Tekrar ilaç CDDO DFPA verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Jane ve Lee Seidman sandalye Pediatrik kanser yenilik (John Letterio) desteğiyle anıyoruz. Bu eser Savunma Bakanlığı tarafından [W81XWH-12-1-0452]; desteklenmiştir Angie Fowler ergen ve Genç Yetişkin kanser araştırma girişimiyle durumda kapsamlı Kanser Merkezi; ve FJ Callahan temelden Hsi-Ju Wei Callahan mezunu Scholar Ödülü.

Case Western Reserve Üniversitesi Tıp Fakültesi'nın kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar ile uyumlu tüm çalışmaları yapıldı.
1. dendritik hücreler (BMDCs) kemik iliği türevi hazırlayın
<ol><li>Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.</li>
	<li>C57BL/6 fareler CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas kullanarak Tibia-fibula ve uyluk kemikleri tüketim ve ile % 70 etanol 10 cm kültür tabağına koyun.</li>
	<li>Cerrahi bıçaklar ve forseps uzak doku incelemek için kullanın 10 cm kapağındaki mümkün olduğunca kültür çanak ve izole yırtılmalarıteşhis ve uyluk ile % 70 etanol 6 cm kültür tabağına koyun.</li>
	<li>Her iki ucunda da yırtılmalarıteşhis ve uyluk kırpmaya cerrahi bıçaklar kullanın. 3 mL PBS 3 ml şırınga 23 G iğne ile kemik iliği içeriğini kemik bir ucundan 12 ml PBS içeren bir konik tüp floş için kullanın. Bu adım 3 x her kemik için tekrarlamak.</li>
	<li>300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet kırmızı kan hücreleri kaldırmak 5 dakika için 1 ml ACK lysing tampon ile resuspend.</li>
	<li>9 ml ACK lysing tampon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj sulandırmak için PBS ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 10 ml kültür orta (RPMI-1640 artı L-glutamine, %10 FBS, % 1 esansiyel olmayan amino asit (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol ve % 5 penisilin/streptomisin) ile resuspend. Not: Endotoksin düzeyi daha az 0.1 EU/ml FBS içinde olmak zorunda.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve hücre süspansiyon, 20 µl alıp trypan canlı hücreleri sitometresi kullanarak saymak için mavi 80 µl ile karıştırın.</li>
	<li>1 x 106 hücre/ml 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile cep numarasını ayarlayın.</li>
	<li>3 ml 1 x 106 hücre/ml her iyi 6-şey plaka plaka ve 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya. Not: Bir fare kemik iliği hücrelerinden olduğunu çevresinde 3-5 x 107 hücreleri, bu 2 ila 3 6-şey plakaları için yerleştirilebilir gösteren.</li>
	<li>Günde 3, tüm 3 ml kültür orta her kuyudan çıkarmak her kuyuda 2 ml taze PBS ekleyin ve sonra yavaşça yapışık olmayan hücreleri kaldırma sağlamak için plaka girdap.</li>
	<li>15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 her iyi 3 ml taze kültür orta yerine. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>5 günde, doğrudan başka bir 3 ml taze kültür ortamına 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile her kuyuya ekleyin. 37 ° C, % 5 CO2, ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya. Not: Toplam her iyi şimdi 6 ml birimdir.</li>
	<li>7 günde 10 dakika için buz üzerinde tüm plaka koymak. Hafifçe gevşek-yapışık BMDCs iDCs süspansiyon çıkarmak için her şey kültür ortamında pipette. Not: Yapisan makrofajlar hala plakasına eklenir. Düşük sıcaklık ve yavaşça yordamlar deneyler daha da etkilemeye DC etkinleştirme önlemek için anahtarıdır.</li>
	<li>300 x g 5 dakika için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve daha fazla deneyler için taze kültür orta ile resuspend. Not: BMDCs floresan etiketli CD11c antikor ile akış sitometresi tarafından tespit edilebilir ve Şekil 1' de BMDCs bizim perdeleme strateji daha fazla deneyler için gösterdi.</li>
</ol>2. TolDC gen ve Protein profil karakterize
<ol><li>2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem CO2 Kuluçka kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka. Not: CDDO-DFPA, sentetik bir triterpenoid 2 faktör (Nrf2) uyarıcı ve nükleer faktör-κB (NF-κB) inhibitörü - gibi - nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) değil. İDCs IL-10, D3 vitamini, deksametazon veya BAY 11-7085, gibi diğer maddeleri TolDCs indüksiyon için uygulamak ve bu adımı her aracısının en uygun bir durumuna değiştirebilirsiniz.</li>
	<li>10 veya 100 ng/ml LPS (kuluçka süresi nedeniyle mRNA veya protein ölçümü farklıdır) mDCs ikna etmek için 4-24 gönderilen kuluçka için ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça her şey kültür ortamında pipette ve 1 ml pipet kullanarak hücre süspansiyon hasat. 300 x g hücreleri ve süpernatant, sırasıyla toplamak 5 dakika için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Uyarıcı ligandlar gibi akış sitometresi tarafından yüzey ligandlar hücre topakları üzerinden analiz: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL veya inhibitör ligandlar: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>RNA hücre topakları üzerinden yalıtmak ve RNA ve süpernatant örnekleri için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA, sitokin profil ve gen ve protein düzeyleri sırasıyla çözümleyebilirsiniz. Not: için örnek, inflamatuar sitokinlerin: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 ve IL-23 veya anti-inflamatuar sitokinlerin: Il-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 ve HO-1.</li>
</ol>3. TolDCs fonksiyonun değerlendirildiği Vitro ve In Vivo
<ol><li>
T-hücre Syngeneic yayılması tahlil
	<ol>
<li>Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.</li>
		<li>MAC'ler arabellek % 0.5 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM EDTA 500 ml PBS kullanarak hazırlayın. Arabellek 0.2 µm filtreden süzerek sterilize. Not: aşağıdaki deneme sırasında arabellek buz üzerinde tutun.</li>
		<li>CD4 elde etmek için+ T hücreleri, CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş OT-II T-hücre reseptör (TCR) transgenik fareler ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak.</li>
		<li>2 ml PBS ile dalak bir 6 cm kültür tabak koyun ve bir 40 mikron hücre süzgeç geçirerek dalak bin dereden su getirmek için bas-3 ml şırınga parça arka kullanın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj toplamak.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek 400 μl içinde resuspend.</li>
		<li>CD4 100 μl eklemek+ T hücre Biotin-antikor kokteyl 4° c 5 dakika için. Not: Antikor kokteyl CD4 dışındaki diğer hücre türleri üzerinde bağlar+ T hücreleri, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R gibi (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC sınıf II, Ter-119 ve TCRγ/δ.</li>
		<li>MAC'ler arabelleği 300 μl ve anti-Biotin boncuk (Tablo reçetesi) 200 μl 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Sütun oluşan yer ferromanyetik küre (Malzemeler tablo) ve ön ayırma alanını seçin ve MAC'ler arabellek 3 ml ile durulayın filtrede birlikte manyetik.</li>
		<li>MAC'ler arabelleği 9 ml hücreleri ve 300 x g, santrifüj 5 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Hücre Pelet 3 ml MAC'ler arabellek resuspend ve sütun uygulayın. Toplamak akışı içeren CD4 aracılığıyla+ T hücreleri.</li>
		<li>Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.</li>
		<li>Dalak pan DCs elde etmek için CO2 odası kullanarak C57BL/6 fareler 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak. Dalak 2 ml collagenase D çözeltisi içeren bir 6 cm kültür tabak koyun (2 mg/ml collagenase D çözünmüş kalsiyum, magnezyum içeren HBSS).</li>
		<li>1 ml collagenase D çözeltisi dalak için iki kez 1 ml şırınga ve bir 25 G iğne ile enjekte. Dalak küçük parçalar halinde küçük makasla kesilmiş.</li>
		<li>Salla ve 25 dakika için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>0, 5 M EDTA 500 μl, oda sıcaklığında 5 dakika için ekleyin. Not: 3.1.13-3.1.14 adımlardan DCs verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.</li>
		<li>Şimdi itmek-3 ml şırınga parça arka tarafından geçen 40 mikron hücre süzgeç dalak Bulamaç kıyma ve 300 x g 5 dakika için de centrifuging tarafından hücre süspansiyon toplamak için kullanın.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek, 50 μl FcR engelleme reaktif ve Pan dendritik hücre Biotin-antikor kokteyl, 100 μl 4 ° C'de 10 dakika için 350 μl resuspend. Not: Antikor DC'ler tarafından ifade değil antijenlere karşı kokteyl.</li>
		<li>Hücreleri 300 x g 5 dakika için de 9 ml MAC'ler arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.</li>
		<li>Hücre Pelet MAC'ler arabellek 800 μl içinde resuspend ve anti-Biotin boncuk 200 μl 4° C'de 10 dakika için ekleyin.</li>
		<li>DCs toplamak için 3.1.9-3.1.11 gelen adımları yineleyin.</li>
		<li>Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun iki kez yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.</li>
		<li>2 x 105 DCs/ml 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° c+ için 1 saatlik ayrı, etiket CD4 T hücreleri (1 x 107/ml) içinde cihaz 15 dakika süreyle 37 ° C'de 1 mikron CFSE ile tedavi, PBS ile yıkayın ve son konsantrasyonu 2 x 106 T hücre/ml almak için birimin yeniden ayarlayabilirsiniz.</li>
		<li>Daha sonra bir 96-şey tabak içinde tedavi dendritik hücreler 100 μl CFSE etiketli CD4 aynı hacmi ile ortak kültür+ T hücreleri,--dan belgili tanımlık yukarıda merdiven-1:10 almak için toplanan her ikisi de oranı. Şimdi 100 ng/mL ovalbumin (OVA) peptid 323-329 iyi ve ölçü CFSE yoğunluk akış sitometresi tarafından T hücrelerinin başına 2-3 gün sonra kuluçka ekleyin. Not: Hücre sayıları ve oranı DCs ve T hücreleri bizim önceki iş37optimize edilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasif neden BMDCs enjekte edilerek EAE Geniş puls miyelin Oligodendrocyte glikoprotein (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 saat kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.</li>
		<li>10 ng/ml LPS 24 kuluçka için ekleyin gönderilen.</li>
		<li>100 μg/ml MOG (35-55) 4 kuluçka için ekleyin gönderilen.</li>
		<li>Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj hasat.</li>
		<li>Hücre Pelet PBS ile resuspend ve hücreleri saymak.</li>
		<li>Subkutan 200 μl 8-10 hafta yaşlı kadın C57BL/6 farelere (her arka bacak içine 100 μl) 2 x 106 hücrelerinin enjekte et.</li>
		<li>BMDC enjeksiyon ve 48 gün gönderilen. daha sonra 200 enjekte ng boğmaca toksin (PTX) her fare.</li>
		<li>Adımları 3.2.6-3.2.7, 4 hafta boyunca haftada bir kez yineleyin.</li>
		<li>EAE klinik belirtileri günlük standart ölçütleri37 (0,5-topal kuyruk sonunda, 1-topal kuyruk, 2-orta arka bacak zayıflık, 3 şiddetli hind uzuv zayıflık, 4-tam hind felç, 5-kesici veya can çekişen devlet, 6-ölüm) kullanarak değerlendirmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Bu kağıt için tekrarlanarak iDCs oluşturmak ve daha sonra onları TolDCs ayırt etmek için kullanılabilir verimli bir iletişim kuralı tanımlar ve önerdiğimiz bu TolDC ikna etmek için yeni moleküler hedef aracıları kapasitesini değerlendirmek için uygulanabilir fenotip. Bu raporda açıklanan, hangi biz ilk yüzey ligandlar TolDC ifade tarafından qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçülen DC sitokin profil bir değerlendirmesini ve ardından akış sitometresi analiz bir sıra takip ettik. Son olarak, TolDCs immunoregulatory fonksiyonu T hücre proliferasyonu vitro ve otoimmünite içinde vivo, MS preklinik fare EAE modelini kullanma bastırmak için onların etkinliğini azaltmak için kapasitelerini göstererek teyit edildi.
Bizim iletişim kuralında, iDCs oluşturulan ve fare kemik iliği öncüleri, GM-CSF ve Il-4 kombinasyonu ile gelen farklı. Diğer iletişim kuralları form benzeri Tirozin kinaz 3 ligandlar (Flt3L) iDCs44oluşturmak için kültür ortamında kullanılan. Flt3L kullanımını iDCs verimini artırır, ancak bu iDCs genellikle 2 gün (3 gün) hasat için GM-CSF/Il-4 ek (7 gün)44için karşılaştırıldığında alır. Daha da önemlisi, Flt3L sıklıkla oluşturulacağını IDC ayırt etmek her iki KGK (CD8- ve CD8+) ve işlevsel olduğunu PDC'ler45 ve phenotypically kararlı durum DCs içinde vivo eşdeğerlerine. Ancak, GM-CSF/Il-4 kaçınılmaz IDC KGK doğru farklılaşma neden olmaktadır (CD8-) sadece44 ve olgunlaşma sırasında onlar inflamatuar DCs46benzer karakter gösterdi. GM-CSF/Il-4 kez klinik çalışmalarda ve temel araştırma monosit veya CD34 DCs ayırt avantajı nedeniyle kullanılır biliyorum çekicidir+ ataları44. Bu iki yöntem oluşturulan iDCs Ayrıca farklı hücre yüzey işaretleyicileri sahip ve farklı sitokin profilleri onların harekete geçirmek üzerine sergi morfolojik farklı hücreleri üretmek gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemler tarafından indüklenen TolDCs kemotaktik faktörler cevaben geçirmek ve antijen spesifik T hücre yanıt44,45ikna etmek için yeteneklerini değişir. Bunu anlayışla CD8+ DCs cross-tolerance47TolDC indüksiyon kendi benzersiz kapasitesi nedeniyle daha fazla potansiyel sergilemek. Ancak, o zaman daha fazla hücre tabi BMDCs sıralama elde edilen belirli CD8 araştırmak için Flt3L tarafından+ DC alt küme küme küme. Buna ek olarak, beri GM-CSF/Il-4 indüklenen BMDCs T hücre stimülasyon ve LPS tedavi44,45takip inflamatuar aracılar üretimi üstün, bu strateji daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar verdi bulundu bizim deneyler.
BMDCs GM-CSF/Il-4 başlangıç CD11c 4 gün hızlı ve ifadeden sonra 6 gün48zenginleştirmek için türetilmiş. Gün 10-12 alt kaplama yoğunluklu kemik iliği hücreleri ve düşük GMC-SF günde 8-1049doz kadar bu kültür yordamı sürekli olabilir. Bu protokol için CDDO-DFPA (sentetik triterpenoid) ve LPS tandem DC hoşgörü ve olgunlaşma, sırasıyla ikna etmek için aracıları olarak eklenmiştir. Biz son zamanlarda BMDC üretimi bu yöntemi kullanan kültürler hasat iDCs CDDO-DFPA37ile ön işleme zaman işlevsel bir TolDC fenotip sergi bildirdi. Bu IDC hasat sonra (7 gün)37, kültürler için birden çok kez IDC farklılaşma (gün 2, 4, 6)50sırasında eklenmelidir D3 vitamini gibi ajanlar aksine yalnızca eklenmiş olan CDDO-DFPA, kültürlerin dikkat çekicidir. Ayrıca, TolDCs bu indüksiyon D3 vitamini tarafından sırasında ve sonrasında IDC farklılaşma51başlatılması gerekir çeşitli mekanizmaları bağlı olabilir. Bizim veri CDDO-DFPA IDC farklılaşma sırasında ekleme CD11c + DCs saflık üzerinde herhangi bir etkisi vardı ama doz bağımlı (veri gösterilmez) gün 7 iDCs verimi düşük öneririz. Bizim analizleri de bu konsantrasyon CDDO-DFPA37ile normal canlılığı IDC gösterdi rağmen CDDO-DFPA bu deneylerde kullanılan yüksek konsantrasyonu kemik iliği progenitör hücreler için toksik olabilir öneririz. TolDC indüksiyon zamanlama etkisini ve pozlama gibi CDDO-DFPA acentelere uzunluğu dikkatli analizler tarafından optimize edilebilir öngörülmektedir.
Alternatif Yöntemler ve mekanizmalar üzerinden iDCs mDCs için diğerlerinden daha CD40L, TNF-α ve IFN γ52gibi LPS tarafından indüklenen dikkate almak önemlidir. DC olgunlaşma nükleer faktör-κB (NF-κB), p38 mitojenle aktive protein kinaz (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinaz (JNK), dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri aktivasyonu 4(TLR4) Toll benzeri reseptörler aracılığıyla LPS tarafından yol açar ve ekstrasellüler sinyal düzenlenir protein kinaz (ERK1/2). DC'ler tarafından CD40L ve TNF-α olgunlaşma CD40 ve TNF reseptörleri üzerinden sırasıyla NF-κB yolu neden olmaktadır. Buna ek olarak, Janus kinaz (JAK), Tirozin kinaz (TYK) ve sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve aktivatör (istatistikler) transkripsiyon proteinlerin de dahil olmak üzere farklı bir yol IFN γ uyarır ve aşağı akım bu etkiler de etkinleştirme tarafından tamamlanmaktadır NF-κB yolu52. Buna ek olarak, bu DCs T hücreleri Th2 hücre yanıt53doğru kutuplaştırmak gen ifade profil CD40L/TNF-α-tabanlı DC olgunlaşma öneriyor iken, DC olgunlaşma IFN γ tarafından güçlü bir Th1 hücre yanıt54doğru önyargılı. Bu nedenle, farklılaşma doğru belirli T hücre alt kümeleri için bağlı bu indükleyicileri DC olgunlaşma bu protokol için istihdam değil.
Çeşitli raporlar bu ex vivogöstermiştir-farklılaştırılmış DCs EAE klinik belirtiler ve patoloji fareler55yılında tam spektrum inducing yeteneğine sahip. Aktif ex vivo DC'ler tarafından pasif EAE indüksiyon yöntemi farklı laboratuvarlar tarafından çeşitli değişiklikler ile kabul edilmiştir. Pasif ve aktif EAE indüksiyon MOG İdaresi tarafından kombinasyonu BMDCs, 7 gün öncesine bağışıklama MOG ile astarlanmalıdır ve tam Freund's adjuvan (CFA) sonuç daha yüksek klinik belirti skorları (klinik skoru zirve: 3.5) pasif EAE karşılaştırıldığında İndüksiyon MOG yönetimi tarafından kullanıma hazır BMDCs yalnız (klinik skoru zirve: 2)56. Sonuçları MOG birleştiren bu yöntemle astarlanmalıdır BMDCs bu hastalık başlangıcı olur gün 9'den sonra MOG ve CFA56ile bağışıklama bağışıklama MOG ile göstermektedir. Beri bilindiği CFA Yönetim57yerinde önemli iltihabı neden olur, ancak, biz pasif EAE indüksiyon DCs bizim iletişim kuralında yalnız İdaresi tarafından etkili bir şekilde EAE sırasında TolDCs etkisini analiz için kullanılan. Daha fazla TolDCs fonksiyonel fenotip onaylamak için bir de onları etkin EAE farelerin klinik belirtiler bastırmak sınamanız gerekir. DCs yönetim rotanın da EAE belirtiler58indüksiyon için önemlidir. Bizim laboratuvar tarafından ve diğerleri tarafından bildirildiği gibi Subkutan Enjeksiyon haftada 3-4 iğne olmak üzere toplam BMDCs C57BL/6 farelerin kanat bölgeye EAE bir tepe klinik skoru neden olmaktadır 2-2,5 gün 11-1237 tekrarlanabilir hastalığı başlangıcı ile ,58. Biz aktif ve pasif EAE İndüksiyon (Video 1) arasında farklı klinik belirtileri göstermek için kısa bir klip sağladı.
Bizim iletişim kuralı tanınan sınırlamaları istihdam yöntemleri tarafından gereken süreyi ve fizyolojik olarak sigara ilgili bir microenvironment için BMDC farklılaşma bağımlılığını içerir. Ancak, antikor toplama DCs için sütun ayırma yöntemleri zenginleştirilmiş ve fare dalak T hücrelerden daha fazla zaman verimli olabilir iken, istenilen DC nüfus bir düşük verim--dan bu yaşanıyor. Böylece, kemik iliği türevi DC geliştirme yöntemi bütün dalak antikor sütun ayrılık karşılaştırıldığında DC nüfus günlük ölçek daha yüksek verim avantajdır. Oluşturulan DCs yukarıda da belirtildiği gibi vitro bu yöntem tarafından DCs vivo içinde microenvironment59 için fizyolojik olarak ilgili olmayan ve aynı zamanda uzun vadeli garantilemez sitokin takviyesi yüksek konsantrasyon gerektirir DC sürdürülebilirliği. Bizim iletişim kuralında kullanılan GM-CSF da normal DC farklılaşma vivo içinde60için temel bir sitokin değil. Bununla birlikte, önerilen BMDC üretimi iletişim kuralını tekrarlanarak işlevsel olarak TolDCs yüksek bir kısmını verir ve tolerogenic özellikleri ile işlevsel DCs üretmek için son derece güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olarak görülmelidir.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokolü oluşturulan TolDCs etkili bir şekilde gen ve protein ifade profillerini değerlendirirken, T hücre bağımlı bağışık yanıt vitromodüle kapasitelerini malzemelerini ve tarafından karakterize edilebilir işlevlerine EAE indüksiyon vivobastırmak için bir evlat edinen hücre tedavisi değerlendiriliyor. Bizim iletişim kuralı kapasitesine sahip düşünülen yeni herhangi bir ajan TolDCs ikna etmek için ve daha fazla terapötik geliştirme sürecini TolDCs için kliniğe Bank hızlandırmak için değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar.

Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçası olan ilk keşfetti ve Ralph Steinman ve Zanvil Cohn birincil profesyonel antijen sunan hücreler1olarak 1973 yılında ile karakterizedir. DCs T hücreleri ve B hücreleri MHC kompleksi (MHC) ile işlenmiş antijen ikincil lenfoid organlara içinde doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri2bağlantı sunarak bağışıklık harekete geçirmek içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Memeli bağışıklık sisteminde miyeloid DCs ve plazmasitoid DCs (PDC)3açıklanan DC'lerin en az iki kategorisi vardır. Myeloid DCs, geleneksel DCs (KGK), CD11c ifade tarafından karakterize ve olgunlaşmamış DCs (iDCs) içinde vitro kemik iliği progenitör hücre veya kullanarak periferik kan monosit olarak farklı olarak da bilinir granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve Il-4 fare veya insan türler, sırasıyla4.
Sürücü moleküler desenleri (PAMP) patojen ilişkili veya moleküler desenleri (nem), hasar ilişkili öyle aynı derecede immunojenik DCs doğru iDCs olgunlaşma olgun DCs (mDCs) olarak çeşitli desen tanıma reseptörleri bağlama via 'tehlike' aktive, sinyalleri DC yüzey5. İmmunojenik DCs daha da prime saf T hücre çoğalması ve MHCII2, costimulatory ligandlar (CD80, CD86 ve CD40)6, sitokinler ve diğer çözünür arabulucu7upregulation aracılığıyla farklılaşma. Pro-inflamatuar arabulucu üretim immünojenik DCs gelen bir çağlayan sitokin aracılıklı T hücre farklılaşması için esastır. Örneğin, IL-12 ve IFN γ Th1 farklılaşma8 ve Il-1, için gerekli olan Il-6 ve IL-23 saf T hücre polarizasyon Th17 hücreleri9doğru için önemlidir. Her ne kadar olgun DCs yabancı antijenleri için tepki, kontrolsüz DC etkinleştirme tarafından öz-antijenleri tolerans ablasyon neden olabilir ve autoreactive T hücreleri olan harekete geçirmek10 doku yıkıma yol oluşturarak otoimmün hastalıklar gelişimi teşvik .
Son raporlar DC plastisite, yeteneklerini kendi doku microenvironment içinde farklı ipuçları ile etkileşim ve farklı efektör/bastırıcı DC alt kümeleri ayırt etmek için tarafından örneği açık kanıtlar sağlamıştır. IL-1011, TGF-β12ve HO-113 gibi anti-inflamatuar arabulucu tolerogenic DCs (TolDCs) inducing tarafından bağışıklık suppression içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu TolDCs düzenleyici işlevleri elde etmek ve T hücre proliferasyonu14bastırmak. Ayrıca, DC'ler tarafından ortak uyarım eksikliği ve anti-inflamatuar arabulucu TolDCs gelen üretim hem düzenleyici T hücreleri (Tregs) indüksiyon katkı ve aynı zamanda etkili Th1 ve Th17 farklılaşma ve genişleme15inhibe. İki yıl, TolDCs tedavi edici potansiyelini birkaç müfettişler tarafından bildirilmiştir. Bu çalışmalarda ex vivo yönetim sadece iyileştirmiştir TolDCs patolojik belirtiler otoimmün hastalıklar16 farklı preklinik modellerin oluşturulan ama aynı zamanda17 hastalarda immün tolerans gelişmesine yol açtı ,18. Otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli klinik çalışmalarda 1 diyabet19, romatoid artrit20, türü için ilginç bir şekilde, bugün TolDCs terapi alternatif veya ek bir yaklaşım kabul edilmiştir 21, multipl skleroz (MS)22,23,24ve Crohn hastalığı25.
Çeşitli TolDCs geliştirmek için kullanılan iletişim kuralları vardır ve birkaç laboratuar yöntemleri üretimi ve TolDCs fenotipik karakterizasyonu için bildirdin. Bu yöntemler tekrarlanarak TolDCs vitro hematopoetik ataları oluşturmak ve stabil bir tolerogenic devlet vivo içinde26,27,28,29onları korumak için kullanılabilir. İDCs-ebilmek var olmak değiştirmek TolDCs çeşitli immunomodulatory farmakolojik ajanlar veya anti-inflamatuar sitokinlerin maruz. Örneğin, D3 vitamini IL-10 üretimi artırmak ve DCs gelen IL-12 salgılanması bastırmak ve böylece onların immünsüpresif işlevi30artırmak için bilinen bir iyi bilinen farmakolojik ajandır. DCs lipopolisakkaritler (LPS), gibi güçlü inflamatuar uyarıcılara maruz kaldığında Ayrıca, deksametazon31, rapamycin32ve kortikosteroidler33 gibi çeşitli farmakolojik ajanlar ikna etmek için gösterilmiştir CD40, CD80, CD86 ve MHCII34DC yüzey ifade azaltarak TolDC fenotip. IL-10 ve TGF-β DC tolerans35 ve eşlik eden maruz kalma bu sitokinler her ikisi de ikna etmek için en okudu anti-inflamatuar sitokinlerin tolerogenic fenotip DCs36içinde ikna etmek için göstermiştir vardır.
Yerine fenotipik işaretleri tarafından orada DC fonksiyonel özelliklere göre tanımlanır tolerogenic beri büyük bir TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu için tutarlı bir yöntem geliştirmek zorundayız. Eğer biz etkili ve tekrarlanarak TolDC fenotip ikna etmek için yetenek yeni ajanların karşılaştırmak için Ayrıca, titiz ve tutarlı iletişim kuralı tutarlı değerlendirme ve tolerogenic DC fenotip karakterizasyonu için oluşturulmalıdır Laboratuvar. Burada ayrıntılı bir protokol ile adım adım yöntemler iDCs farelerin hematopoetik ataları gelen izole etmek ve daha sonra değerlendirme kapasitelerini TolDCs iDCs dönüştürmek için altında yeni ajanların etkinliğini çözümlemek için sağlam sağlayan sağlamak TolDCs fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu vitro ve içinde vivo. Bu açıklama TolDCs onların yüzey ligandlar, sitokin profil ve immünsupresif işlevleri vitrotarafından karakterize etmek için ayrıntılı bir yöntem içerir. Biz de bu TolDCs MS, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), önceden klinik bir modeli potansiyel tedavi uygulanması keşfetmek için bir yöntem örneği sağlar. Bu oluşturulmuş protokol TolDCs indüksiyon teşvik için yeni acentalar kapasitesini değerlendirmek için Müfettişler yardımcı olacak ve TolDC terapötik geliştirme kapsamını genişletmek için çaba kolaylaştıracaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

Bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı denetleyici yanıt arasında sıkı bir denge tutarak çalışır ve öz-antijenleri yanı sıra antijenlere karşı tepkisiz bir durum komensal organizmalar türetilmiş. Bu bağışıklık homeostazı bozulma kronik inflamasyon ve otoimmünite gelişmesine yol açabilir. Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı bağışıklık yanıtı başlatmak için saf T hücreleri aktive dahil profesyonel antijen sunan hücreler vardır. Ancak, DCs da korumak ve T hücre tolerans teşvik ve efektör hücreleri ya da otoimmün veya kronik inflamasyon koşulları gelişimine katkıda bastırmak için hareket TolDCs içine farklı. TolDCs son ilerlemesi anlayışımız içinde DC tolerans ayırt etme durumları oransal tarafından elde edilebilir öneriyor. Bu olay TolDC tedaviler çok sayıda bağışıklık bozuklukları nedeniyle neden olduğu bağışıklık toleransı kırmak için gelişmekte olan muazzam büyüme yol açmıştır. Preklinik otoimmünite fare modelleri başarılı çalışmalar daha da TolDCs immunotherapeutic yardımcı programı otoimmün hastalıklar tedavi doğrulanmış var. Bugün, TolDCs kliniğinde çeşitli bağışıklık hastalıkları bağışıklık toleransı koruyucu bağışıklık olduğu gibi bırakarak patojenik otoimmün yanıtları hedefleyerek geri getirmemesi için umut verici bir immunotherapeutic aracı haline gelmiştir. Stratejilerinin bir dizi TolDCs ikna etmek için birden fazla labs tarafından önerilen, orada olsa da hiçbir tutarlılık bu hücrelerinin hücresel ve fonksiyonel fenotip karakterize. Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi DCs çok sayıda, onları bir sentetik triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic TolDCs ayırt etmek için kullanılan benzersiz bir yöntem geliştirilmesi için adım adım yönergeler sağlar asit-difluoro-propil-Amid (CDDO-DFPA) ve TolDCs temel moleküler imza analizleri de dahil olmak üzere kendi fenotip onaylamak için kullanılan teknikler. Son olarak, biz onların immünsüpresif yanıt vitro ve in vivo preklinik manken multipl skleroz test ederek TolDC işlevini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Farklılaşma ve BMDCs seçimi:
Kemik iliği progenitör hücre GM-CSF ve Il-4 iDCs 7 gün (Şekil 1A) ayırt etmek için tam RPMI ortamda kültürlü. Gün 1, hücreleri küçük içinde büyüklük ve küresel morfoloji gösterdi. Önce gün 3 taze orta yerine hücreleri form kümeleri için yardımcı oldu ve aynı zamanda CD11c nüfusu arttı PBS ile yıkama+ hücreleri. Günde 4, BMDCs boyutunda büyütülmüş ve küme formasyonu başlattık. Yapıştırılan makrofajlar Ayrıca dönüştürülür ve uzun bir şekil ile tabak dibinde görülmektedir. 5 günde BMDCs büyük ölçekli kümeleri oluşturulur. Gün 6, çok sayıda yarı yapışık ve kayan BMDCs de tespit edildi. BMDCs 7 gün hasat ve CD11c ifade belirli bir işaret olarak fare DCs için akış sitometresi tarafından analiz edildi. Şekil 1Btemsilcisi akış sitometresi mezarlığına gösterildiği gibi yaklaşık CD11c ifade BMDCs yüzde 83.6 Bu yöntemle elde edilmiştir.
İndüksiyon ve TolDCs genetik karakterizasyonu:
Bazı TolDCs, D3 vitamini38 ve deksametazon39gibi ikna etmek için bilinen ajanların aşağı düzenleyen-DC yüzey ligandlar MHC II ve costimulatory molekülleri, CD40, CD80 ve CD86 de dahil olmak üzere, ifade için bilinen. Buna karşılık, ya LPS bağlamında veya CD40L kaynaklı olgunlaşma DCs, kalsinörin inhibitörü cyclosporin A ve FK506 CD83, CD80, CD86 ve MHC II33ifade üzerinde hiçbir etkisi gösterdi. Akış Sitometresi Analizi tarafından gösterildiği gibi TolDC CDDO-DFPA tarafından indüksiyon yüzey ligand LPS kaynaklı ifade DC'lerin CD80, CD86, MHC II, PD-L1 ve CD40 dahil olmak üzere, üzerinde önemli bir etkisi vardı. (Şekil 2).
Ayrıca, karşılaştırmalı transcriptome ve sitokin analiz için BMDCs veya CDDO-DFPA olmadan huzurunda tedavi veya LPS yokluğu modüle inflamatuvar gen profil tasvir. CDDO-DFPA tedavi azaltılacağını indüklenen LPS pro-inflamatuar sitokin genleri gibi IFN γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 ve IL-23 (Şekil 3A-3F). Bunlar Th1 için sitokinler bilinir (IFN γ ve IL-12) ve Th17 hücre farklılaşması (IL-6 ve IL-23). Ayrıca, CDDO-DFPA anti-inflamatuar sitokin gen Il-4 gibi gelişmiş ifade gösterdi BMDCs tedavi IL-10, TGF-β ve HO-1 (Şekil 4A-4D). Bu anti-enflamatuar genlerin Th2 teşvik ederek otoimmünite modülatör bilinmektedir (IL-4) ve Treg (IL-10 ve TGF-β) hücre farklılaşma. 40 burada ayırt edici IL-12−; IL-10+ sitokin üretim36, HO-1 ifade13indüksiyon ve EDN-141 inhibisyonu indüklenen tarafından CDDO-DFPA tedavi, tüm unutmamak önemlidir DCs tolerogenic işlev kimliğini doğrulamak için bilinir.
TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu içinde vitro
DC-aracılı T hücre çoğalması sitokinler ve çözünür arabulucu7salgılanmasını yanı sıra costimulatory yüzey ligand nişan tarafından tetiklenen olduğu bilinmektedir. Ancak, TolDCs T hücre yanıt-e doğru çeşitli mekanizmalar aracılığıyla inhibe: T hücre anerji, silme işlemini autoreactive hücrelerin aktif olarak teşvik ve polarizasyon saf T hücre Tregs42teşvik inducing tarafından. Biz zaten CDDO-DFPA fonksiyonel karakterizasyonu TolDCs37indüklenen bildirdin. T hücre anerji ve silme autoreactive T hücrelerinin bağımsız olarak yüzey işaretleyicileri veya Annexin V/7-AAD boyama kontrol ederek çözümlenebilir. Ancak, dolaylı olarak bu fenotip T hücre proliferasyonu Dizin ölçerek doğruladık. Bunun için C57BL/6 OTII transgenik fareler T hücreleri kullanılmaktadır ve onları C57BL/6 fare--dan hulâsa ve veya CDDO-DFPA olmadan tedavi syngeneic DCs maruz. Bu DCs yıkanmış ve T hücreleri ile OVA peptid lekeli CFSE ile birlikte kültürlü. T hücre çoğalması tarafından CDDO-DFPA önceden tedavi DCs, onların tolerogenic fenotip (Şekil 5) düşündüren önemli bir azalma görülmektedir.
Vivo fonksiyonel TolDCs otoimmünite, preklinik modeli karakterizasyonu
Son olarak, DFPA kaynaklı TolDCs işlevselliğini herhangi preklinik vivo içinde modelleri ile karakterize otoimmün veya inflamatuar özellikleri test edilebilir. Beri EAE klinik immün aracılı merkezi sinir sistemi hastalığı, MS43yaygın olarak kabul edilen preklinik fare modeli, bu bizim çalışmada kullanılan. Daha fazla vivo içinde incelemek için CDDO-DFPA işlevselliğini indüklenen TolDCs, biz onları pasif EAE bir preklinik fare modelinde meydan. Bunun için BMDCs veya CDDO-DFPA olmadan LPS ve MOG (35-55) varlığında kültürlü. Bu hücreler daha sonra zamanlanmış Protokolü Şekil 6A içinde tasvir olarak tekrar tekrar enjekte edildi ve fareler rutin klinik belirtiler tezahürü için gözlendi. Beklendiği gibi LPS ve MOG (35-55) BMDCs EAE, klinik belirtileri gösterdi ancak geniş puls; CDDO-DFPA BMDCs tedavi gösterdi grup gecikmeli başlangıçlı hastalığı önemli ölçüde azaltılmış klinik belirtiler (Şekil 6B) ile astarlanmalıdır. Bu sonuçlar TolDCs CDDO-DFPA tedavi tarafından indüklenen immünsüpresif fenotip doğrulayın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig1.jpg"> Şekil 1: geliştirme ve BMDCs fenotipik karakterizasyonu: (A) kemik iliği hücreleri C57BL/6 fareler tibia ve uyluk kemiklerinden fışkırma ve daha fazla BMDCs için Ayrıştırılan. Bir uygun hücre kümesi oluşum tarafından ışık mikroskobu farklılaşma (ölçek çubukları, 100µm) tüm dönem takip edildi. (B) BMDCs farklılaşma FACS tarafından analiz gibi CD11c yüzey ifade tarafından doğrulandı. Grafikler tasvir genişletilmiş CD11c yüzdesi+ hücre nüfus. (C) Gating strateji BMDCs. hücre ilk enkaz (FSC vs SSC) dışlamak için kapı. Bir gelir dışlama kapı üzerinde gömlek hücreleri (FL2-A vs. FL2-W) kapı için kullanılmıştır. Singlet hücrelerde canlı hücreleri 7-AAD Arsa (FSC vs 7-AAD) üzerinde kapı. Sonra hücreleri daha fazla analiz ve CD11c ifade üzerinde kapı. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig2.jpg"> Şekil 2: DC hücre yüzey ligand ifade CDDO-DFPA tarafından değiştirilmemiş. Hücreleri varlığı veya yokluğu CDDO-DFPA önceden tedavi (200 nM) stimülasyon LPS ile önce 1 saat (100 ng/ml) 24 için gönderilen. Hücre yüzey ifade CD80, CD86, MHC II, PD-L1 ve CD40 akış sitometresi tarafından analiz edildi. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig3.jpg"> Şekil 3: CDDO-DFPA değişmiş immünojenik DCs. BMDCs genetik ve protein fenotip varlığı veya yokluğu CDDO-DFPA (50-400 nM) yanı sıra LPS önce 1 saat önceden tedavi edildi (100 ng/ml), ve de RNA çıkarma (4 için hasat HRS.) veya koşul kültür ortamına 24 için izin gönderilen. sitokin analizleri için koleksiyon önce. IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) ve IL-23 (F) düzeyde qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçüldü. Oysa IFN-γ (A) düzeyini qRT-PCR ve ELISA yalnız tarafından EDN-1 (C) tarafından ölçüldü. Sonuçları Ortalama ± SD üç deney ifade edilir. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 LPS tedavi grupları ile karşılaştırıldığında. Unpaired öğrenci t-testi. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Yeniden oluşturulmalı ve telif hakkı izni ile yayınlanacaktır." <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig4.jpg"> Şekil 4: CDDO-DFPA indüklenen TolDCs fenotip gen ve protein ifade tarafından doğruladı. BMDCs CDDO-DFPA (10-400 nM) içinde önceden tedavi LPS eklenmesi önce 1 saat (100 ng/ml), ve hücrelerin RNA çıkarma sonra 24 için hasat gönderilen. Il-4 (A), IL-10 (B) ve TGF-β (C) düzeyde qRT-PCR tarafından ölçüldü. (D) hücre proteini lysates 12, toplanan gönderilen. analizleri ve HO-1 ve β-aktin düzeyleri için ifade Western blot tarafından tespit edilmiştir. Sonuçları Ortalama ± SD üç deney ifade edilir. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 LPS tedavi grupları ile karşılaştırıldığında. Unpaired öğrenci t-testi. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig5.jpg"> Şekil 5: CDDO-DFPA maruz DCs T hücre çoğalması bastırmak. DCs 1 saattir CDDO-DFPA (100-400 nM) ile önceden tedavi olsaydı, o zaman yıkanmış ve işbirliği ile kültürlü CFSE lekeli T hücreleri bir 1:10 at oranı. (A) dalak T hücreleri ve DCs sırasıyla C57BL/6 OTII transgenik fareler ve C57BL/6 fare, izole edildi. CDDO-DFPA CFSE ile ön işleme DCs Co kültürlü lekeli T hücreleri (w) ile veya olmadan (w) OVA ek kuluçka sırasında. T hücre çoğalması akış sitometresi tarafından 2 gün tespit edilmiştir. Grafikler yüzde sayı T hücre bölünmesi göre T hücre bölünmesi olarak tasvir. Verileri 3 bağımsız deneyler, bir gösterimidir. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig6.jpg"> Şekil 6: MOG astarlanmalıdır DC kaynaklı pasif EAE TolDCs tarafından kaldırıldı. (A) EAE indüksiyon MOG (35-55) tarafından-BMDCs. CDDO-DFPA içinde olgun BMDCs tedavi Geniş puls (400 nM) ve daha sonra MOG (35-55) ile 4 için Darbeli gönderilen. 2 × 106 hücre 200 μl toplam C57BL/6 farelerin Subkutan Enjeksiyon kanat bölge içine bir kez her hafta dört enjeksiyon toplam tarafından yönetiliyordu. Her zaman PTX hemen ve tekrar 2 gün sonra (gün 0 4 döngüsü) ı.p. enjeksiyon tarafından yönetiliyordu. (B) klinik puanları standart ölçütleri kullanarak kaydedilmiş tüm sonra dört iğneler vericiydi. Tüm veriler ortalama ± S.E.M. sunuldu * P < 0,05. Holm-Sidak analizi ile birden çok t-testi (n = 7 fareler her grup). Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Görüntüleme.  Case Western Reserve University. Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Video: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentasyon ve Mürin Obezite Modelleri Yağ Hacimleri ölçümü X-ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Tıp

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

Ortotopik Akciğer Transplantasyonu bir Mürin Modelinde Obliteratif Bronşiolit Gelişimi

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

Fare Kolorektal Afferent Endings in vitro Fonksiyonel Karakterizasyonu içinde

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...