Bu araştırma bölümlerinde NIH hibe HL66299 TH, RB ve SL, HL60024 TS ve MF HL136869 tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan yordamları incelendi ve kurumsal ve hayvan bakımı Komitesi South Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmış ve tüm federal, eyalet ve yerel düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVECs) birincil kültürleri akciğer biyoloji için University of South Alabama'nın merkezi hücre kültür çekirdek tesisinden elde edilmiştir. Hücre yukarıda açıklanan yordamları16kullanılarak hazırlanmıştır.
1. nesil sitotoksik Supernatants
Not: Burada, P. aeruginosaiki farklı soyu kullanırız: ekzoenzimlerden ExoU ve ExoT enfeksiyon ve ∆PcrV, bir tür III salgı sistemi yoksun ve sırasında hedef hücrelere aktarma yetenekli bir bozulmamış türü III salgı sistemi olan PA103 ekzoenzimlerden aşı takip hedef hücrelere aktarma aciz.
<ol><li>Bakteri Vogel-Bonner (VB) ağar kaplamalar17 üzerine çizgi ve 37 ° C'de gecede büyümek<ol>
<li>Tabak hazırlamak için aşağıdaki hisse senedi çözüm (Vogel-Bonner tuzları; 10 x hisse senedi) olun: ölçmek 2 g MgSO4, 20 g sitrik asit (ücretsiz), 100 g K2PO4ve 35 g NaH2PO4. GKD2O 1 L ve basınçlı kap 15dk yavaş egzoz ile için ekleyin.</li>
		<li>450 mL GKD2O 7.5 g agar ve yukarıdaki gibi basınçlı kap koyun.</li>
		<li>Isıyla her iki çözüm de soğutmak için 50 ° C su banyosu yerleştirin.</li>
		<li>10 x VB hisse senedi tuz solüsyonu 50 mL agar için ekleyin.</li>
		<li>Carbenicillin 400 µg/ml (için kullanılan P. aeruginosa suşlarının) ve de şişeye dönen tarafından karıştırın.</li>
		<li>Bireysel steril kültür yemekleri, VB agar çözümde yer 5 mL agar kuvvetlendirmek ve 4 ° C'de bakteriyel tohum güne kadar saklamak izin verir.</li>
		<li>Bakteriyel tohum gün, önceden bir tabak 37 ° c sıcak ve bakteri steril bir döngü kullanarak plaka üzerine çizgi. Yer 37 ° C kuluçka plaka bir gecede.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pozitif floresan griffona simplicifolia ile boyama tarafından PMVEC saflık doğrulayın lektin ve floresan ile negatif boyama Helix pomatia lektin (arteriyel endotelyal hücreler için bir işaretleyici). Aliquot hücreleri ve sıvı azot dondurucuda.</li>
	<li>Deneyler için hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum ile desteklenmiş DMEM) korumak ve hücreleri içeren % 5 CO237 ° C kuluçka büyür. Hücreleri pasajlar 5-15 kullanın.<ol>
<li>Sitotoksik supernatants nesil, 2 x 106 hücreler bireysel 150 cm yemekleri plaka ve 3-4 gün için izdiham elde kadar büyür. Deney (aşağıya bakın) başına iki tabak kullanın.</li>
		<li>Sitotoksik supernatants çözümlenmesi için plaka 1 x 105 6-iyi bireysel kuyu hücrelere çanağı ve dört gün izdiham elde kadar büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant üretmek için bir PMVECs iki 150 cm yemekleri adım 1.3.1 fosfat tamponlu tuz ile yıkama, trypsinize ve sonra hücreleri saymak (Biz bir otomatik hücre sayacını kullanın ve üreticinin iletişim kuralı izleyin; Tablo reçetesibakın). PMVECs ile Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) diğer bulaşık yıkama ve P. aeruginosa enfeksiyon (MOI) 20:1 çokluğu, ya suşu ile enfekte. Bu şekilde elde edilir:<ol>
<li>P. aeruginosaiçin OD540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. Bu seyreltme hazırlamak için 1 mL tek kullanımlık küvet 1 mL HBSS ekleyin. Yeterince bakteri 0,25 OD540 bir spektrofotometre kullanarak ölçülen zaman elde edilir kadar 1.1 adımda hazırlanan tabak kapalı kazımak. Bir sonraki adım ne kadar bakteri gerekli olacak bir hesaplama sağlar.</li>
		<li>PMVECs kültür tabağına sayısı belirlendikten sonra (1.4 yukarıdaki adım), bakteri PMVECs içeren ikinci, Sigara trypsinized kültür yemek için eklenecek uygun sayısını belirleyin. Örneğin, PMVECs kültür tabak 1.3 x 107 hücreleri içeren, sonra 1.3 x 107 hücreleri x 20 bakteri/hücre x 1 mL/2 x 108 CFUs hazırlamak belirlediyseniz 1.3 mL bakteri =.</li>
		<li>150 cm çanak tüm yüzeyine sıvıyla kaplı, sonra seyreltilmiş bakteri PMVECs plakasına eklemek bakterilerin 1.3 mL HBSS 20 mL, son bir birime oranında seyreltin.</li>
		<li>Kuluçkaya boşluklar plaka olarak gözlenen hücre monolayer şekillendirme görülebilir kadar % 5 CO2 kuluçka için 4-5 h, 37 ° C'de bakteri ile aşılanmış PMVECs (bkz: Şekil 1 uygun düzeyde boşluk oluşumu için).</li>
		<li>Süpernatant toplamak sonra hücresel enkaz kaldırmak için masa üstü bir santrifüj 2.000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi. Not: Herhangi bir masa üstü santrifüj üreten yeterli G'lik zorla unlysed hücreleri ve büyük hücreli parçaları-ebilmek var olmak kullanılmış için bu adımı cips için.</li>
		<li>Süpernatant süpernatant bakteri kaldırmak için filtreden geçmek sonuna, sonra bağlı 0.2 µm filtresi olan bir şırınga içine dökün.</li>
		<li>Bir aliquot, steril süpernatant sitotoksisite sınamak için kullanın (bkz. 2.1) ve kalanı süpernatant ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sitotoksik Supernatants Analizi
<ol><li>Sitotoksisite tahlil<ol>
<li>6-iyi yemekler PMVECs izdiham kadar büyür. Yıkama wells bir kez HBSS ile daha sonra 1,5 mL (ya PA103 ya da ∆PcrV aşısını hücrelerden toplanan) filtre sterilize süpernatant bireysel wells için ekleyin. Steril HBSS başka bir şey için bir negatif kontrol ekleyin.</li>
		<li>21-24 h CO2 kuluçka plaka yerleştirin, sonra hücre öldürme/sitotoksisite için gözlemlemek (sonraki adıma bakın). Sitotoksisite daha fazla deneme için sergi supernatants kullanın ve bu da hücre öldürme gösterme atın.</li>
		<li>Hücre öldürme Nefelometri<ol>
<li>Ölçü laktat dehidrogenaz (karaciğer) serbest piyasada bulunan karaciğer tahlil kitleri ve üretici kullanarak ölü hücrelerden yordamlar önerilir.</li>
			<li>Alternatif olarak, hücre öldürme mikroskobik ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek. Bunun için kayıt mikroskobik görüntüleri ve sağlam hücreleri içeren kültür yemek alanları, sonra hücreler (hücre ölümü bir monolayer gösterge) eksik bölgelerin ölçmek özel bir ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) makro (bkz: ek kodlama dosya kullanarak ). İsterseniz, el ile aşağıdaki gibi makro adımları izleyin:<ol>
<li>Görüntüleri (RGB veya TIFF biçiminde) makro girdi ve doymuş % 15 piksel için karşıtlığı ayarlayın. Kontrast-düzeltilir görüntüleri çoğaltın ve hücre ve gap alanı görüş alanı içinde yüksek karşıtlık görüntüsünü elde etmek için "arka plan çıkarmak" komutunu gerçekleştirir.</li>
				<li>Bu görüntü orijinal görüntüden çıkarma ve ortaya çıkan görüntü görüntü hesap makinesi "Ve" işlevi kullanarak orijinal görüntü ile birleştirir. Siyah (boşluk) ve beyaz (hücreler) maskesi ile eşik görev (en az 0, en çok 5) sonuç görüntü dönüştürmek ve gürültü yansımadan kaldırmak için "ikili aşındırmak" işlevini kullanın.</li>
				<li>Siyah beyaz piksel "alan kesir" ölçüm kullanarak sonuç görüntü içinde için oranını ölçmek. Arsa ve kesirli alanlar her tedavi süresi noktası için maksimal gap alanının yüzde ifade eder.</li>
				<li>Anlamına gelir hesaplamak ve Tukey'nın öğleden hoc testi, p değerleri anlamlı kabul 0,05 daha az ile tek yönlü ANOVA kullanarak karşılaştırın.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>İmmunoblot analiz varlığı amiloid, oligomeric tau ve Aβ kültür supernatants kurmak için kullanın. Kültür supernatants en az 10 kat Elektroforez önce konsantre dışında standart prosedürler10,11,12, kullanan immunoblot çözümlemesi gerçekleştirin.<ol>
<li>Süpernatant konsantre için 1-2 mL süpernatant olan membran 10 kDa molekül ağırlığı cut-off vardır Santrifüjü filtre ünitesi yerleştirin. Filtre ünitenin görüntülenmemesini bir masa üstü santrifüj ve santrifüj 2.000 x konsantrasyon gerekli derecesine kadar g (genellikle 45-60 dakika) elde.</li>
			<li>Konsantre süpernatant11 protein miktarını belirlemek ve örnekleri eşit miktarda jel bireysel kuyu yükleyin.</li>
			<li>Jelleri çalıştırmak, proteinler nitroselüloz için daha sonra A11 Anti-amiloid antikor, T22 Anti-oligomeric tau antikor veya uygun ikincil antikorlar tarafından takip MOAB2 anti-Aβ antikor lekesi sonda. Standart Kemiluminesan yordamları kullanarak lekesi geliştirmek.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir thioflavin T tahlil yapmak için supernatants içinde amyloids ölçmek için thioflavin T Floresan (ThT) kullanın. Bu ölçümler için filtre sterilize supernatants kullanın.<ol>
<li>Thioflavin T stok çözeltisi (50 x) 8 mg thioflavin T (ThT) askıya tarafından 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak. Karıştırma sonra çözüm parçacıklar kaldırmak için 0,22 µm filtre ile filtre.</li>
			<li>Ölçümler için PBS 1 mL spektrofotometre küvet içinde 1 mL 20 µL ThT stokunun ekleyin. Seyreltilmiş örnek bir spectrofluorimeter yerleştirin.</li>
			<li>425 nm uyarma kullanarak ve floresan emisyon 450-575 nm 2 nm aralıklarla üzerinden tarama temel floresans emisyon ölçmek.</li>
			<li>425 nm uyarma kullanarak zaman atlama tarama gerçekleştirmek ve verileri ile 482 nm Emisyon elde her 0,2 s 60 s.</li>
			<li>İlk 20 s zaman atlama tarama ölçer floresans boş küvet içinde. 20 s, tarama duraklatmak ve filtre sterilize süpernatant ile 10 µL küvet için ekleyin. Küvet INVERSION tarafından karıştırın ve geri spectrofluorimeter yerleştirin.</li>
			<li>Son 40 edinme zaman aşamalı tarama devam s veri.</li>
			<li>Zaman atlama tarama tamamlandığında, ayrıntılı olarak 2.1.5.3 aynı ayarları kullanarak bir son floresans emisyon spektrum taraması gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction.">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li><li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia.">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li><li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis.">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease.">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li><li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li><li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease.">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li><li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

Rapor için hiçbiri.

Burada, basit vitro yöntemleri gösteri sitotoksik amyloids nesil enfeksiyon sırasında organizma neden bir pnömoni ile izin özetlenmiştir. Bu yöntemler içerir bir hücre kültür sitotoksisite tahlil, immunoblotting, Nefelometri hücrenin bir roman mikroskobik yöntemi ve ThT bağlama kullanarak öldürme. Sitotoksik ajanlar analizleri amiloid doğada (Şekil 2 ve Şekil 4) vardır ve bir deli dana12özellikleri sergi gösterdi. Sitotoksik prion moleküller oluşturma sırasında zatürre pnömoni ölüm onların Hastanesi deşarj takip gözlenen yüksek ölüm oranları için potansiyel bir açıklama sağlar. Deneyler devam eden bu olasılığı test ediyoruz.
Sitotoksik süpernatant nesil tüm açıklanan çalışmaları için anahtar olayıdır ve iki önemli değişkenler dikkate alınması gerekir. İlk olarak, Seviyelendirilmiş deneyler köstebeğiyle PMVECs enfeksiyon adımı için ve sitotoksisite tahlil için kullanılmıştır. Diğer hücre tipleri Sitotoksin üretimi için kullanılan olabilir ayrıntılı olarak araştırmış değil, ve diğer hücrelerin sitotoksik supernatants tedavi çeşitli P. aeruginosasuşlarının ile aşağıdaki oluşturmak mümkün olabilir mümkündür. Görüldüğü gibi Sitotoksin amiloid doğada ve oligomeric tau ve Aβ içerir. Tau ve/veya beta amiloid protein hızlı diğer hücre tipleri her ne kadar test edilecek bu olasılığı kalır bakteri aşılama, takip Sitotoksin oluşturmak için indüklenen beklemek mantıklı olabilir. Diğer hücre tipleri farklı hakaret takip sitotoksik amyloids üretmek için bağlı olup olmadığını anahatlı yordamları incelemek için kullanılabilir.
İkinci önemli sitotoksik supernatants nesil bakteri ile tedavi süresi değişkendir. PMVECs kuluçka boşluklar içinde monolayer görülebilir kadar ilerleme izin verilmesi esastır. Hücre monolayer boşluklar bir gösterge ekzoenzimlerden Pseudomonas bakterileri tarafından ana hücre sitoplazma enjekte edilmiş ve ekzoenzimlerden hücre kenarlıkları (Şekil 1) geri içinde çekilmesi sonucu etkin olan tanımlamasıdır. Bizim deneyimdir hücre kenarlıklarını geri çekme süresi noktası Sitotoksin yayın süpernatant içine, güvenilir bir göstergedir. O iki olay oligomeric tau serbest bırakılması sitotoksik amyloids biridir ve hücre şekil değişiklikleri için katkıda Mikrotubul bozulumu tau faaliyet bozulma sonuçları olarak ilgili spekülasyon için cazip olduğunu. Nerede tedavi boşluk oluşumu ikna etmek için gereken süreyi daha az olan deneylerde, küçük olgun sitotoksik amiloid algıladı.
Bu el yazması açıklanan sitotoksisite tahlil basit ve güvenilir olduğunu. Hücre ölümü kolayca mikroskobik bir sınava gözlenen ve kaydedilen mikroskobik görüntüleri doğrudan sayılabilir. Burada açıklanan yöntemleri sadece enfeksiyon sıçan pulmoner endotel hücre P. aeruginosaile takip Sitotoksin üretim değerlendirmek için kullanılmaktadır. Olası yordamları sitotoksik amyloids nozokomiyal ilişkili her ikisi de dahil olmak üzere neden diğer zatürree ile enfeksiyon üretilen değerlendirmek için kolayca adapte olabilir görünüyor bakteri ve bakteri ve virüsleri sorumlu Zatürree türleri topluluk satın aldı. Ayrıca, bildirilen yordamlar yalnızca sitotoksik amiloid dil üretimi sırasında enfeksiyon kültürlü hücre incelemek için kullanılmaktadır. Hücre kültürü yapay bir sistemdir ve büyük olasılıkla burada özetlenen yordamlar Sitotoksin oluşturma sırasında hayvan modelleri ve insan hastaların pulmoner enfeksiyon değerlendirmek için adapte olabilir. Enfekte hayvan veya hasta bronchoalveolar lavaj gibi biyolojik sıvı toplanması sitotoksik amyloids enfeksiyon sürecinde içinde vivo oluşturulan olup olmadığını değerlendirmek için rapor burada deneyleri aynı türden kullanılabilir. Açıkçası, bakteri ile kuluçka sürelerini hayvana aşı zaman oldukça farklı olabilir ve bronchoalveolar lavaj tedavi nihai süresi belirlemek için birden çok zaman noktada toplanan olması gerekir.
Immunoblot analizleri oligomeric tau ve Aβ (Şekil 3) dahil olmak üzere supernatants içinde amyloids olduğunu gösterdi. İmmunoblot yordamları standart olmakla birlikte, immunoblot analizleri başlatılıyor önce gerçekleştirilmesi gereken önemli bir adım vardır. Özellikle, bu algılama immunoblot Analizi tarafından sınırın altındaki amiloid içinde un konsantre süpernatant miktarı olduğu gibi supernatants en az on immunoblotting önce konsantre olması önemlidir. Burada rapor gibi Santrifüjü kullanarak bir filtre ile donatılmış tüpler bu konsantrasyon adım için rutin olarak kullanılan yöntemdir, ancak bu TCA yağış gibi diğer yöntemleri eşit olarak bu adımı için yararlı olur makul görünüyor.
Görüntüleri kullanarak öldürme hücre Nefelometri önemli avans temsil eder. Şu anda hücre ölümü miktarının için kullanılabilir yordamlar karaciğer serbest bırakmak--dan ölü hücreleri ölçümü izin oldukça pahalı kitleri satın alma güveniyor. ImageJ programları NIH Web sitesinden indirmek için ücretsiz olarak burada açıklanan tahlil hiçbir maliyeti içerir. ImageJ programlar basit uyarlaması hücre öldürme oldukça hassas ölçüm sağlar. Ancak, bu küçük eserler birkaç anahatları belirlenmiş iletişim kuralı performansını sırasında karşılaşılan işaret değer. Odak kişisinin alanlar gibi hücre parçaları olarak hücreleri die kültür çanak ile ilişkili kalabilir önemli konudur. Bu kalıntı hücre parçaları kamera tarafından tespit edilebilir ve hücreleri çanak üzerinde kalır yapay bir göstergesi. Bu nedenle, değeri % 100 hücre öldürme, bu yordamı kullanarak elde edilir nadirdir.
Bir bildirilen tahlil sisteminin Sitotoksin amyloids hazırlık asla tamamen tanımlanmış olan zayıflıktır. Bu nedenle, Nefelometri zordur. ELISA deneyleri her hazırlık bireysel türler hakkında detaylı herhangi bir bilgi vermeden farklı amyloids, toplam düzeyde sağlamak için kullanılabilir. Kadar daha kesin deneyleri, öyle aynı derecede kitle-spec veya içinde vitro amiloid reaksiyonlar sentez, geliştirilebilir, şu anda yapabileceğiniz en iyi her deney aynı sayıda hücre ile başlamak için aynı süre için kuluçkaya ve doğrulayın kullanılmış olan önceki hazırlıkları gibi aynı fiyatlara sitotoksisite oluşur. Değişim herhangi bir normları kurulan ek belirsizlik tanıttı.
Özetle, zatürre neden olan Ajan ile enfeksiyon takip pulmoner endotel hücreleri tarafından toksik amiloid moleküllerin üretimini gösteren için basit vitro yöntemleri açıklanmaktadır. Deneyleri güvenilir ve büyük olasılıkla diğer organizmalar için ve biyolojik sıvı enfekte hayvan ve insan hasta elde kullanarak kullanmak için adapte edilebilir. Bu yöntemler pnömoni uzun vadeli sonuçları araştıran çalışmalar ve uç-organ yetmezliği hastalarda hastane deşarj ardından yol açan mekanizmalar kurmak için faydalı olacaktır.

Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj1,izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek2,3,4,5,6. Çoğu durumda, ölüm de dahil olmak üzere böbrek, akciğer, kalp, uç-organ yetmezliği veya karaciğer olaylar yanı sıra inme5,6çeşit tarafından oluşur. Bu hasta popülasyonda yüksek ölüm oranı nedenini asla kurmuştur.
Zatürre de topluluk-elde olarak sınıflandırılır veya hastane edinilen (nozokomiyal) ve zatürre neden olabilir ajanlar bakteri, virüs, mantar ve kimyasallar içerir. Bakteri Pseudomonas aeruginosanozokomiyal pnömoni önemli nedenlerinden biridir. P. aeruginosa doğrudan hedef hücreleri7,8sitoplazma için ekzoenzimlerden olarak adlandırdığı çeşitli efektör moleküllerin aktarmak için bir tür III salgı sistemi kullanır Ayagin Gram-negatif bir organizmadır. Pulmoner endotel hücreleri enfeksiyon sırasında ekzoenzimlerden endotel bir formu Mikrotubul ilişkili protein tau9,10,11,12 de dahil olmak üzere çeşitli hücre içi proteinlerin hedef. , ağır pulmoner ödemi kaynaklanan endotel bariyer arıza lider, pulmoner fonksiyon ve oftentimes, ölüm düşmüştür.
Daha önce belirtildiği gibi ilk pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj takip ilk 12 ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Bu fenomeni açıklamak için bir potansiyel uzun ömürlü toksin bazı tip zavallı uzun vadeli sonuca yol açar ilk enfeksiyon sırasında oluşturulan bir mekanizmadır. İki gözlem bu olasılığı destekler. Bakterilerin antibiyotik13tarafından öldürdükten sonra bir hafta için çoğalırlar başlangıçta P. aeruginosa ile kabul edilen ilk, kültürlü pulmoner endotel hücreleri başarısız. İkincisi, uzun ömürlü prionlar ve aracıları prion özelliklere sahip çeşitli insan ve hayvan hastalıklarında, özellikle sinir sistemi14,15ile ilişkili hastalıklar gösterdi.
Uzun ömürlü sitotoksik ajanlar potansiyel üretim akciğer enfeksiyonu sırasında İnceleme yöntemleri hiç tarif edilmistir. Burada özetlenen basit vitro deneyleri bir dizi kullanılabilir Sitotoksin üretim ve enfeksiyon bir ortak zatürre neden Ajan, P. aeruginosakullanarak aşağıdaki etkinlik araştırma için. Bu deneyleri enfeksiyon zatürre neden diğer aracıları kullanarak aşağıdaki olası Sitotoksin indüksiyon araştırmak için kolayca adapte olmalı ve üretilen supernatants-meli da var olmak tamamen Sitotoksin etkilerini araştıran için yararlı organ ya da hayvan. Son olarak, büyük olasılıkla burada özetlenen deneyleri hayvan ve insan biyolojik sıvıları Sitotoksin üretimi sırasında zatürree için test etmek için adapte olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

Pnömoni hayatta hastaların hastane deşarj izleyen ay içinde ölüm oranları yüksek sahip. Pnömoni sırasında akciğer doku enfeksiyonu sonraki uç organ yetmezliği yol açabilir uzun ömürlü Sitotoksin üretiminde sonuçları olan. Sitotoksin akciğer enfeksiyonu sırasında üretilen hipotezi test etmek vitro deneyleri geliştirdik. İzole sıçan pulmoner endotel hücreleri ve bakteri Pseudomonas aeruginosa model sistemleri olarak kullanılır ve endotel hücreleri enfeksiyon bakteri tarafından takip cytoxins üretim ve ardından hücre kültürü kullanarak gösterilmiştir doğrudan Nefelometri laktat dehidrogenaz deneyleri ve bir roman mikroskobik yöntemi kullanmak ImageJ teknoloji kullanarak. Bu Sitotoksin amiloid doğası thioflavin T bağlama deneyleri ve immunoblotting ve A11 Anti-amiloid antikor kullanarak immunodepletion tarafından sunuldu. İmmunoblotting kullanarak daha fazla analizleri oligomeric tau ve Aβ üretilen ve endotel hücreleri enfeksiyon P. aeruginosatarafından takip tarafından yayımlanan olduğunu gösterdi. Bu yöntemler için insan klinik örneklerin analizleri kolayca adapte olmalıdır.

Sitotoksin supernatants P. aeruginosabakteri ile enfekte hücre içinde varlığı için tahlil için bir basit vitro tahlil geliştirilmiştir. Temel olarak, enfekte hücreleri kültür ortamından 4 h bakteriyel eklenmesinden sonra toplanır, bakteri filtresi sterilizasyon süpernatant kültürünün tarafından kaldırılır ve daha sonra steril süpernatant hücreleri yeni bir popülasyon için eklenir. Hücreleri sonra süpernatant eklenmesi sonra 21-24 h gözlenir ve hücre öldürme sayılabilir.
P. aeruginosa ilavesi PMVECs konfluent katmanları için hücreleri arasındaki boşlukları oluşumu neden olmaktadır. Vivo, boşluk oluşumu akciğer ödemi ve azalmış akciğer fonksiyon yol açar. Sitotoksin yayın içine hücre kültür supernatants ve yeterli PA103 ile kuluçka süresi için zaman noktası filtreleme için varlığı ile gösterildiği gibi hücre monolayer formunda başlar boşluklar belirtildiği şekilde açıklanan assay olarak, boşluk oluşumu kullanılır Şekil 1. ΔPcrV bakteri hücre boşlukları bu kuluçka koşullarda neden değil. Bir kez boşluklar tespit edilir, süpernatant olduğunu toplanan, filtre sterilize ve naif PMVECs sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için eklendi. Onların anılan sıraya göre supernatants PMVECs sonra 21-24 h için bir kuluçka yerleştirilir ve sonra gözlenen ve fotoğraflandı. Şekil 2' de gösterildiği gibi P. aeruginosa gerilme PA103 ile enfekte olmuş PMVECs üzerinden toplanan süpernatant kültürlü hücre ölüm indüklenen tarafından 21 h süpernatant eklenmesi sonra Sitotoksin içeriyordu. Buna ek olarak, hücre ölüm yok ya HBSS orta veya Pseudomonas ΔPcrV zorlanma toplanan süpernatant ile tedavi kontrol hücreleri gözlendi. Immunoblot analiz hiçbir amyloids PMVECs (Şekil 2) aşı takip ΔPcrV zorlanma tarafından oluşturulan iken amiloid molekülleri oligomeric tau ve Aβ, dahil olmak üzere, PA103 gerginliği, mantar enfeksiyonu sırasında oluşturulan olduğunu gösterdi. Amyloids rolüyle bu tahlil Sitotoksin kültürlü hücreler12süpernatant ek önce gelen amyloids immunodepletion tarafından doğrulanmıştır. Her ne kadar burada gösterilmeyen, sitotoksik süpernatant A11 Anti-amiloid antikor ve T22 Anti-tau oligomer antikor tamamen kullanarak, immunodepletion supernatants PA103 enfeksiyonu (Balczon ve ark. 2017 üretilen sitotoksik aktivitesinden depletes 12 ve Balczon vd., hazırlık).
Miktar hücre öldürme, roman, ucuz ve basit bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil için ImageJ yazılım mikroskobik bir alandaki hücreler (hücre öldürülmesi gösterge) eksikliği alanların doğrudan ölçüm izin vermek için adapte edilmiştir. Bu yöntem güvenilirliğini karaciğer hücreleri sürümüdür öldürme, hücre ölçme köklü yöntemi için doğrudan karşılaştırma tarafından doğrulandı. Şekil 3' te gösterildiği gibi ImageJ yazılım, beyaz hücreleri içeren bölgeleri mikroskobik alanın ve siyah hücrelere eksikliği bölgeler dönüştürmek için kullanılabilir. Daha sonra siyah beyaz alanlar basit oranında hücre ölüm ölçmek için kullanılabilir. Hücreleri bir konfluent monolayer ile başlatırken, mikroskobik alanın tüm bölgeler beyaz. Ancak, sonra supernatants Sitotoksin içeren ek 18 h tarafından monolayer boşluklar tespit edilemedi. Alan 36 h sonrası ilavesi sitotoksik süpernatant kadar doğrusal bir şekilde artmış hücre yoksun kültür yemeğin miktarı. Karaciğer yayın ölçerken aynı sonuçlar, ilk 18 h, sitotoksik süpernatant eklenmesinden sonra tespit edilmeden karaciğer sürümü ile elde edilmiştir. Maksimal hücre öldürme 36 h süpernatant eklenmesi sonra ölçüldü kadar karaciğer yayın daha sonra doğrusal bir şekilde arttı. Küçük hücre ölümü aşısını ΔPcrV hücrelerden (Şekil 3) toplanan süpernatant ile tedavi hücreleri veya kültürler için 36 h HBSS ile tedavi ölçüldü.
Tedavi ile bakteri hücreleri serbest amiloid miktarı ThT floresans ölçerek sayılabilir. Amyloids ThT için bağlama floresan yoğunluğu molekül ve an artmak içinde bir konformasyonal değişim neden olur. Bu tahlil için thioflavin T bir küvet için eklenir ve temel floresans ölçülür. Örnek küçük bir aliquot eklenirken floresans kayıt sonra durdu. Küvet sonra fluorimeter için döndürülür ve floresan emisyon kaydedilir değişimdir. Şekil 4' te gösterildiği gibi floresans emisyon artış gösterildiği gibi bulunan P. aeruginosa amiloid PA103 suşu ile inkübe hücrelerden süpernatant toplanan. Buna ek olarak, süpernatant ΔPcrV gerilme ile aşılanmış PMVECs üzerinden amyloids, artan floresan bir yokluğu tarafından belirtildiği şekilde yoksun.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig1.jpg"> Şekil 1. P. aeruginosa inolculation etkileri PMVEC morfoloji. PMVECs (A) ve PA103 P. aeruginosasuşu eklenmesi (B) sonra dört saat önce in konfluent monolayer. Boşluklar enfekte hücrelerde hücre monolayer açıkça görülebilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig2.jpg"> Şekil 2. Sitotoksik supernatants analizlerini. [I] bölümü. Kontrol ve tedavi hücreleri temsilcisi görüntüleri. PMVECs 21 h için her iki PA103 bakteri (B) ya da zorlanma ΔPcrV ile (C)aşılamaya hücrelerden elde edilen süpernatant ile tedavi edildi. Kontrol hücreleri de HBSS arabellek (A)21 h için inkübe. Ölçek çubuğu 100 µm. Bölüm [II] =. Temsilcisi immunoblots supernatants, toplanan ΔPcrV (A) veya PA103 (B) enfekte PMVECs. Lekesi amiloid (A11) veya oligomeric tau (T22) karşı antikorlar ile probed. Mr kDa de. <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig3.jpg"> Şekil 3. Hücre öldürme Nefelometri. (A) temsilcisi mikroskop alanlardan alan hangi bölgelerde içeren ve hücreleri eksik ya beyaz ya da siyah, sırasıyla, ImageJ yazılımı kullanılarak çevrildi farklı zaman puan (h süpernatant toplama sonra). Dönüşüm aynı zamanda gösterilmeden önce aynı faz kontrast görüntü. Çubuk 100 µm. (B) = Nefelometri standart karaciğer yayın tahlil ve ImageJ tahlil kullanarak öldürme hücresinin karşılaştırılması. N = 4, **p < 0,05, ***p < 0,01. <a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig4v2.jpg"> Şekil 4. Temsilcisi ThT floresans tahlil veri. Boş cuvettes ThT içeren heyecanlı 425 nm ve emisyon sonra floresan 482 ölçüldü nm. Arka plan floresans 20 s ve Süpernatant sonra gelen her iki PA103 - veya ΔPcrV-PMVECs için cuvettes eklendi aşısını toplanmıştır. Floresans emisyon sonra 40 saniye kaydedildi.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K Görüntüleme.  University of South Alabama. Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Video: Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...