa gerektiği gibi mekanik havalandırın. Not: Uygun anestezi kalp hızı (aralığı 80-130 atım/dk), non-invaziv kan basıncı (ortalama arter basıncı 75-100 mmHg) ve solunum hızı (10-25 nefes/dak)16ve periyodik kontrol eğilimlerin sürekli izleyerek doğrulanır çene ve anal sesi olmaması için. Anestezi derinliği derecede kas gevşemesi ve kas fasciculation cerrahi uyarıcı takip tarafından değerlendirilecektir olabilir. Oküler reflekslere genellikle hiçbir değeri16tane vardır. Analjezi kurumlar IACUC ilkesi tarafından belirtilen şekilde sağlanabilir. Bu durumda, buprenorfin gibi bir opioid ameliyat sırasında yönetilebilir.</li>
	<li>Domuz ısıtma yastığını yerleştirin ve dorsal recumbency cerrahi işlem için dizginlemek.</li>
	<li>Ventral karın tıraş ve cerrahi scrub (klorheksidin çözüm) ve izopropil alkol kullanarak hazırlayın.</li>
	<li>Karın erişmek için göbeğini merkezli bir neşter bıçak kullanarak bir 8-10-cm ventral ensizyon olun.</li>
	<li>İnce bağırsak (değişir) yaklaşık 40 cm oral ileocecal kavşağı için tanımlayın. Çepeçevre bağırsak iki kez birleştirilmesi (ligasyon) tarafından 10 cm uzun döngüler değişir betimlemek, sonraki oluşturmadan önce her bağ arasında bir cm 10 cm (Şekil 1) sözlü olarak bulunan döngüler.</li>
	<li>Her zaman noktası iskemi iki döngü her diğer, iskemi diğeri iskemi için bitişik reperfüzyon bir ek 1 h ile isterseniz oluşturun. Tam iskemi (damar veya damarlar akımı) oluşturmak için kelepçe veya mezenterik damarlara bulldog vasküler kelepçeler, eğri Halstead sivrisinek hemostats veya 2-0 absorbe olmayan ipek 1, 2, 3 ve 4 h için kullanarak ligate ve kelepçeler 1 h için Kaldır reperfüzyon, isterseniz. Not: Yazarlar iskemi tüm döngüler ile 4 h iskemik döngü başlayarak sırayla oluşturulur ve proksimale (Toplam ameliyat süresini en aza indirmek için) taşıma ilerledi. İskemik barsak segmentleri komşu bitişik döngüler zarar verebilir olasılığını adrese, iskemik döngüler sırasını farklı olabilir. Bu toplam cerrahi zaman değiştirebilir. Not: Reperfüzyon zaman dilimi faiz ya da terapiler reperfüzyon dönemde test istiyorsanız araştırma sorusu dayalı çeşitli olabilir. Ancak, doku hasarı süreleri iskemi yalnız artan daha ağır hale geldikçe, reperfüzyon hasarı olasılığı daha fazla epitelyal yaralanma için katkı sağlamamaktadır. Reperfüzyon büyük olasılıkla iskemik yaralanma hafif dönemleri takip bir rol oynuyor.</li>
	<li>İskemi zaman puan arasında karın veya kapalı steril bir havlu ve/veya bir havlu kelepçe kullanarak kapalı tutun. Not: Bu deneme için tek bir hayvan içinde sekiz iskemik kesimleri oluşturulabilir. Bir ek jejunal segment, en az 5-10 cm bir iç normal denetimi olarak hizmet verecek son iskemik döngü, proksimal tanımlayın.</li>
	<li>Yaklaşık üç mezenterik gemi her bulldog damar kıskacı veya eğri Halstead sivrisinek hemostat engel. Çünkü damarları kolayca travma hemostat uygulama sırasında özen göstermelidir. Kelepçeler jaws içinde gemiler yığmak deneyin.</li>
	<li>Deney, Fentobarbital 85-100 mg/kg IV ile aşağıdaki ötenazi sonunda ölüm yok auscultated kalp atışı ve Korneal refleks kaybı ile onaylandıktan sonra metzenbaum makas, kullanarak doku tüm döngüler toplamak. Denetim biteviye-in normal değişir en az 5 - 10 cm son iskemik döngü için proksimal toplayarak başlatın.</li>
	<li>Ayrı ve döngüler her yaralanma zaman noktasından crypt yalıtım için hazır kadar buz gibi PBS küçük kaplarda saklayın. Not: arzu edilirse olun iskemik yeterince Histoloji ve bağırsak kök hücre kültür ayrı örnekleri bölmek için döngüler; Ancak, yazarlar döngüler yaklaşık 10 cm uzunluğunda büyük hemorajik olmak büyük olasılıkla olduğunu bulmuşlardır.</li>
</ol>3. yeraltı türbesi (kök hücre) izolasyon iskemik ve denetim döngüler
<ol><li>İnce bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için bir 20'lik tel ve doku forseps kullanarak her döngü tersine çevirin. Üst ve alt kısımlarında döngü için güvenli bir şekilde tel dikiş (2-0 absorbe olmayan ipek veya eşdeğeri) kullanarak bağlayın.</li>
	<li>İnversiyon, her döngü buz soğuk PBS luminal enkaz kaldırmak için durulayın.</li>
	<li>Örnekleri hemen DR #1 30 dakika buzda içeren 50 mL konik tüpler içine koyun.</li>
	<li>Denetim ile başlayan döngüler toplamak ve süreleri iskemi artırılan döngüler ile izleyin. Döngüler daha az hasarlı doku (yani kontrol ve 1 h iskemik doku) dan zorla, en iyi sonuç için kol dayama sarsılmış. Ağır hasarlı doku (3 ve 4 h iskemi) dokulardan yavaşça sarsan veya sadece çok fazla sallayarak crypt bozulma ve ek doku imha neden olur gibi ters gerekir. Tüpler sarsıldı veya buz ise her 5 dk ters.</li>
	<li>Örnekleri 10 min 37 ° C su banyosu için DR #2 aktarın. Sallamak ya da tüpler her 5 dk ters çevir.</li>
	<li>Dokular aktardıktan sonra DR #1 süpernatant EDTA kaldırmak için 2-4 h hasarlı döngüler içeren konik tüpler (5 min için 200 x g) santrifüj kapasitesi. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının zaten ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin.</li>
	<li>Örnekleri DR #2 kaldırın ve doku örnekleri doğrudan 25 mL soğuk PBS buz (etiket yıkama #1 olarak) yerleştirin. Örnekleri 60 rpm'de buzda bir orbital çalkalayıcı yerleştirin. Devam sallamak veya her tüpün 30 için ters çevir'i s her 2-5 dak.</li>
	<li>2-4 h dan içeren DR #2 Konik tüpler dokular, spin aktardıktan sonra EDTA süpernatant (5 min için 200 x g) kaldırmak için döngüler zarar görmüş. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin.</li>
	<li>Yıkama # 1 (veya DR) 50 µL aliquot kaldırma crypt ayrışma derecesi ve enkaz miktarını denetlemek için. Bir yeni 50 mL konik tüp içine yerleştirin doku (yıkama #2, #3, vb) olduğu gibi kriptalarının en az enkaz ve villus ile izole olana 25 mL soğuk PBS ve shake ile dolu. Not: Sağlam kriptalarının ve en az enkaz ile temiz bir kısmını yalıtmak için hedeftir. Her ek yıkama ancak çok fazla sallayarak ikincil doku/hücre zarar görmesine neden başlayacak hücreleri temizler. Ayrıca, Eğer kriptalarının yıkama adım ve bir ayrılma reaktif adım kaplama en azından kirlenme ile en iyi sonuçları elde.</li>
	<li>Kalan dokuyu ve 50 mL konik boru 200 x g de süpernatant kaldırmak için 5 dakika santrifüj kapasitesi sonra crypt Pelet PBS (5 mL) küçük hacim içinde kalan resuspend.</li>
	<li>Ters bir mikroskop kullanarak, 50 µL aliquots kriptalarının/kesir sayısını belirlemek için her örneği inceleyin. Bu son matris patty boyutu olarak 50-100 kriptalarının/50 µL, hedeftir. Not: çok yoğun bir örneğiyse, istenen konsantrasyon ulaşılana kadar soğuk PBS eklemeye devam edin. Örnek çok seyreltik, istenen crypt verim ulaşmak ve ayarlamak için gerekli aliquots sayısını belirleyin.</li>
	<li>Aliquot uygun birimlerin microcentrifuge tüp içine kriptalarının (aliquot gözlemler tarafından saptanır). Örneğin, = 150 µL örnek 50 kriptalarının/50 µL sonra X 3 çoğaltır patty başına aliquot 50 µL varsa / microcentrifuge tüp. = 300 µL/tüp ise örnek sadece 25 kriptalarının/50 µL sonra 2 aliquots gerekli olan / patty X 3 çoğaltır.</li>
	<li>Pelet kriptalarının 200 x g 4° C'de 5 min için de</li>
	<li>Yavaşça pelleted kriptalarının uygun birim ana Mix (iyi başına 50 µL) ile resuspend. Hava kabarcıkları oluşturmadan, 15 kez pipetting hızla tarafından iyice karıştırın. Not: önceden ana mix aspirating önce soğuk steril PBS pipet ucuyla cool. Bu ana mix yayılan tutmak yardımcı olacaktır. İpuçları da buzdolabında muhafaza ve mahallede hemen kullanmak için önceden yerleştirilir.</li>
	<li>Bir 50 µL ana mix artı crypt damlacık her şey önceden ısıtılmış 24 iyi plaka merkezine dağıtmak.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk kültür plaka kuluçkaya</li>
	<li>Her matris patty ile 500 µL / de medyanın IESC (hiçbir ek büyüme ana karışımı içinde yer alır gibi gün 0 gerekli faktörleri) yerleşimi.</li>
	<li>500 µL steril PBS nem korumak için plaka üzerinde yaptı kullanılmayan herhangi bir kuyu ekleyin.</li>
	<li>Kaplama kriptalarının gün 0 saymak. Not: Ön ızgara her hücre kültür plaka kadranın daha doğru sayma sağlamak için yardımcı olur.</li>
	<li>Enterospheres her 24 saat sayısını ve her gün enteroid gelişimi için izleyebilirsiniz.</li>
	<li>Büyüme faktörleri her 48 de her h. için her 96 h IESC medyayı çıkarın ve 500 µL taze medya (büyüme faktörleri sonra medyaya eklenmelidir) yerine ekleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+gastrointestinal+ischemic+injury.">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury:+progress+and+promise+for+translational+research.">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li><li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair:+the+best+offense+is+a+good+defense.">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury.">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+models+of+digestive+disease:+the+future+of+large+animal+translational+research.">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids-Current+and+future+applications.">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging &amp; Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).</li><li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).</li><li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation.">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li><li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine.">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li><li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine.">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li><li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ischemia/reperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event.">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li><li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia.">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li><li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CCN1+(Cyr61)+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia/reperfusion.">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li><li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury.">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Domuz manken segmental intestinal iskemi gelişimini doku yaralanma aynı hayvan içinde birden fazla zaman puan incelenmesi için izin vererek önceki fare modelleri genişletir. Uygun damar ligasyonu, doku reperfüzyon ve başarılı crypt hücre kültürü de dahil olmak üzere bu protokol birkaç kritik tartışma noktaları vardır.
Uygun damar ligasyonu tam iskemi modeli oluşturulması esastır. Dikişi düzensiz bağlı veya kelepçe tamamen, kandan sıkılır değil kalın duvarlı arter doku girmeye devam edebilir ve ince duvarlı ven çöküşü nedeniyle çıkılamıyor. Bu kan ekstravazasyonu içine lamina propria ek doku hasarına neden olur. Ancak, iskemik yaralanma okudu türüne bağlı olarak, tam veya hemorajik iskemi istenen. Örneğin, bağırsak nakli sürecinde bağırsak tamamen tam intestinal iskemi sonuçları yordamı rezeksiyon aşamasında vasküler kaynağı (arter ve ven) ayrılır. Ne zaman bıçaklanmasından bir bağırsak volvulusu gibi bir olay sırasında bükülmüş, alternatif olarak, ancak, venöz dönüş kez önce arteryel kaynağı olmak önce doku içinde ek kan yol tıkalı, böylece yaratma engel hemorajik iskemi.
İskemik yaralanma villus ucunda başlayan ve mezar odası3Bankası aşağı uzanan doku hasarı sonuçlanır. İskemi sırasında enerji adenozin trifosfat şeklinde kullanılmak üzere devam ediyor ve metaboliti hypoxanthine oluşturur. Doku oksijen ile Reperfüze ne zaman, hypoxanthine ksantin oksidaz tarafından metabolize olur ve süperoksit serbest radikallerin mukozal hasar ve cazibe doku nötrofil17,18zarar yol üretir. Mukozal vasküler mimari aynı zamanda ksantin oksidaz, değişen ifade tür farklılıklar neden reperfüzyon hasarı3derecelerde. Kedi ve kemirgen iskemi-reperfüzyon reaktif oksijen metabolitleri19,20ila reperfüzyon hasarı için daha duyarlı modellerdir. Buna ek olarak, domuz daha az ksantin oksidaz ve bu model daha karşılaştırılabilir insan intestinal iskemi21yapmak bu nedenle daha az reperfüzyon hasarı için bulunamadı. Şu anda, nakavt veya bağırsak yaralanma çalışmaya transgenik domuz modelleri kullanımı, bu bu modelin büyük bir sınırlama yaparken tarif edilmiştir değil. Hastalık süreci uygun hayvan modeli seçimi bağlıdır veya belirli koşul araştırmacı çalışma istiyor. Örneğin, fare modellerinde en iskemik yordamlar 45-60 dk23ise maksimum 6 s iskemik yaralanma domuz modelleri açıklanan22, olmuştur.
Kültür epitel kurtarma çalışmaları için gelen normal ve ischemically zarar görmüş bağırsak bağırsak kriptalarının başarılı yalıtım sağlar. Bu sistem araştırmacı olarak değil damar kaynağı ya da göz önünde bulundurulacak bağışıklık hücre bileşeni benzersiz olarak tek başına, epitel odaklanmak izin verir. Bu epitel hücre etkileşimleri ve yaralanma yanı sıra farklı büyüme faktörleri veya cerrahi veya aşağıdaki crypt yalıtım sırasında kültür medya ilave tarafından yönetilen tedavi yanıtı aşağıdaki kurtarma çalışması için bir fırsat sunuyor. Bu adım en zor kalır, ağır hasarlı döngüler izolasyonu gerektirdiği kadar nazik sallayarak ve EDTA içeren çözümleri hızlı çıkarma kriptalarının gerekirse zamanından önce ayrışmış haline. Bu döngü bağırsak iyice yıkanır değil eğer kriptalarının kültüründe kontamine potansiyeline sahip. Sonuç olarak, antibiyotik antimycotic çözüm her iki DR çözümlerine ek olarak IESC medya için eklendi. Başka bir tartışma noktası normal bir denetimi toplanan bağırsak üzerinde duruluyor. Hayvanları anestezi ile inflamatuar aracılar iskemi için ikincil dolaşan olasılığı ile birlikte sistemik doku perfüzyon olası değişiklikler geçmesi gibi hatta "normal" Denetim doku gerçek kontrolü temsil etmeyebilir. Bu deneylerde, bu denetim doku doku için fena halde ve histolojik olarak karşılaştırılabilir iskemi (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) diğer deneylerde geçmesi değil hayvanlardan çıktı notun var.
Özet olarak, bu yöntem bir tekrarlanabilir model yakından ne insan iskemik yaralanma oluşur modelleri domuz intestinal iskemi, açıklar. Ayrıca, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden yalıtım anlatılan, hangi çalışma epitel onarım ve olası tepki kültür tedavi için hizmet vermektedir.

Bağırsak iskemik yaralanma, azalmış oksijen durumu bir azaltma veya bağırsak, kan akışını tam tıkanıklığı nedeniyle sonucu kalır morbidite ve mortalite insan ve hayvan hasta1,2önemli bir nedenidir. Sonraki inflamasyon ve hücresel infiltrasyon, birlikte iskemik hasar mukozal bariyer uyuşmazlığına yol açar. Mukozal bariyer bakteriyel translocation ve ilişkili toksinler önleme sistemik dolaşım3,4içine için çok önemlidir. İskemik doku sonraki reperfüzyon hasarı5azdırmak reaktif oksijen türlerine zarar verme oluşumuna neden. İntestinal iskemi nadiren önlenebilir olduğu için en güncel araştırma teknikleri iskemi erken teşhis ve reperfüzyon hasarı veya hedef mukozal onarım azaltmak yeni tedavi yaklaşımları gelişimi için ilerleyen üzerinde odaklanmıştır.
Hayvan modelleri kapsamlı iskemi-reperfüzyon hasarı temel bilim bilgimizi genişletmek ve translasyonel araştırma için şart kalmak için kullanılmaktadır. Kemirgen modelleri en çok kullanılan yeteneklerini genetik olarak işlenmiş6olması nedeniyle olmuştur. Son zamanlarda ancak, özellikle domuz, büyük hayvan modellerinin kullanımı nedeniyle bir çok avantaj insanlar7,8domuz anatomik ve fizyolojik benzerliklerinden dahil olmak üzere gelecek translasyonel etütler savunduğu. Yaralanma modelleriyle iskemi-reperfüzyon hasarı çalışma ve tam damar tıkanıklığı, düşük akım iskemi ve segmental mezenterik damar tıkanıklığı için geliştirilmiştir. Bu modellerin tam bir inceleme Ancak yazarlar son bir daha gözden geçirme3okuyucularına doğrudan bu makalenin bölge dışında var.
Vivo modelleri yanı sıra, ex vivo hücre kültür sistemlerinin kullanımı bağırsak homeostazı ve yaralanma takip onarım çalışmaya gelecek vaat eden bir araç sunar. Bağırsak kök hücre hücresel proliferasyonu ve ciro Bağırsak epitel astar için sorumludur. Ne zaman normal ya da yaralı bağırsak izole, bağırsak kök hücre kültüründe korunabilir ve bir aracı veya kök hücre ve epitel hücre biyolojisi çalışmaya modeli olarak hizmet. İzole etmek ve bunlar üç boyutlu kurmak için yöntemler kültür sistemleri (enteroids ve ne zaman küçük ve büyük bağırsak sırasıyla türetilmiş colonoids olarak adlandırdığı) türler ve organ sistemleri9,10 çeşitli için tarif var ,11,12,13. Özellikle, gastrointestinal sistem içinde modeli gastrointestinal hastalık kanser, patojen enfeksiyon ve iltihabi bağırsak hastalığı14dahil olmak üzere bu kültür sistemleri kullanılmıştır. Şu anda yalıtım ve bağırsak kök hücrelerden ischemically yaralı bağırsakta herhangi bir tür bakımından açıklayan hiçbir raporlar vardır. Bu nedenle, burada biz modelindeki tekrarlanabilir yaralanma ve yeteneğini ek çalışma için normal ve ischemically yaralı bağırsak bağırsak kök hücreleri izole etmek neden olan bir roman, büyük hayvan domuz intestinal iskemi süreci tanımlamak Kurtarma ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Önemli bir nedeni, morbidite ve mortalite insan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili hastalarda intestinal iskemi kalır. Kan akımı ve bu nedenle oksijen azalmıştır bağırsak için birçok hastalığı süreçleri intestinal iskemi neden. Bağırsak bariyer kaybı ve hasar için temel alınan doku bu götürür. Bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının tabanında bulunan ve homeostasis ve aşağıdaki yaralanma sırasında bağırsak yenilenmesi için sorumludur. Ex vivo hücre kültürü teknikleri üç boyutlu epitel organ benzeri sistemlerde büyümeyi desteklemek kültür koşulları kurarak epitel kök hücre etkileşimleri başarılı çalışma için izin ("enteroids" olarak adlandırılan ve" colonoids"küçük ve büyük bağırsak, sırasıyla). Bu enteroids crypt ve villus benzeri etki alanları oluşmaktadır ve olgun epitel içinde bulunan hücre türlerini içerecek. Tarihsel olarak, fare modelleri bağırsak yaralanma çalışmaya yeniden kullanılmıştır. Ancak, bir domuz modeli benzerlik boyutu gibi gastrointestinal anatomi ve Fizyoloji olan insanlar için de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Bir domuz modeli kullanarak, biz hangi intestinal iskemi gelen bir segmental döngüler içinde tek bir hayvan-ebilmek var olmak mahluk, farklı çalışma etkinleştirme puan iskemik yaralanma zaman ve içinde vivoonarmak bir protokol kurmak. Ayrıca, epitel tamir, kök hücreleri tarafından modülasyonlu sürekli çalışma için izin yalıtmak ve bağırsak, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden kültür için bir yöntem tarif ex vivo.

Tam intestinal iskemi dikiş veya Şekil 1' de gösterildiği gibi kelepçeler ile damar tıkanıklığı kullanarak küçük bağırsak döngüler içinde oluşturuldu. Kıskaç serbest bırakarak, reperfüzyon kontrollü bir süre, isterseniz sonraki reperfüzyon hasarı ek çalışma için izin gerçekleştirilebilir. Ötenazi kadar en az komplikasyon ile işlemi sırasında tüm hayvanlar hayatta. En sık kullanılan cerrahi komplikasyon hipotansiyon, dobutamin gibi pozitif inotrop takviyesi ile çözülmüş oldu.
Doğru olarak gerçekleştirdiyseniz, iskemik yaralanma bağırsak villus ucunda başlar ve aşağı içinde crypt iskemi artar (Şekil 2) süresi olarak geçirilir. Kan damarları değil bakmaksızın veya eşit klempe cerrahi tekniği ile bir yaygın hata oluşabilir. Bir hemorajik iskemi (Şekil 3), hangi ek kan doku sızmak izin arter önce ince duvarlı ven çöker sonucudur. Bu ağır soluk bir yüzeye tam iskemi (Şekil 3, sağ) sırasında karşılaştırıldığında bir koyu mor serozal yüzey (Şekil 3, sol) olarak görülüyor.
İskemik bağırsak döngüler kaldırılmasını, bağırsak kriptalarının ayrılma protokol (Şekil 4) sonrası başarılı bir şekilde izole edildi. Beklendiği gibi daha ağır hasarlı timepoints üzerinden kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. İletişim kuralı sırasında ağır yaralı bağırsak yavaşça alttaki dokulara ek zarar görmemesi için sarsılmış gerekir. Sallayarak çok kabaca daha fazla crypt hasar ve ek bozulma sonucu EDTA içeren DR çözümlerinde biten kriptalarının çoğunluğu neden olabilir.
Kaplama, iskemi tüm zaman noktalarından kriptalarının hayatta kalmak ve Kültür (Şekil 5) kurulan haline edebiliyoruz. Ne zaman normal ve hafif hasarlı bağırsak kriptalarının kültür, enterospheres form içinde 24-48 h kaplama. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h), bağırsak kriptalarının hayatta ama, çok daha küçük küreler oluşumunda başlangıçta kaynaklanan hasar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. Genel olarak, azalan büyüme verimlilik kriptalarının yanı sıra ciddi bir şekilde zarar görmüş bağırsak dokusundan (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) elde edilen enteroids azalmış bir boyutu olduğunu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Resim 1 : Tam intestinal iskemi bir domuz modelinde cerrahi modeli. A) exteriorized normal domuz değişir. B) mezenterik damarları dikiş intestinal iskemi oluşturma tane. C) istenirse doku reperfüzyon için izin vermek için buldozer vasküler kelepçeler kullanılarak oluşturulan iskemi. D) bağırsak damarlara hemen ardından vasküler kelepçeler kaldırılması. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Resim 2 : Tam intestinal iskemi uzun süreleri takip epitel zarar artan histolojik kanıt (Hematoksilen ve eozin (H & E) leke). Hasar villus ucu kademeli kaybı tek hücre epitel tabakası, i. blunting ve ciddi yaralanma (4 s süresi) ile temel crypt aşağı uzanan hücresel hasar ile başlar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Şekil 3 : Hemorajik iskemi brüt ve histolojik kanıtı. A) Brüt fotoğraf hemorajik iskemi (sol loop) ve tam iskemi (doğru döngü) karşılaştırma. Damarlara bakmaksızın değil veya eşit olarak sabitlenmiş, kan ek inflamasyon ve hasar sonucu dokular, sızmaya devam edebilirsiniz. B) H & E görüntüleri süresi 1-4 h artan hemorajik iskemi. Tam iskemi ile görülen hücresel hasar yanı sıra kırmızı kan hücre infiltrasyonu çevreleyen lamina propria içinde kanıt yoktur. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Şekil 4 : Bağırsak kriptalarının iskemik ve normal bağırsak döngüler izole aliquots. Eksiksiz, bozulmamış bağırsak kriptalarının (yıldızlar) başarıyla bağırsak her döngü izole edildi. Beklendiği gibi daha fazla ağır hasarlı zaman noktalarından kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Şekil 5 : Zaman ders yalıtım ince bağırsak iskemik döngüler takip bağırsak kök hücre büyüme. Normal bağırsak kriptalarının kültüründe kaplama zaman içinde 24-48 h enterospheres kurdu. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h) ile kriptalarının hayatta ama çok daha küçük küreler başlangıçta oluştururlar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. 20 µm ölçek belirtilmediği sürece bar. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Büyüme faktörü</td>
			<td>Eritici</td>
			<td>Hisse senedi toplama</td>
			<td>Hisse senedi seyreltme</td>
			<td>Çalışma seyreltme</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kafa</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10mM asetik asit</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinamid</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>2.5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: büyüme faktörü reaktif tablo. Büyüme faktörü hisse senedi çözümler ve bu protokol için kullanılan çalışma çözümleri Özeti.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Bu iletişim kuralı okuyucuların başarıyla gelen bir segmental intestinal iskemi domuz bir model kurmak ve daha sonra yalıtmak ve bağırsak kök hücreleri epitelyal onarım yaralanma aşağıdaki çalışma için kültür sağlayacaktır.

Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Görüntüleme.  North Carolina State University. Bu iletişim kuralı okuyucuların başarıyla gelen bir segmental intestinal iskemi domuz bir model kurmak ve daha sonra yalıtmak ve bağırsak kök hücreleri epitelyal onarım yaralanma aşağıdaki çalışma için kültür sağlayacaktır.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Bir Fare Modeli Utero Organ Nakli

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Tıp

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

Bağırsak Manipülasyon bir Standart Model Analizleri: Kemirgenler Barsak Motilite ve Gut Duvar İnflamasyon İşlevsel Değerlendirilmesi

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality of life when compared to dialysis. Although the last few decades have seen major improvements in patient outcomes following kidney transplantation, the increasing shortage of available organs represents a severe problem worldwide. To expand the donor pool, marginal kidney grafts recovered from extended criteria donors (ECD) or donated after circulatory death (DCD) are now accepted for transplantation. To further improve the postoperative outcome of these marginal grafts, research must focus on new therapeutic approaches such as alternative preservation techniques, immunomodulation, gene transfer, and stem cell administration.
Experimental studies in animal models are the final step before newly developed techniques can be translated into clinical practice. Porcine kidney transplantation is an excellent model of human transplantation and allows investigation of novel approaches. The major advantage of the porcine model is its anatomical and physiological similarity to the human body, which facilitates the rapid translation of new findings to clinical trials. This article offers a surgical step-by-step protocol for an autotransplantation model and highlights key factors to ensure experimental success. Adequate pre- and postoperative housing, attentive anesthesia, and consistent surgical techniques result in favorable postoperative outcomes. Resection of the contralateral native kidney provides the opportunity to assess post-transplant graft function. The placement of venous and urinary catheters and the use of metabolic cages allow further detailed evaluation. For long-term follow-up studies and investigation of alternative graft preservation techniques, autotransplantation models are superior to allotransplantation models, as they avoid the confounding bias posed by rejection and immunosuppressive medication.

Porcine models of organ transplantation provide an important platform to study mechanisms of organ preservation. This article describes a heterotopic porcine renal autotransplantation model, which allows investigating new approaches to improve the outcome of transplantation using marginal kidney grafts.

Bir Domuz Modeli heterotopik Böbrek Ototransplantasyon: Bir Adım-Adım Protokolü

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Bağırsak İskemi-reperfüzyon Hasarı Murin Modeli

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

Rekonstrüktif Mikrocerrahide İskemi-Reperfüzyon Hasarı Nın İnceleştirilmesinde Klinik Öncesi Sıçan Modeli

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

İskemi/Reperfüzyon Porsin Modelinde Omurilik Mikroperfüzyonunun Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

Hyaluronik Asit 35 kDa'nın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...