Eğitim ve cervid PrP bakteriyel ifade plazmid sağlamak için Dr Byron Caughey (NIH kayalık dağ laboratuvarları) için minnettarız. SG Kanada araştırma sandalye program tarafından desteklenir. Genom Kanada, Alberta Prion Araştırma Enstitüsü ve Alberta tarım ve Ormancılık genom Alberta ve University of Calgary Bu eser destek için SG bu araştırma için fon kabul. Bir araştırma hibe hayvan araştırma için Margaret Gunn temelden anıyoruz.

1. kullanarak RT zlı fekal madde <ol><li><ol><li>yapmak cervid dışkı hazırlanması ayıklar fekal homogenate 10 mL olarak dışkı fekal madde 1 g ekleyerek ayıklamak arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, % 0.05 ara 20, 1 mM PMSF ve 1 x tamamlamak proteaz inhibitörleri, EDTA içermeyen) bir son konsantrasyonu % 10 (w/v) vermek. Homojenizasyon tampon kullanımı öncesinde hazırlanan ve depolanan -20 ° c</li>
		<li>Homogenize dışkı granül (1 g) ve proteinler için oda sıcaklığında 1 dk. için üretici önceden belirlenmiş bir program ile bir dissociator kullanarak arabellek (10 mL) tüpler (örneğin, gentleMACS M tüpler). 2-3 kez dışkı örnekleri tamamen arabellekte homojenize kadar bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Parafilm tüplerini mühür ve oda sıcaklığında 1 h kuluçka için sallanan bir platform veya rotary shaker üzerine koyun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 min için 18.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		Protein içeren supernatants <li>toplamak ayıklar ve aliquot onları içine 1,5 mL tüpler. Aliquots daha fazla uygulamalar için-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li> <li>Konsantrasyon PrP Sc dışkı ayıklar Not: böylece tarafından RT zlı, algılama hassasiyeti artırma dışkı ayıklayın örneklerinde CWD Prionlar konsantre için protein yağış adım eklenir iletişim kuralı için.
	<ol><li>NaPTA yağış yöntemi</li> <li>eklemek 250 µL % 10 (w/v) dışkı protein 1 ml N-loril sarcosinate (sarkosyl) hulâsa sarkosyl % 2 (v/v) son bir konsantrasyon vermek.</li>
		<li>Parafilm ile örnekleri içeren ve bir thermomixer 1400 rpm sabit sallayarak altında 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya tüpler mühür.</li>
		<li>Dışkı protein özü ve sarkosyl karışımı ile sodyum phosphotungstic asit ve magnezyum klorür, pH %7,4 0,3 (w/v) sodyum phosphotungstic asit örneklerde son bir konsantrasyon elde etmek için 170 mM (w/v) % 10 içeren bir hisse senedi çözüm ayarlamak.</li>
		<li>Örnekleri için 2 h 37 ° C'de sabit 400 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 30 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Granül yıkama yıkama arabellekte resuspending tarafından (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, % 0.5 Triton-X 100, 10 mM EDTA, % 0.5 sodyum deoxycholate (w/v) ve % 0,1 sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 15 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Resuspend granül 100 µL (1/10 orijinal hacminin dışkı protein özü) RT zlı seyreltme arabelleği. 
		Not: RT zlı seyreltme arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 130 mM NaCl, % 0,1 SDS (w/v) ve 1 X N2 ek) kullanımı önce hazırlanır. 10 mL toplam hacmi bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve kadar kullanmak-20 ° C'de depolanan.</li>
		<li>RT zlı tahlil kullanan kadar tedavi NaPTA örnekleri-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol></li> <li>RT zlı tahlil <ol><li>taze 10 mM Th-T stok çözüm (0,032 g Th-t Çift Kişilik distile H 2 O 10 mL) hazırlayın.</li>
		<li>1:10 Th-t çift hisse senedi çözümde distile Th-T 1 mm son bir konsantrasyon 0.2 µm acrodisc şırınga aracılığıyla filtre kullanarak filtre yapmak için H 2 O bir seyreltme olun.</li>
		<li>Buz üzerinde-80 ° C'de depolanan fare rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL RT zlı tepki başına) çözme</li>
		<li>RPrP substrat 100 kDa boyutu dışlama filtresi mikrotüpler içine bir anda ve 14.000 x g, santrifüj (bir tüp/filtre ilâ iki kere kullanılabilir) oda sıcaklığında 5 min için yük 500 µL.</li>
		<li>Eluted substrat steril 1,5 mL tüp içine aktarmak ve 4 ° C'de kullanımda kadar devam.</li>
		<li>-20 depolanan çözülme RT-zlı seyreltme arabellek ° C.</li>
		<li>Yapmak dilutions RT zlı içinde tohum (fekal protein özü) seyreltme arabellek: 
		Su katılmamış örnek: su katılmamış dışkı protein özü kullanın 2 x 10 -1 seyreltilmiş 2 x 10 -2 seyreltilmiş 2 x 10 -3 seyreltilmiş</li> <li>hisse senedi çözümleri için RT zlı tepki karışım hazırlamak: fosfat tamponlu tuz () PBS): 5 X NaCl: 2 M Çift Kişilik distile H 2 ' O. hazırlanan NaCl çözeltisi stok 
		EDTA: 100 mM EDTA içinde çift hazırlanan stok çözeltisi distile H 2 O.</li>
		<li>Tüm çözümleri (Adım 1.3.8) kullanımı önce her çözüm ayrı ayrı bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve oda sıcaklığında steril tutmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı (örnek başına bir tepki 98 µL hacmi ve dört örnek çoğaltır) örnek sayısına göre toplam hacmi yeterli karışım bütün tepkiler var emin olmak için bu birim yüzde 10'u kullanılacak hazır olun.
		RT zlı tepki karışım hazırlamak için <ol><li>kullanımı 15 mL tüp (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP substrat ve Çift Kişilik distile su rPrP son konsantrasyonu tepki olarak ayarlamak için) hisse senedi sol kullanarak utions.</li>
			<li>De bir pipet ile filtre ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından tüm çözümler karıştırın. Mümkün olduğu kadar girdap kaçının.</li>
			<li>50 mL tek kullanımlık pipetting rezervuar karışımı dökmek.</li>
			<li>98 µL RT zlı tepki karışımı bir 96-şey optik alt plaka her kuyunun içine yüklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.</li>
		</ol></li> <li>Her RT zlı tepki 2 µL, su katılmamış veya 10 kat seri olarak seyreltilmiş dışkı protein özü ekleme. Her örnek içinde dört çoğaltır sınama. 
		Not: her deneyde CWD-negatif ve doğrulanmış CWD-pozitif hayvanların dışkı örnekleri (--dan su katılmamış için 2 x 10 -3 arasında değişen) seri dilutions negatif ve pozitif denetim, sırasıyla kullanılır.</li>
		<li>Bir plaka okuyucu için yinelenen döngüleri 1 min Çift Kişilik yörünge (700 rpm) sallayarak ve 1 dk. kuluçka dinlenme ile 25 h 42 ° C'de kuluçka önce sızdırmazlık bandı ile plaka mühür.</li>
		<li>Tanımla Floresans ölçüm ayarlarını: 
		Uyarma: 450 nm emisyon: 480 nm okumak, alt sayısını basması: 20 el ile kazanç: 1000 (makineye bağlıdır) entegrasyon zaman: 20 µs</li> <li>plaka okuyucu 25 h. sonundaki plaka kaldırmak</li>
		<li>Plaka 3000 x g kuyular arasında potansiyel kirlenmesini önlemek için 3 dakika için de aşağı spin.</li>
		<li>Mühür plaka kaldırmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı taze substrat ve taze Floresans içeren 90 µL boya Th-T 1.3.1-1.3.6 bölümünde açıklandığı gibi ekleyerek yeni bir 96-şey tabak hazırlamak.</li>
		<li>De ilk plaka her kuyudan transfer 10 µL yeni hazırlanan 96 plakalı.</li>
		<li>Yeni plaka mühür ve RT zlı tahlil için ek 50 h 1.3.13 adımda anlatılan adımları izleyerek devam edin. Bu ek adım 50 h / toplam reaksiyon süresi 75 h yapacak 
		Not: RT zlı testin tüm prosedürleri altında Biyogüvenlik kabini yapılır.</li>
		<li>Veri toplayabilir.
		<ol><li>Okuma ve belge her şey her 15 dk. Th-T Floresans sinyalinin</li>
			<li>Toplamak veri transferi bir elektronik tabloya ve veri analizi yazılımı quadruplicate tepki ortalamasıyla kullanarak toplam döngüleri.</li>
			<li>Veri Ortalamalar arsa. X ekseni için reaksiyon süresi, RT-zlı (h) karşılık gelen ve y ekseni göreli Floresans birimleri (RFU) karşılık gelir. Her eğrinin bilinen bir örnek bir seyreltme için karşılık gelen.</li>
			<li>Negatif kontrol en yüksek ortalama değerlerini hesaplayarak her deneyde, bir eşik ayıran artı 5 standart sapmalar akım açıklandığı gibi Yayınlanan edebiyat 41. 
			NOT: Tanımlanmış eşiğin geçti bütün çoğaltır pozitif olarak kabul edilir. En az iki dört çoğaltır çapraz, örnek sonra pozitif kabul edilir.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Arıtma rekombinant Prion protein (rPrP) <ol><li>bakteriyel hisse senedi ve ifade rPrP büyüme Not: Escherichia coli (e.coli) zorlanma vektör evde beslenen hayvan-24 kodlama ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) fare PrP (artıkları 23-231) rPrP hazırlamak için kullanıldı.
	<ol><li>Gliserol stokunun buzun üstünde evde beslenen hayvan-24 mPrP(23-231) ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) çözme</li>
		<li>Çizgi LB (Luria Bertani) olarak 50 µg/mL sefaloridin son bir konsantrasyon ile tabaklar ve gecede 37 ° C kuluçka makinesine kuluçkaya. Tabakları baş aşağı nem yoğunlaşma bakteri içeren katı medya önlemek için olduğundan emin olun. Büyüme en az bir iki tabak var emin olmak için iki tabak hazırlayın.</li>
		<li>1 L LB ve basınçlı kap hazırlamak bu steril başaramayacak.</li>
		<li>Özel sayı: 1 L ile 1 mL sefaloridin (50 mg/mL) ve kloramfenikol (34 mg/mL), 1 mL steril LB medya.</li>
		<li>Sefaloridin ve kloramfenikol içeren LB orta 3 mL aşılamak için bir tek kullanımlık aşılama döngü kullanarak her plaka bir koloni seçin.</li>
		<li>Yer bir kuluçka 37 ° C'de sabit 5-6 h. için 225 rpm'de sallayarak ile mini kültürlerde</li>
		<li>Mini-kültürler LB medya ile birlikte Autoinduction sistem 1 hızlı indüksiyon protein ifade için orijinal 1 litre geri kalanını ekleyin.</li>
		<li>Yer 2 lt şişeye, veya daha büyük bir kuluçka 37 ° C'de 20-24 h. için 200 devirde sabit sallayarak ile Kültür</li>
		<li>1 L kültür 4 x 250 mL santrifüj tüpler içine split.</li>
		<li>Kültür 3.750 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüpler aşağı spin.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve 50 mL santrifüj tüpleri bakteriyel granül toplamak, sonra bunları daha fazla işleme kadar-80 ° C'de dondurmak. Elde edilen granül iyi protein verim için 3-4 g tartılır.</li>
	</ol></li> <li>Dahil vücut hazırlanması <ol><li>donmuş Pelet (3-4 g) kaç dakika 37 ° C'de erimek.</li>
		<li>-80 ° C'de 10 dakika için bir kez daha Pelet donma ve yeniden çözülme. Dondurma ve iki kez daha çözdürme bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Resuspend bakteriyel Pelet 1 X lizis reaktif (örneğin BugBuster Master Mix) tarafından iyice pipetting. 5 mL reaktif bakteriyel Pelet 1 g için kullanın. Tamamen homojenize mix emin olun.</li>
		<li>Homogenate bir rock'çı, oda sıcaklığında 20 dakika için üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g için oda sıcaklığında 20 dk, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde kapalı dökme tarafından supernatants atmak</li>
		<li>Granül 1 önceki adımda kullanılan lizis reaktif X aynı birimdeki homojenize.</li>
		<li>Homogenate 15 dakika oda sıcaklığında bir rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Eklemek yeterli hacim 1:10 (0.1 x) lizis reaktif 40 mL toplam homogenate hacmi elde etmek için. Karıştırmak yanında inversiyon de homojenize emin olmak için.</li>
		<li>Homogenate 7,900 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Dikkatle onu dökme tarafından süpernatant atmak</li>
		<li>Pelet 40 ml 0.1 x lizis reaktif resuspend.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle bu dökerek atmak ve başka işleme kadar dahil organları-20 ° C'de içeren Pelet depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Protein arıtma <ol><li>dahil cesetleri oda sıcaklığında erimek.</li>
		<li>Dağıtılması çözdürülen dahil cesetleri 14 ml 8 M guanidin-HCL (38 g guanidin hidroklorür 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 ve dolgu ile H 2 O 50 ml; süspansiyon, nihai çözüm pH ayarlama değil) proteinler solubilize için.</li>
		<li>De yukarı ve aşağı pipetting homojenize emin olun.</li>
		<li>Incubate lysate bir rock'çı, oda sıcaklığında 50 dakika süreyle üzerinde</li>
		<li>Hazırlamak 18 g Ni-NTA reçine (18 g için 3-4 g bakteriyel pelet) boncuk; 100 mL vakum ve 100 mL 0,22 µm şişe en iyi filtre kullanarak su ile yıka.
		<ol><li>Ni-NTA reçine boncuk 18 g 50 mL tüp içinde yerleştirin ve son hacim yapmak için arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) denaturing, yeterli hacim katmak ilâ 50 mL.</li>
			<li>Boncuk oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 50 dk denaturing tampon equilibrate.</li>
		</ol></li> <li>Lysate 16.000 x g çözünmez enkaz kaldırmak 5 min için de eklenmesi vücut santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dengelenmiş boncuk ekleyin ve granül atın.</li>
		<li>Bir rock'çı protein bağlayıcı Ni-NTA reçine için izin vermek için oda sıcaklığında 40 min için mix giy. 
		Not: Nikel chelate boncuk, nikel benzeşimi tarafından PrP arındırmak için kullanılır. PrP histidin zengini N-terminal bölgesi benzeşimi için nikel iyonları onun herhangi bir etiketi olmadan bağlamak protein sağlar nickel(II) işler.</li>
		<li>Su ile yıkama her iki çizgileri (A ve B) temizlemek için FPLC.</li>
		<li>Denaturing arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) her iki hatları (A ve B) (sütun henüz eklenir.) sistem Prime üzerinden çalıştırmak</li>
		<li>Reçine sütuna yerleştirin. Hava kabarcıkları en aza indirmek emin olun.</li>
		<li>İçin FPLC sütun eklemek ve arabellek denaturing % 0 ve %100 yanında belgili tanımlık son arabellek refolding için arabellek A denaturing % 100 ve % 0 refolding arabelleği B (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0) başta doğrusal gradyan çalıştırın. Bu kademeli değişim 0.75 mL/dak 240 min için akış hızında çalıştırmak ve uygun PrP katlama için gereklidir. 
		Not: Kromatografik arıtma işlemi sırasında denatüre PrP ilk yavaş yavaş bağlı denaturing tampon yerine refolding arabelleği doğrusal gradyan uygulayarak refolded. Bu adım, aynı zamanda chaotropic guanidin-HCl kaldırır.</li>
		<li>% 100 refolding arabellek sütunu için 0.75 mL/dak., ek bir 30 dk boyunca akmaya devam ediyor emin olun</li>
		<li>Durulama hat A elüsyon arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 5,8) tarafından takip su ile sütun yan yol. Bu şimdi elüsyon arabellek tarafından AKTA sistemdeki yerini almıştır denaturing tampon temizlemek.</li>
		<li>Elute protein tampon B ve %0 elüsyon tampon A ilk 0 tampon ve % 100 elüsyon tampon refolding % refolding % 100'den 40 min için doğrusal gradyan çalıştırarak 2 mL/dk. 
		Not: PrP imidazole elüsyon arabelleği yüksek yoğunlukta yarışacak &#39; nickel(II) s bağlama. Birincil protein zirve yaklaşık 1/3'ü geçişin yoldan elute başlayacaktır.
		<ol><li>İzle Kromatografik artırmak OD 280 nm için.</li>
		</ol></li> <li>Sadece büyük tepe ortasındaki protein içeren tüpler toplamak. 
		Not: 2 mL eluted kesirler 15 mL tüpler içine toplanır.</li>
		<li>Diyaliz arabellek (10 mM sodyum fosfat, pH 5,8) yaklaşık 1/3 cilt (1 mL) hemen tüplerini içerdiği protein sulandırmak.</li>
		<li>Hemen buz üzerine boruları yerleştirin</li>
		<li>Eluted protein tüplerde bulunan havuz.</li>
		<li>Zavallı diyaliz kaset (moleküler ağırlık kesme 10 kDa) protein.</li>
		<li>Kaset 4 ° C'de 2 h için önceden soğutulmuş diyaliz arabellek (3.6 M) koymak, sonra kasetleri bir taze diyaliz arabelleğe (3.6 M) gece için transfer. Yapmak Diyaliz tampon altında sürekli ajitasyon olduðundan emin.</li>
		<li>Filtre protein diyaliz sonra bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden.</li>
		<li>Bir BCA protein tahlil kit kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Konsantre veya protein konsantrasyonu 0.3 mg/ml ayarlamak gerekirse sulandırmak. 
		Not: SDS-sayfa ve Coomassie boyama mavi saflık onaylayın.</li>
		<li>1 mL aliquots protein microcentrifuge tüplerde yapıp hemen-80 ° C'de RT zlı protokolünde açıklandığı gibi daha fazla kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RT zlı daha önce idrar ve dışkı özleri sözlü olarak enfekte Ak kuyruklu geyik ve katır geyiği 38CWD Prionlar algılamak için istihdam edildi. Bu el yazması gösterilen sistem RT zlı tahlil adapte bir yöntemdir. Ek adımlar algılama ve tahlil CWD Prionlar enfekte hayvanların dışkı malzeme için duyarlılığını artırmak için "klasik" RT zlı tahlil içine dahil edilmiştir.
Algılama dışkı özleri ile düşük duyarlılık bizi RT zlı protokol gelişmesine yol açtı. Hassas vitro tespiti Prionlar dışkı içinde elde etmek için kritik adımlar için numune hazırlama prion dönüşüm ve/veya yayma ile müdahale ve algılama duyarlılığını geliştirmek bileşenleri kaldırmak için eklendi. RT zlı ve NaPTA/sarkosyl tedavi protokolündeki yüzey yedek birleşmeyle önceden klinik ve klinik CWD-enfekte elk tohumlama etkinliği algılama ve dışkı özleri prion dönüşüm algılama sınırları güçlendirmek için kritik .
NaPTA yağış genellikle izole ve PrP algılanamaz düzeyiSc konsantre sarkosyl ayıklama eşlik yaygın bir tekniktir. NaPTA sarkosyl deli dana dönüşüm bir hücre ücretsiz sistemi 44düşük konsantrasyonlarda kolaylaştırmak için bilinen bir deterjan olmakla birlikte PrPSc PrPC 43 tercihen çökelti olduğu bilinmektedir. Bu uyum içinde NaPTA ve sarkosyl'in birleşimiyle fibriler toplamları vitro daha yüksek bir verim 45,46,47daha önce gösterildiği gibi oluşturabilir. Bu yöntemi daha önce periferik CWD Prionlar başarıyla numune arıtılmış tükürük 39 ve tam kan 40gibi algılamak için RT zlı tahlil içine dahil edilmiştir. Bizim çalışma iletişim NaPTA/sarkosyl arınma dışkı numune hazırlama birleşmeyle CWD prion algılama tarafından RT zlı sağlar ilk kanıt sağlar. Ayrıca, bu yöntem ile rPrP substrat CWD-negatif fekal homogenates RT zlı tahlil içinde spontan dönüşüm azaltmak başardık.
Potansiyel bir mekanizma yüzey yedek 30etkisini açıklamak için teklif edildi. Reaksiyon (önce taze substrat ilavesi) ilk tur olarak, sadece küçük bir miktar tohum RT zlı tepkiler eklenir. RPrP yalnızca bir bölümünü numaralı seribaşı reaksiyonlar dahil ederken, substrat geri kalanı da tepki plaka Wells formu olmayan-amiloid toplamları için duvarlar ile etkileşerek kullanılabilir veya bkz: tarafından dönüştürmek daha az eğilimli olan formu için değiştirilmiş ded RT zlı ürünleri yerine özgün tohum. Sonuç olarak, rPrP tohumları için birleşme oranı yavaş ve fibril oluşumu gecikme aşamasında tespit değil. Gecikme aşamasında yetiştirilen numaralı seribaşı RT zlı ürünleri sonunda bir "hızlı montaj aşaması" ulaşmak için uzamıştır gibi Prionlar daha küçük toplamları hızla sallayarak aracılığıyla bölümleme tarafından güçlendirilmiş veya lateral ek olabilir. Bu aşamada, taze substrat reaksiyon eklendi kolayca şekillendirme belirsiz toplamları yerine numaralı seribaşı ürünleri kurulmuştur. Bizim iletişim kuralı yüzey yedek adımda birleşme duyarlılığı artmış bir değişiklik vardı; deli dana tohum örneklerinde PrPSc önceden klinik hayvanlar ve/veya içeren inhibitör bileşikler çok düşük bir miktarı ile tespit etmek yararlı oldu.
PMCA, amplifikasyon tahlil misfolding ilk vitro protein 21açıklanan, birçok avantajı vardır yerine RT zlı tahlil kullanarak. PMCA içinde tüpler inkübe ve sonicator içinde bulunan bir su banyosunda sonicated; sonicator çevre konumlandırılmış tüpler amplifikasyon Merkezi 48yılında konumlandırılmış tüpler kıyasla daha az etkinliği göster. RT zlı sistem depremin kontrol etmek daha kolay olacak gibi görünüyor. RT-zlı, ancak, Moudjo ve ark. tarafından geliştirilen mb-PMCA gerçek bir avantajı bir 96 iyi biçim kullanılır 49 , 50, benzer faydaları gösterdi ama hala daha az PMCA kullanılır.
Substrat RT zlı rekombinant rPrP dönüşüm için kullanır; Buna ek olarak, çoğu durumda PMCA normal beyin homogenate kullanır. Buna ek olarak, RT-zlı yok sıra homoloji arasında tohum ve substrat 51-53gereklidir.
Kofaktör varlığı PMCA deli dana çoğaltması için gereklidir ve çarpım bulaşıcıdır. Ancak, RT zlı assay olarak, güçlendirilmiş PrP bulaşıcı değildir. Vitro amplifikasyon deneyleri içinde en büyük olasılıkla PrPC spontan dönüşüm nedeniyle yanlış pozitif tepkiler oluşumunu yinelenen bir sorundur. Bu nedenle, bu çalışmada kullanılan koşul ve tahlil numaralı seribaşı rPrP-dönüşüm ve spontan dönüşüm arasındaki farkı en üst düzeye çıkarmak için böyle bozuklukları en aza indirmek için özel.
Sonuç olarak, NaPTA/sarkosyl tedavi tahlil inhibitörleri dışkı içinde kaldırılmasını sağlar ve spontan dönüşüm azaltır. İlginçtir, tedavi precipitatedPrPSctohumlama etkinliğini engel değil. Buna ek olarak, yüzey yedek kullanılazlar evlatlık algılama hassasiyeti önemli ölçüde geliştirildi.

Prion hastalıkları veya bulaşıcı spongiform Encephalopathy (TSE) insanlarda, bovine spongiform encephalopathy (BSE) içinde sığır, koyun ve keçi ve kronik boşa büyük nörodejeneratif hastalıklar Creutzfeldt - Jakob hastalığı (CJD) dahil olmak üzere çoğu hastalığı (CWD) cervids 1,2. TSE'ler ayırt edici spongiform görünüm ve beyindeki nöronların kaybı ile karakterizedir. "Sadece protein" hipotezi göre Prionlar esas olarak PrPSc (büyük için ' Sc') 3/, ev sahibi olarak kodlanmış hücresel prion protein, PrPCmisfolded izoformu oluşmaktadır. PrPSc PrPC dönüştürme bağlamak ve diğer PrPC molekülleri dönüştürmek için bir çekirdek hareket edebilir ᵦ-yaprak 4,5,6 zenginleştirilmiş bir uyum içine kaynaklanır. Yeni oluşturulan PrPSc moleküllerin daha küçük reaksiyonlar, bulaşıcı çekirdekleri daha yüksek sayıda sonuçlanan bölen bir büyüyen polimer 7,8 içine dahil edilmiştir. PrPSc toplamak için eğilimli ve proteaz 9,10' a kısmen dayanıklıdır.
CWD etkiler vahşi ve çiftlik geyik (Cervus canadensis), katır geyiği (Odocoileus hemionus), Ak kuyruklu geyik (WTD; Odocoileus virginianus), geyik (Alces alces) ve Ren geyiği (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Bu yatay şanzıman cervid etkileşimleri ve çevre sebat infektivite 14,15ile en bulaşıcı deli dana hastalığı kabul edilir. Nerede PrPSc birikimi ve infektivite beyne sınırlı olan diğer prion hastalıkları CWD içinde bunlar da periferik doku ve vücut sıvıları örneğin tükürük, idrar ve dışkı 16,17, bulunur 18.
İmmünhistokimya PrPSc dağıtım ve süngerimsi lezyonlar 19,20algılamak CWD tanısı için altın standart olarak kabul edilir. ELISA ve daha nadir olarak, Batı leke de CWD teşhis için kullanılır. Böylece, geçerli deli dana hastalığı tanı çoğunlukla Prionlar içinde post-mortem doku tespit üzerinde temel alır. Ante-mortem tanı için CWD bademcikler veya recto anal mukoza ilişkili lenfoid doku (RAMALT) biyopsi alarak mevcuttur; Bununla birlikte, bu yordamı invaziv ve hayvanların yakalanması gerekir. Böylece, idrar ve dışkı, gibi kolayca erişilebilir örneklerin kullanımı CWD prion algılama için pratik bir yol olacaktır. Ancak, bu salgılarının liman nispeten Prionlar geçerli tanı yöntemleri algılama sınırın altındaki konsantrasyonları düşük. Sonuç olarak, daha hassas ve yüksek üretilen iş tanı aracı gereklidir. Döngüsel amplifikasyon misfolding protein gibi vitro Dönüşüm Sistemleri (PMCA) 21, tahlil ve gerçek zamanlı dönüşüm (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı tahlil 22,23, tohum amiloid tahlil 24 deli dana dönüştürme işleminin vitro taklit etmek için PrPSc kendi kendine yayılıyor yeteneği yararlanmak ve böylece dakika PrP algılanamaz düzeyleri 25Sc miktarda varlığı yükseltmek için çok güçlü araçlar vardır ,26. RT zlı yöntemi, ancak, β-yapraklık ikincil yapısında zenginleştirilmiş dönüşüm ürün özellikle thioflavin T (Th-T) bağlayabilirsiniz aslında yararlanır. Bu nedenle, rekombinant PrP (rPrP) numaralı seribaşı dönüşüm üzerine Th-T bağlamak ve böylece gerçek zamanlı olarak Th-T (RFU) göreli Floresans birimler zaman içinde ifade Floresans ölçerek tespit edilebilir amiloid liflerinde içine büyür. Bir kez izlenen, RFU göreli tohumlama faaliyetleri ve gecikme faz gibi nicel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. Gecikme faz sırasında hangi rPrP erken aşamada tepki Th-T Floresans algılama sınırın altına dönüştürmedir eşik ulaşmak için gereken süreyi (h) temsil eder. Eşlik eden yeterli amiloid çekirdeği (çekirdekleşme/uzama) oluşumuna belirgin gecikme faz sonu Th-T Floresans eşik düzeyini aşıyor ve olumlu olur oluşur. Amiloid liflerinde gerçek zamanlı ve ilk PrPSc veya aşağıdaki örnekte yer alan tohumlama aktivite tespit edilebilir büyüme daha fazla tohum üreten bölümleme tarafından güçlendirilmiş. Bu tohumlar sırayla hızlı üssel faz amiloid fiber büyüme teşvik.
Çünkü bu tahlil 1 düşük tespit edebilmektedir fg PrPSc 24yüksek hassasiyet nitelendirir ante öldükten sonra ya da non-invaziv tanı çeşitli periferik dokulara, salgılarının veya diğer PrPSc tespit ederek elde etmek için bu tekniği numune infektivite seviyesinin düşük yataklık tür. RT zlı kesinlikle avantajları diğer deneyleri tekrarlanabilirlik, pratiklik, hız (az 50 h) ve BİYOANALİZLER için karşılaştırıldığında düşük maliyetleri sağlar. O PMCA içinde kullanılan sonication gibi teknik karmaşıklığı önler; Ayrıca, hangi her şey aerosol bulaşma riskini en aza indirgemek bir bant mühürlü Mikroplaka içinde gerçekleştirilir. Çok iyi biçimi aynı deneyi 96 örnekleri çözümleme sağlar. Tekrarlayan sorunun yanlış pozitif ve rPrP vitro dönüşüm deneyleri içinde spontan dönüşüm karşı bir eşik (cut-off) RT zlı uygulanması çok yararlıdır. Nitekim, negatif kontrol (ortalama RFU negatif örnekler + 5 SD 27) sonuçlarına göre bir temel hangi-ebilmek kılınmak ayrımcılık pozitif ve negatif örnekleri arasında ayarlanır. Dört çoğaltır kullanım örnekleri için böylece çoğaltır en az % 50 olumlu bir sinyal gösterdiğinizde bir örnek pozitif tanımlamak için yardımcı olabilir, Yani çapraz kesme 28. Örneğin bir önceki çalışmada, hamster rPrP insan PrPvCJD homolog substrat kıyasla daha duyarlı bir substrat olmak tohumlari ve koyun büyük tepkiler numaralı seribaşı tespit edildi gibi homoloji arasında tohum ve substrat RT içinde zlı, gerekli değildir 29. hamster-koyun chimeric rPrP da insan varyant CJD Prionlar 30algılamak için insan rPrP daha daha iyi uygun bir substrat olmasını önerdi. Böylece, farklı türlerden rPrP yüzeylerde kullanımı bu tahlil çok yaygındır. Bu tahlil sporadik CJD 31,32,33, gen gibi birkaç prion hastalıkları için başarıyla uygulandıETIC prion hastalıkları 34, BSE 35,36,37, büyük 23,36ve CWD 38,39,40,41, 42. RT zlı içinde tohum PrPSc 38,39,40,41, tespit etmek için tüm başarılı olduğu gibi çalışmalar kullanarak beyin omurilik sıvısı, tam kan, tükürük ve idrar işlenen 42. örneklerinde inhibitörleri Amiloid Dil oluşumu içerebilir kan plazması gibi algılama yeteneği teşvik etmek için Orrú ve ark. (2011) Amiloid Dil oluşumu potansiyel inhibitörleri PrPSc immunoprecipitation (IP) adım ve RT-QuIC tarama ile kaldırmak için bir strateji geliştirdi, tahlil (eQuIC) "QuIC gelişmiş" adında. Buna ek olarak, bir yüzey yedek adım duyarlılığını artırmak için reaksiyon süresi ~ 24 h sonra istihdam edildi. Sonuçta, olarak düşük 1 ag PrPSc eQuIC 30tarafından algılanabilir.
Dışkı özleri arındırmak ve olası tahlil inhibitörleri dışkı çıkarmak için dışkı örnekleri preklinik ve klinik aşamalarında elk deneysel oral enfeksiyon üzerine toplanan deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren arabellekte homojenize. Dışkı özleri daha fazla protein yağış ile sodyum phosphotungstic asit (NaPTA) yağış kullanan örnekler PrPSc konsantre için farklı yöntemler için sunuldu. Önce Safar vd tarafından açıklanan NaPTA yağış yöntemi 43, PrPSc test örneklerinde konsantre için kullanılır. NaPTA kuluçka PrPCyerine PrPSc tercihli yağış örnek sonuçlarını içeren. Ancak, moleküler mekanizma hala belli değildir. Bu adımı da içeren ve bazı durumlarda görülmektedir rPrP spontan dönüşüm önleme yardım etti. Son olarak, dışkı özleri en iyi duruma getirilmiş RT-fare rPrP (aa 23-231) bir substrat kullanarak ve yüzey yedek iletişim kuralında dahil algılama hassasiyeti artırmak için zlı tarafından test edildi.
Sonuçlar burada geliştirilmiş bu yöntem çok düşük konsantrasyonlarda CWD Prionlar algılayabilir ve algılama ve özgüllük dışkı örneklerinde NaPTA yağmur damlaları ve yüzey yedek olmadan bir iletişim kuralına göre hassasiyeti artar gösterilmektedir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer doku ve vücut sıvıları uygulanabilir ve vahşi ve esir cervids CWD gözetimi için büyük kullanım olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

Esas numaralı seribaşı misfolding ve rekombinant prion protein (PrP) substrat prion tohum dönüştürme için bir şablon olarak kullanarak toplama göre hassas vitro boş hücre deli dana amplifikasyon tahlil RT zlı tekniğidir. RT zlı gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) benzer bir roman yüksek üretilen iş tekniği kullanıyor. Amiloid Fibriller büyüme tespiti üzerine ᵦ sayfalık zengin proteinler ile spesifik etkileşime fluoresces Thioflavin T boya temel alır. Böylece, Amiloid Dil oluşumu gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir. Kronik israf hastalığı (CWD) Prionlar dışkı hulâsa içinde algılamak için bir güvenilir non-invaziv tarama testi geliştirmek çalıştı. Burada, özellikle CWD dışkısı etkinliğinde tohum PrPSc cervids enfekte ortaya çıkarmak için RT zlı tekniği adapte olması. Başlangıçta, hazırladığımız dışkı özleri tohumlama etkinliği RT içinde zlı, nispeten düşük potansiyel tahlil inhibitörleri fekal malzeme nedeniyle oldu. Dışkı özleri tohumlama etkinliğini artırmak ve olası tahlil inhibitörleri kaldırmak için deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren bir arabellek dışkı örneklerinde homojenize. Biz de örnekleri PrPSc sodyum phosphotungstic asit ve merkezkaç kuvveti kullanan protein yağış temelinde konsantre için farklı yöntemler için gönderilmektedir. Son olarak, dışkı özler tarafından en iyi duruma getirilmiş RT-yüzey yedek algılama hassasiyeti artırmak için iletişim kuralında dahil zlı test edildi. Böylece, bir protokol CWD deli dana önceden klinik ve klinik cervids tarafından RT-non-invaziv CWD tanı için kullanışlı bir araç olabilir zlı, dışkısı etkinliğinde tohum hassas algılanması için kurduk.

%10 (w/v) hazırlanan CWD dışkı özleri RT zlı tepki tohum başardık, henüz algılama hassasiyeti düşük 27oldu. Dışkı homojenizasyon için belirli bir arabellek kullanarak yüksek arka plan Floresans reaksiyonlarda RT zlı eşlik eden kullanmak için fare rPrP substrat, önlemek için önemli bir adımdı yerine daha özel almak için izin geyik rPrP 27sonuç. NaPTA yağış ilavesi rPrP RT-zlı (şekil 1) içinde spontan dönüşüm amplifikasyon reaksiyonlar (Şekil 2) tohumlama etkinliğinin inhibe olmadan azaltılmış. Daha iyi amplifikasyon NaPTA tedavi gözlendi rağmen hala (şekil 1) düşük elde edilen floresan sinyallerini CWD-pozitif dışkı örnekleri vardı. Buna ek olarak, bazı örnekler prion amplifikasyon düşük Floresans düzeyleri sabit bir plato ulaştı. Bu bozulma/denatürasyon rPrP, veya rPrP havuzu 30tüketmek yol kapalı toplamları oluşumu nedeniyle olabilir tepkiler doygunluk gösterir. Daha fazla Prionlar amplifikasyon geliştirmek ve algılama duyarlılığını arttırmak için bir yüzey yedek adım Protokolü dahil oldu. Yüzey yedek RT zlı protokolüne (Şekil 2) giriş duyarlılığı artmış (% 77; 14 dışarı-in 18 örnekleri RT zlı olumlu idi) ve özgüllüğü (% 100; RT zlı döndü pozitif negatif denetimlerde hiçbiri) algılama (bkz. Tablo 1'den Cheng vd. 27). son olarak, tüm bu adımları (şekil 3) liderliğindeki CWD Prionlar infektivite seviyesinin düşük içeren örnek kullanarak, RT zlı algılanması için güvenilir ve hassas bir protokol optimizasyon için.
Yüzey yedek RT zlı reaksiyon ilk 25 h sonra kullanılmaya başlanan, reaksiyon Yenileyici tarafından taze substrat ve taze Floresans içeren tampon boya Th-T. Protokol yüzey yedek adımda tanıtarak, RT zlı reaksiyon süresi 50 h 75 h için uzatıldı. Yüzey yedek birleşme ile Şekil 2 ' de gösterildiği gibi deli dana amplifikasyon önemli bir iyileşme gözlenmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig1.jpg"> 
Şekil 1: fare rPrP substrat RT zlı içinde azaltılmış spontan dönüşüm numaralı seribaşı ile arıtılmış CWD-negatif fekal homogenate. Enfekte olmayan elk (C181-006) veya katır geyiği fekal homogenates son konsantrasyonu % 10 (w/v) elde etmek için dışkı özü arabellekte homojenize. Arıtma, bu dışkı homogenates işlenen ve 10 - kez NaPTA yağış tarafından yoğunlaşmıştır. Belirtildiği gibi sulandırılmış unpurified fekal homogenates (bir), NaPTA saflaştırılmış ve konsantre formları (b) fare rPrP bir substrat olarak quadruplicate RT zlı reaksiyon temel için kullanılmıştır. Axes göreli Th-T Floresans birimleri, reaksiyon süresi x-axes tasvir göster. Dışkı örnekleri (b) NaPTA saf spontan dönüşümleri bir azalma görüldü. Cheng ve ark. kullanılan verileri 27. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56373/56373fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig2.jpg"> 
Şekil 2. CWD Prionlar yüzey yedek kullanarak dışkı içinde Geliştirilmiş algılama. Sözlü olarak CWD Prionlar ile enfekte fekal homogenates bireysel Elk (C051-05, C052 / 05) saflaştırılmış ve NaPTA yağış tarafından yoğunlaşmıştır. NaPTA tedavi örnekleri arasında 2 x 10-1 2 x 10-3 tohum quadruplicate RT zlı reaksiyonlar ile fare rPrP substrat eskiden seyreltilmiş. RT zlı tahlil yüzey yedek (bir) normal bir dönemde 50 h veya yüzey yedek 75 h (b) bir genişletilmiş kuluçka dönemi için birleşme ile gerçekleştirildi. İkincisi için yüzey yedek RT zlı reaksiyon ilk 25 h sonra tanıtıldı. Reaksiyon hacminin % 90'ı kaldırılır ve rPrP substrat ve Th-T. içeren taze hazırlanmış RT zlı tepki karışımı tarafından değiştirilir Protokol yüzey yedek adımda tanıtarak, RT zlı reaksiyon süresi 50 h 75 h. Cheng ve ark. kullanılan verileri için genişletildi 27. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56373/56373fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56373/56373fig3.jpg"> 
Şekil 3: akış PrPSc CWD-enfekte cervids dışkı çıkarma açıklayan ve RT zlı kullanarak faaliyet ve deli dana amplifikasyon tohum diyagramı tahlil. CWD-enfekte hayvanların dışkı örnekleri bir dışkı çıkarma arabellekte homojenize NaPTA yağış yöntemi için gönderilmiş ve RT zlı tahlil tarafından test edilmiştir. İkinci bir yüzey yedek adım getirerek gerçekleştirildi. NaPTA ve yüzey yedek adımları birleşme spontan dönüşüm ve aktivite ve deli dana amplifikasyon tohum güçlü düzelme azaltılması sonuçlandı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56373/56373fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Görüntüleme.  University of Calgary. Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

İnsan Dışkı Örneklerinde Campylobacter Jejuni'nin Ulaşım Medyasında Tespit ve Sağkalım Sınırını Belirlemek Için Kültür Yöntemleri

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...