Yazarlar Jacqueline Rosenberg el yazması proofreading için kabul etmek istiyorum. Bu eser bize Bölümü Sağlık ve insan Hizmetleri/Ulusal Sağlık Enstitüleri YA DeClerck için hibe ile tarafından desteklenmiştir (5R01 CA 129377 vermek) ve TJ Martell Vakfı. MH Kubala Saban Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi Los Angeles adlı bir araştırma kariyer geliştirme Fellowship Ödülü alıcı olduğunu.

İnsan monosit sağlıklı gönüllülerden elde kullandığı protokolü bölümünde çocukların hastane Los Angeles insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler ve insan malzeme altında Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylandı Protokol numarası: CCI 08-00208.
1. kanser hücre hatları ile tetrasiklin düzenlenir shRNA ifade hazırlanması
<ol><li>ShRNA PAI-1 Tet-pLKO-puro vektör içine klonlama 8 , 9<ol>
<li>Ben ve EkoRI bölünme 5' ucuna, anlamda dizisi, 6 nükleotit döngü ve antianlamlı sıra site yaşiçeren shRNA reaksiyonlar tasarlayın. Not: Aşağıdaki gibi tipik oligonucleotides tasarlanmıştır: ileri oligo: 5' CCGG - 19-21 bp, 19-21 bp Antisens - TTTTT, ters oligo - CTCGAG - hissediyorum: 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 bp Antisens 3' hissediyorum. Detaylı iletişim kuralı oligomer tasarım için 8' de bulunabilir. Bu çalışmada 3 shRNA dizileri PAI-1 karşı en güçlü silencing etkisi için test edilmiştir: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333ve şifreli33 Tablo 1' de dahil edilir.</li>
		<li>ShRNA reaksiyonlar tavlama ve şifreli shRNA reaksiyonlar.<ol>
<li>Oligonucleotides su 100 µM için sulandırmak ve mix 1 µL ileri Oligonükleotid, 1 µL ters Oligonükleotid ve 8 µL H2O.</li>
			<li>Oligonucleotides tavlamak için aşağıdaki mix: 1 µL Oligonükleotid karışımı, 5 µL arabellek 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM Sodyum Klorür (NaCl), 10 mM magnezyum klorür (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) ve 44 µL H 2 O</li>
			<li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) termal cycler 95 ° c 5 min için karışımı kuluçkaya, enstrüman geçiş ve oda sıcaklığında (RT) ulaşılana kadar bekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tavlanmış oligonucleotides oligonucleotides 5 µL 3 M sodyum asetat pH 5.2-50 µL komplementer ekleyerek çökelti.<ol>
<li>100 µL soğuk % 100 etanol (alkol) ekleyin ve-80 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Maksimum hızda benchtop santrifüj 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi</li>
			<li>Süpernatant kaldırmak, soğuk %70 500 µL eklemek alkol, 30 dk, santrifüj süpernatant kaldırmak ve Pelet 20 µL H2o çözülür</li>
			<li>Spectrophotometry, 260 Absorbans ölçme tarafından tavlanmış oligonucleotides konsantrasyonu değerlendirmek nm. Oligonucleotides 1 ng/µL son konsantrasyonu sulandırmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Luria Bertani (LB) orta ve LB Ağar kaplamalar hazırlamak.<ol>
<li>İçin LB orta, erime 10 g tryptone, 5 gr Maya ekstresi, 10 g NaCl 1 litre su içinde. Ortamın pH 1 kullanarak 7.0 için pH ayarlama N NaOH ve basınçlı kap.</li>
			<li>LB Ağar kaplamalar için 15 g/L agar LB orta ekleyin. Basınçlı kap ve serin aşağı yaklaşık 50 ° c Antibiyotik ekleyin ve tabakları dökün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Çizgi ile Tet-pLKO-puro vektör transduced bakteri ( Tablo reçetesigörmek) LB agar plaka 100 µg/mL Ampisilin ile desteklenmiş ve gecede kuluçkaya 37 ° C'de (O/N)</li>
		<li>100 mL LB orta plaka 1 koloni ile 100 µg/mL Ampisilin (LB/Ampisilin) ile takıma aşılamak ve O/N 37 ° C'de sallayarak ile büyümek</li>
		<li>IsolateTet-pLKO-puro 100 mL bakteriyel kültüründen bir plasmid izolasyon kit kullanarak.</li>
		<li>EcoRI ve AgeI enzimleri ile Tet-pLKO-puro vektör kısıtlama reaksiyon aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (1 µg), 42 µL H2O. kuluçkaya 1 37 ° C'de s Yeterince i ciddi vektör elde etmek için 5 x 50 µL reaksiyonlar hazırlayın.</li>
		<li>% 1'özel jel i ciddi vektöründen bir DNA arıtma kit kullanarak özel jel arındırmak için kullanın. DNA verimini artırmak için özel jel DNA oranı büyük kuyu için bir özel jel tarak kullanarak ve çoğu özel bir neşter kullanarak grubun dikkatlice kaldırarak en aza indirmek.</li>
		<li>Tüp ligasyonu tepki mix aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 komplementer ng oligonucleotides, 50 ng i ciddi vektör, 2 µL 10 x ligaz arabellek, 1 µL ligaz ve su kadar 20 µL. Ligate vektör ile tavlanmış shRNA oligonucleotides 16 ° C O/n<ol>
<li>Buna ek olarak, bir negatif kontrol tepki oligonucleotides yanlış pozitif kolonilerde neden olur uncleaved, kısmen i ciddi ve kendini ve birleştirilmiş vektör hesabı olmadan hazır olun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Standart dönüştürme teknikleri kullanarak, dönüşüm ligasyonu karışımları kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri doğrudan içeren lentiviral vektörlerin homolog rekombinasyon önlemek için tasarlanmış içine tekrar eder.</li>
		<li>Bakteri plakaları Ampisilin O/N 37 ° C'de ile büyümek Not: büyüme uydu kolonilerden ortaya çıkarsa, dönüşümün tekrarlayın ve bakteri 30 ° C'de büyüme yavaş ve böylece uydu kolonileri önlemek için büyümek.</li>
		<li>Başarılı tüp ligasyonu doğrulamak için 10-20 tek koloniler, aşı 2 mL LB/Ampisilin kültürler arasında ve Ampisilin plaka hisse senedi bir tabak (pozitif bir klon daha sonra kullanılmak üzere) seç. O/N 37 ° C'de sallayarak ile sıvı kültürleri büyümek Plaka O/N 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Parafilm ve 6 ° C'de mağaza ile plaka mühür</li>
		<li>Sıvı kültürlerden plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.</li>
		<li>Plazmid DNA XhoI enzim kullanarak Ampisilin dayanıklı kolonileri izole kısıtlama çözümlemesi gerçekleştirin. Her klon için aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: 0.5 µL XhoI, 2.5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (0,5 µg) ve 21 µL H2O. Incubate 37 ° C'de 1 h için Kısıtlama reaksiyon sonucu üzerinde % 1'özel jel tepki çalıştırarak analiz. Not: XhoI tarafından i ciddi WT vektör analizini kısıtlama 3 parçaları oluşturur: 8,447, 1800 ve 200 bp. Tet-pLKO-puro vektör 1.800 satıcısı sırayla bp olumlu klonlar shRNA-PAI-1 içeren mevcut değildir ve XhoI Özet içinde DNA parçalarının boyutu neden olur: 8,447, 190 ve 130 bp. Şekil 1' de gösterildiği gibi 2.000 bp parçası Ampisilin dayanıklı kolonileri numaradan izole DNA'bulunamadı: 3, 8 ve 11. Oligonucleotides tasarımına bağlı olarak, uzunluk ve olumlu kolonilerden DNA elde edilen parça sayısı değişebilir.</li>
		<li>Tet-pLKO-puro vektör içine shRNA sıralarının uygun ekleme sıralama8,9tarafından doğrulayın.</li>
		<li>Doğru klon içeren koloni ile 100 mL LB/Ampisilin kültürü aşılamak ve O/N 37 ° C'de büyümek</li>
		<li>Plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.</li>
	</ol></li>
	<li>Lentivirus parçacıklar nesil.
	<ol>
<li>15 cm doku kültürü çanak kat ile %0,01 steril su solüsyonu ile yemeğin yüzeyini örten tarafından Poly-L-lizin Poly-L-lizin ve RT 15 dk. için kuluçka çözüm aspirasyon tarafından kaldırmak ve bulaşıkları kuruması.</li>
		<li>Tohum 5 x 106 insan embriyonik böbrek 293 hücreler Poly-L-lizin-ceket 15 cm çanak hücrelerde (HEK293) ve Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) orta kültüründe takıma %10 FBS ve % 1 ile penisilin/streptomisin mix (kalem/Strep) 37 ° c, % 5 CO Onlar % 70 confluency ulaşana kadar 2 .</li>
		<li>Viral parçacıkların üretmek için HEK293 hücreleri 25 µg pLKO-Tet-Tarih-shRNA, 25 µg psPAX, (plazmid paketleme) ve 5 µg pMD2.G plazmid (zarf ifade plazmid) transfection reaktif kullanarak transfect. Not: psPAX ve pMD2.G plazmidleri Didier Trono laboratuarından (Ecole Polytechnique Federale de Lozan, İsviçre) bir hediyedir.</li>
		<li>HEK293 hücreleri ile 10 mM sodyum bütrat ve 20 mM HEPES pH 7.2 ve kodlamayla 8 h için takıma DMEM için orta değiştirerek ertesi gün ikna etmek.</li>
		<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hücrelerle yıkama ve taze DMEM orta içeren 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.2 25 mL ekleyin. 48 h 37 ° C'de kuluçka sonra dikkatli bir şekilde pipetting tarafından virüs içeren orta toplamak; sızıntıları önlemek.</li>
		<li>Toplanan orta HEK293 hücreleri kaldırmak için 0,45 µM şırınga filtre ile filtre. Viral parçacıkların içeren orta hemen veya daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li>
	<li>Stabil transfected hücre hatları nesil
	<ol>
<li>Tohum HCT116 kolon kanser hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin 50,000 hücreler/iyi DMEM orta % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş kalem/Strep bir 12-şey plaka. Hücreleri % 60-70 birleşmesi kadar % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>PBS hücrelerle yıkama ve virüs içeren 1 mL ekleyin orta ve kanser hücreleri ve O/N % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Bir denetim olarak taze DMEM orta %10 FBS ve % 1 ile 1 mL ekleyin kalem/Strep 2 wells kanser hücreleri ile için.</li>
		<li>Virüs içeren orta aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. PBS hücrelerle yıkama ve orta DMEM için (v/v) % 10 ile tetrasiklin ücretsiz değiştirin (Tet-free) FBS ve % 1 kalem/Strep.</li>
		<li>72 h sonra yıkayın PBS hücrelerle ve orta DMEM için % 10 değiştirmek Tet-Alerjik FBS % 1 kalem/Strep, virüs transfected hücrelerin seçimini için 1 µg/mL puromisindir.<ol>
<li>Kullanılan hücre kültürünü bağlı olarak en iyi seçim için puromisindir konsantrasyon puromisindir konsantrasyonları (0.1, 0.5, 1, 2 ve 5 µg/mL) dizi sigara transduced hücrelerde test ve nerede hiçbir kontrol hücreleri hayatta en düşük konsantrasyon seçme ayarlamak Kültür 3 gün sonra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3-14 gün boyunca puromisindir huzurunda hücreler kültür tarafından virüs transduced hücreleri seçin. Denetimleri, iki ek wells hücreleri, bir puromisindir ve bir puromisindir olmadan içeren orta ile sigara transduced ile hazırlayın. Denetim wells için karşılaştırıldığında virüs transduced hücreleri ile puromisindir iyi tarafından kısmi öldürülmesi hücreleri gözlemlemek. Not: Sigara transduced hücreler puromisindir huzurunda genişleyemez.</li>
		<li>Puromisindir dayanıklı HCT116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri koşullu KD verimliliğini doğrulayın. Not: Doksisiklin etkin yoğunluğuna kullanılan hücre hattı ile değişir ve (arası 100 ng/mL 2 µg/ml) titre gerekir.<ol>
<li>Zehirli hücrelerin ama etkili bir downregulating protein ilgi ifade değil Doksisiklin konsantrasyonu belirlemek. Bu protokol için 1 µg/mL başarıyla kullanılan vitroyapıldı.</li>
			<li>72 h için hücreleri 0.1, 1 ve 2 µg/mL Doksisiklin de kültür. İfade downregulated protein düzeyini doğrulayın (burada, PAI-1) Batı tarafından lysate hücredeki analiz leke. ShRNA şifreli denetim hücrelere koşullu ifade HCT116 ve MDA-MB-231 hücre karşılaştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Klimalı orta hazırlanması
	<ol>
<li>Tohum 1 x 106 hücre stabil Doksisiklin ile transfected pLKO-shRNA içeren lentiviruses 10 cm yemeklerinde düzenlenir.</li>
		<li>Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1 ile hücre hatlarında büyümek kalem/Strep devamsızlık ve 72 h % 5 CO2, 37 ° C'de 1 µg/mL Doksisiklin varlığı her gün taze Doksisiklin ekleme. Not: RPMI orta monosit kültür koşulları ile uyumludur. Doksisiklin ışık duyarlı bileşiktir. Alüminyum folyo ile kaplayan tarafından gelen ışık hücre kültürleri korumak ve çalışma altında doğrudan ışığa maruz kaçının.</li>
		<li>Pipetting tarafından orta toplamak, 0,45 µm filtre ile filtre ve aliquots içinde-80 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol></li>
</ol>2. izolasyon monosit insan kanı üzerinden
<ol><li>Monosit insan periferik kandan yalıtmak. Not: İnsan birincil monosit 7 mL beyaz kan hücrelerinin sağlıklı trombosit bağış elde bir lökosit filtresi konsantre etkilenmezsiniz. Donör bağlı olarak 1 x 109 ve 2 x 109 periferik kan mononükleer hücre (PBMCs), hangi monosit teşkil yaklaşık % 10 arasında bir lökosit filtresi üretir.<ol>
<li>İş istasyonu kabine laminar akışı hazırlayın.</li>
		<li>Makas ve laminar akış kabine 30 dk için ultraviyole ışık (UV) ile sterilize.</li>
		<li>Lökosit filtresi sprey %70 alkol ve air-dry iç kabin laminar akış.</li>
		<li>Her iki ucunda da lökosit filtresi makasla kesmek ve filtrenin içeriği 50 mL tüp içine boşaltın.</li>
		<li>%1 (v/v) FBS (PBS/FBS) içeren PBS ekleyerek 90 mL seyreltik.</li>
		<li>3 x 50 mL tüpler 15 mL yoğunluk gradient çözüm ile hazırlayın. PBS/FBS seyreltilmiş kan yavaş yavaş 30 mL katmanları karıştırma önlemek için çekim akışı degrade çözüm bir pipet denetleyicisi kullanarak ayarlayın yoğunluğu üzerinde katman.</li>
		<li>RT, 400 x g 25 min için fren olmadan, bir salıncak Open End santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Üst katmanı atmayın ve PBMCs bir taze 50 mL tüp içeren orta katman aktarın.</li>
		<li>PBS/FBS ilâ 50 mL ve 10 dakika süreyle RT de 120 x g, santrifüj trombosit içeren süpernatant kaldırmak ekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Pelet PBS/FBS 50 mL resuspend ve bir hemasitometre kullanarak PBMCs saymak. RT de 120 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS/FBS 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) 5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon içeren Pelet resuspend.</li>
		<li>Monosit Monositik olmayan hücreleri tükenmesi tarafından zenginleştirmek için negatif seçim setini kullanın. Not: Negatif seçim kiti bir kokteyl T hücreler, NK hücreleri, nötrofiller, B hücreleri, granülosit ve eritrositler karşı antikor (CD2 CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 ve glycophorin A) kullanır. Antikor kompleksleri bind Monositik olmayan bu hücrelerin yüzeyine ve dextran manyetik parçacıklar. Tüp bir mıknatıs yerleştirildiğinde, boncuk tüp duvarlar için uygun ve Monositik olmayan hücreleri çözümden kaldırmak.<ol>
<li>5 x 107 PBMCs/mL için 1 mL 50 µL antikor kokteyl ekleyin, bir pipet ile karıştırmak ve RT. ekle 50 µL manyetik boncuklar antikor kokteyl ile PBMCs için 10 min için kuluçkaya, bir pipet ile karıştırın ve RT. adlı başka bir 10 min için kuluçkaya</li>
			<li>PBS/FBS/EDTA 25 mL ve 50 mL tüp kapasiteli bir mıknatıs PBMC karışımı bir yer kadar ekleyin. 10 dk RT. boncuk tüp duvarlar için uygun ve çözüm Monositik olmayan hücrelerden çekilmek manyetik az için kuluçkaya.</li>
		</ol>
</li>
		<li>25 mL pipet kullanarak, monosit tüp içinde mıknatıs içeren çözüm kaldırın. Pipet ile tüp tarafına dokunmamaya dikkat et.</li>
		<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl 250 x g RT, santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve monosit %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI ortamda içeren Pelet resuspend kalem/Strep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Boyden odası geçiş tahlil
<ol><li>%1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 1 g ultrasaf su 100 ml çözülerek hazırlamak ve sterilize etmek için 0.2 µm gözenek boyutu filtre.</li>
	<li>%1 steril BSA çözüm O/N için geliştirilmiş makrofajlar bağlılığı membran geçirgen membran ekler kuluçkaya. Monosit/makrofajlar, 5-8 µm gözenek boyutu ekler kullanın.<ol>
<li>Steril doku kültürü çanak % 1 BSA çözüm ile doldurun ve ekler çanak yerleştirin. 200 µL % 1 BSA çözüm ekler içinde geçerli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ekler iki kez onları steril PBS ve filtre içinde uygulanan PBS dolu bir tabak koyarak yıkayın.</li>
	<li>40.000 HCT116 ya da MDA-MB-231 0.5 mL RPMI orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren hücrelerde tohum kalem/Strep başı kuyuda bir 24-şey plaka nüsha. Alternatif olarak, önceden oluşturulan şartına Orta 0.5 mL kuyuda chemoattractant kaynağı olarak yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün, plaka 8.000 monosit olarak hazırlanan eklemek %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI Orta 0.3 mL hacminde kalem/Strep, nüsha ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ekler sonra 48 h toplamak. Not: Bir deneme uzunluğu bağlı olarak kullanılan, bir zaman ders deneme nerede ekler farklı kuluçka zamanlarda toplanır gerçekleştirerek hücre ve belirli koşulları optimize edilmiş olması gerekir.<ol>
<li>Fazla orta sallamak ve tam olarak değil göç hücreleri kaldırmak için bir pamuk uçlu aplikatör ile iç yüzeyi çalmak.</li>
		<li>Wright-Giemsa yöntemini kullanarak ekler dış tarafında leke.</li>
		<li>Dikkatle geçirilen makrofajlar filtresiyle yan yüzleri emin bir yüksek viskozite mikroskop daldırma yağ içinde 3 ekler/cam slayt bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak slaytları görüntü. 9 alanlar/filtresi fotoğraf çekmek. 9 alanlar/filtresi geçirilen makrofajlar saymak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+transgenic+technologies.">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li><li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology.">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li><li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages.">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li><li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer.">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system.">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li><li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies.">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li><li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation.">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li><li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB.">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li><li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro.">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li><li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival.">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li><li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics.">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment.">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer.">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells.">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes,+peripheral+blood+mononuclear+cells,+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide.">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).</li><li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components.">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies.">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li><li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients.">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li><li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+(uPA),+its+receptor+(uPAR)+and+its+inhibitor+(PAI-1).">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li><li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent.">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li><li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis.">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li><li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells.">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation.">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li><li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation:+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice.">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li><li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration.">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li><li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+infiltration+of+macrophages+into+melanoma+via+phosphorylation+of+FAK-Tyr(9)(2)(5).">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li><li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence.">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li><li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function.">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li><li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV.">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages,+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM/ATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant.">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hücre tiplerinin çeşitli oluşur, TME kanseri gelişimi için çok önemlidir. Optimal büyüme koşullarını tespit etmek için kanser hücrelerinin monosit kemotaktik faktör salgılanmasını aracılığıyla çekmek. Burada monosit işe alım mekanizması tümör hücreleri vitrotarafından eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, bir indüklenebilir gen ifade sistem, arıtma birincil insan monosit ve bir geçiş yöntemi, Boyden odası tahlil bir örnek olarak kullanılır.
Sunulan protokolündeki ilk kritik adım shRNA dizileri sıralama tarafından her zaman değerlendirilmelidir Tet-ON vektör içine doğru klonlama emin olmaktır. Daha fazla fonksiyonel istikrarlı Tet-ON hücre hatları kurulması Western Blot tarafından KD Doksisiklin varlığında test ederek onaylanması gerekmektedir. Uygulamalı Doksisiklin miktarı hücre satır aralarını farklılık gösterebilir ve bu nedenle bu hücreler üzerinde etkili konsantrasyonları KD ve toksisite için test etmek için tavsiye edilir. Tetrasiklin-indüklenebilir sistemleri bilinen bir dezavantaj onların leakiness6,7' dir. Doksisiklin de tespit protein miktarı ölçülür ve bu etkisi için hesap için şifreli denetimlere karşılaştırıldığında gerekir. Vitro deneyler leakiness düşük düzeyde shRNA2 ve shRNA3 KD ile Şekil 2' de gösterildiği gibi görülmektedir. Ayrıca, her zaman protein düzeyleri kontrol koşullarda downregülasyon önlemek için serum tetrasiklin-Alerjik vitro kullanılması önemlidir. Bir tek vektör klonlama gerektirdiği bu protokol için kullanılan sistem diğer Tet-ON sistemleri üzerinde avantajları vardır birden çok klonların hızlı üretimi sağlar ve çok az düzeyde leakiness sergiler.
Birincil insan monosit kan alma kritik bir adım üzerinde yoğunluk gradient seyreltilmiş kan yavaş katman üzerinde dayanır iyi degrade ayrılık almaktır. Başka bir önemli adım Protokolü'nün antikor kokteyl ve manyetik boncuklar kan süspansiyon eklendi miktarını belirleyecek çünkü düzgün negatif seçim adım önce hücre sayısı tahmin etmektir. Deneyler tekrarlanabilirlik sigorta için birden fazla kan donör Çoğalt deneyler gerçekleştirmek için kullanılmalıdır. Düşük lenfosit kirlenme garanti çünkü bu teknik bir yoğunluk gradient ve yapışma tabanlı bir protokol34 ve tek degradeler21, bir iki adım yordamla gibi monosit arınma mevcut alternatifler üstündür düzey ve yüksek saflık (> % 95), elde edilen monosit. Beri sigara Monositik hücre tipleri PBMC karışım negatif seçim tarafından kaldırılır, monosit antikor antikor kokteyl mevcut ile doğrudan temas ve bu nedenle monosit etkileşim antikor aktif olma riski gelmez en az düzeydedir. Alternatif uygulamalar elde edilen hücre farklılaşma monosit makrofaj nerede insan monosit immünyetmezligi fareler enjekte edilir vitro ve in vivo deneyler yoluyla içine içerebilir. Değişiklikleri Protokolü'nün yaygın olarak PBMCs çamaşır adımları sırasında kırmızı kan hücre lizis arabellek kullanımını içerir. Bu değişiklik ek Temizleme kırmızı kan hücrelerinin ozmotik basınç uygulayarak amaçlamaktadır. Teknik sınırlamaları reaktifleri belirtilen miktarda kullanılarak elde edilebilir makrofajlar sınırlı sayıda içerir.
Boyden odası geçiş tahlil analiz Eğer salgılanan bir protein için bir hızlı ve doğru sözlü yol ya da bir hücre kültürünü geçiş diğer hücre tiplerinin uyarır. Bu tahlil tuzaklar düşük duyarlılık ve hücre ölümü gören hücreler için muhasebe değil içerir. Bir mikrosıvısal tahlil ve nerede geçiş daha kısa bir süre içinde ölçülür bir zaman ders deneme dayalı gibi bu endişelerini gidermek için yollar farklı bir tahlil sonuçlarıyla teyit. Küçük nüfus dışında olgun monosit vivo içinde35,36çoğalırlar değil; Ancak diğer hücrelerin kullanılması halinde, hücre sayısı artış önlemek için onların bölünme döngüsü kısa bir zaman çizelgesi seçilmelidir. Alternatif olarak, hücre bölünmesi engelleme reaktifler aslında kaplama cep numarasını değiştirme önlemek için kullanılmalıdır.
Burada sunulan protokolü için çalışmalar kanser hücrelerinin ve parakrin işlevleri tarafından salgılanan diğer proteinlerin kolayca adapte edilebilir. Koşullu KD kanser hücre satır olası uygulamalardan biri olan KD için toksik proteinlerin rolü eğitim sadece da nerede Tet düzenlenir hücre çizgilerdir fareler içine xenotransplanted ve KD Lipoatrofi vivo içinde vitro hücre içme suyu Doksisikline eklenmesiyle tümör kurulması sonra.

İlişkili tümör makrofajlar (TAMs) teşvik ederek tümör gelişmeye katkıda tümör büyüme, metastaz ve bağışıklık yanıtı2düzenleyen. Kanser tümör sızmak ve pro-tumorigenic TAMs3ayırt askere inflamatuar monosit hücreleri. TAMs ile tümör infiltrasyonu zavallı klinik sonuçlar ile karşılıklı olarak ilişkilendirir ve makrofajlar4,5immünsüpresif rolüne bağlı. Ancak, makrofajlar tümöre alımı mekanizmaları değil de incelenmiştir ve ilgili yollar daha iyi bir anlayış daha fazla alan ve umut verici tedavilerin ilerlemesi için çok önemlidir. Bir tümör hücreleri ve tümör microenvironment (TME) normal hücreleri arasındaki etkileşimler eğitim sorunları karmaşıklığına mekanizmaları ve hücreleri crosstalk diseksiyon izin vitro yaklaşımlar gerektiren yer var. Burada bir kanser hücre kaynaklı etkisini parakrin, salgılanan protein geçiş makrofajlar, vitrogibi diğer hücre türleri üzerinde çalışmaya uygulanan çok yönlü bir metodoloji mevcut. ShRNA karşı bir kanser hücre kaynaklı protein monosit işe dahil ifade tetrasiklin indüklenebilir düzenleyicinin kontrolü altında nerede bir sistemi kullanarak, monosit salgılanan protein parakrin etkisi quantitated. Bu protokol için düzenlenmiş vektör sunulan tetrasiklin içine shRNA dizileri klonlama istikrarlı kanser hücre hatları nesil tarafından takip. Ayrıca, birincil insan monosit ve Boyden odası tahlil arıtma monosit geçirilmesi üzerinde bir kanser hücresi elde edilen protein parakrin etkisini analiz için kullanılır.
Genlerin kodlama protein downregülasyon sınırlamalar rağmen kullanımı olmadan siRNA ve shRNA teknikleri ile yaygın olarak uygulanır. Uzun süreli knock-down (KD) genlerin deneysel sonuçlarla müdahale hücre ikincil adaptif yanıt temin. Gen ifadesinin üzerinde geçici kontrol eksikliği zamana veya rol bir proteinin hücre hayatta kalmak için çok önemli bir protein dinamik rolü çalışmaya zor yapar. Bu sorun, sadece tümör kurulduktan sonra bir protein tümör gelişimi ve ilerlemesi rolü downregülasyon ifade ilgi proteinin nerede gerektirebilir vivo içinde ayarları'nda, özellikle önemlidir. Koşullu KD çok erken bir öldürücü etkisi KD, hücrelerde ve koşulsuz KD içinde tümör geliştirme eksikliği neden olabilir ederken rol protein analizi farklı aşamalarında tümör büyüme, içinde etkinleştirmek için önleme avantajına sahiptir.
Koşullu KD sistemleri bir dizi istikrarlı KD sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. Koşullu gen ifade sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir. Tetrasiklin düzenlenir gen ifade sistemleri shRNA antibiyotik tetrasiklin (veya onun daha istikrarlı analog - Doksisiklin) eklenmesi üzerine ifade üzerinde denetim sağlar. Tet-ON sistemlerinde shRNA ifade tetrasiklin/Doksisiklin bir gen ekspresyonu KD, sonuçlanan huzurunda indüklenen Tet-OFF sistemlerinde iken, shRNA ifade gen ifadesinde kaynaklanan tetrasiklin huzurunda bastırılır. Tetrasiklin-indüklenebilir sistem yokluğunda Doksisiklin - sözde leakiness6,7, shRNA ifade daha önce bildirilen düşük seviyelerde dezavantajıdır. Tet-ON sistem burada, yapısal ifade tetrasiklin önleyici (tetra) protein Tet-yanıt veren öğe (TRE) sıra faiz shRNA organizatörü bölgedir H1 içinde bağlama tetrasiklin, yönetim anlatılan bastırılmış. ShRNA ifadesi ve çeviri tetrasiklin bağlı şekilde8,9ilgi protein inhibisyonu sonuçlanır.
Eşzamanlı knock-in sırası TATA kutusu ve proksimal sıra öğesi (PSE) arasında arasında TATA kutusu ve transkripsiyon başlamadan Chan ve arktarafından geliştirilen site TetO, diğer kullanılabilir Tet-ON sistemleri içerir. 10 bu toksik doz tetrasiklin shRNA ifade, ancak, Sigara kaynaklı bir devlet altında düzenleyen shRNA seviyeleri düşük daha az ifade gereklidir. Temel Krüppel ilişkili kutusu (KRAB) Tet-ON sistem11 KRAB, konular genlerin transkripsiyon bastırma KRAB bağlama siteye 3 kb aralığı içinde yer alan bir çinko parmak protein içerir. Chimeric protein tTRKRAB TetO için bağlayabilirsiniz, ve büyük-yelpazesine nedeniyle DNA kontrol edilebilir, TetO değil transkripsiyon arasında sınırlı olmak site ve düzenleyici başlangıç ve düzenleyici faaliyete düşük etkisi. Sigara kaynaklı durumu altında bu kontrol edilebilir RNA müdahale sistemi shRNA11,12Sızan ifade alt düzey göster rapor edilmiştir; Ancak, bir sıralı, iki-vektör klonlama yaklaşım gerektirir. İle karşılaştırıldığında daha önce geliştirilen koşullu KD sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemi veya sitokrom P-450 indüksiyon sistemi gibi tetrasiklin düzenlenir sistem sağlamlık ve reversibility bir avantaja sahiptir ve bu nedenle En iyi sistem13rutin olarak kullanılan. Bu protokol için kullanılan sistem gibi yalındır, tek vektör klonlama, birden fazla klon, hızlı üretimi izin gerektirir ve leakiness içinde çok az düzeyde sergileyen çift TetO çakma sistemi ve KRAB Tet-ON sistem üzerinden avantajı vardır Doksisiklin yokluğu.
TME kanseri gelişimi için önemlidir. Tümör büyümesini kolaylaştırmak için kanser hücrelerinin inflamatuar monosit kemotaktik protein salgılayan tarafından işe almak. İşe monosit tümör sızmak ve tümör büyümesini ve metastaz katkıda pro tumorigenic TAMs içine ayırt etmek. Vitro çalışmalar bağışıklık hücre alımı geçiş deneyleri kullanmak, Boyden ile14,15,16,17odası tahlil yaygın olarak kullanılır. Bu tahlil, chemoattractant protein kaynağı, örneğin, kanser hücrelerini veya saf protein alt Kamara içinde yer alıyor. Bağışıklık hücreleri geçirgen membran üzerinden alt bölme ile ayrılmış üst odası yer alır. Doğru chemoattractant, ve bu membran alt tarafında bulunan artan Degrade geçiş hücreleri lekeli ve mikroskop altında sayılır. Burada plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) chemoattractant fonksiyonu monosit üzerinde nerede ifade PAI-1 Doksisiklin ek tarafından düzenlenmiştir istikrarlı, indüklenebilir kanser hücre hatları oluşturarak test ediyoruz. İnsan birincil monosit Boyden odası geçiş assay olarak PAI-1 rolde monosit geçiş değerlendirmek için kullanıyoruz. İnsan birincil monosit ve THP1 gibi yaygın olarak kullanılan Monositik hücre hatları arasındaki farklılıkları bildirilmiştir ve farklı sitokin ifade desenleri18içerir; Örneğin, 5-10 kat artış TNF-α ifade düzeylerinde THP1 hücreleri tarafından insan monosit19' a karşılaştırılır. THP1 hücreleri insan lösemi Monositik hücrelerden türetilir, kolay korumak ve 19-50 h20saat iki katına ortalama ile çoğalırlar. Tam tersine, insan monosit yokluğunda büyüme faktörleri, kısa bir ömrü ile karakterizedir. Monosit bireyler arasında ve arıtma yöntemine bağlı olarak değişkenlik adil bir miktar oluşur bağış, kandan arındırılmış bu yana diğer hücre tipleri ile kontaminasyon oluşabilir. Bununla birlikte, birincil monosit ilgilidir ve kullanın veya birincil monosit Biyolojik araştırma19' kullanarak Monositik hücre hatları ile elde edilen sonuçları onaylamak için tavsiye edilir. Burada insan birincil monosit periferik kandan arınma için bir protokol açıklayın. Monosit arınma alternatif yöntemleri yoğunluk gradient ve yapışma protokolleri ve iki adım prosedürü Ficoll-Hypaque bir Percoll degrade21tarafından takip tek degradelerle içerir. Bu yöntemleri aralıkların % 70-90 arasında elde edilen monosit nüfus saflığı. Burada açıklanan yöntemi ile negatif bağışıklık seçimi22 takip yoğunluğu degradesi kullanan ve antikorlar ile doğrudan temas olmadan insan monosit arıtma böylece yanlışlıkla onların harekete geçirmek kaçınarak ve sonuçlanan sağlar bir > % 95 monosit saf nüfusu.
Burada sunulan Protokolü gen ekspresyonu KD insan kanser hücre hatlarında için işlevsel bir Tet-ON sistemi oluşturmak için kanser kaynaklı salgılanan protein PAI-1 monosit chemoattractant etkisini incelemek için kullanılır. PAI-1 tümörler çeşitli tarafından overexpressed ve onun ifade paradoksal zavallı klinik sonuç23,24ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. PAI-1 pro-tumorigenic rolü, pro-anjiogenik bir sonucudur ve anti-apoptotik25,26çalışır. PAI-1 makrofajlar iltihap27sitesine istihdamı teşvik ederek iltihap için katkıda bulunmak için gösterilmiştir. PAI-1 düz kas cellmigration28,29 teşvik etmelerini ve Mac-1 bağımlı makrofaj geçiş30' gösterildi. PAI-1 overexpression zamanda ham 264.7 makrofajlar işe alım B16F10 Melanom tümörler31içine önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Ancak, PAI-1 rolde TAM geçiş ayrıntılı olarak araştırmış değil. Olup PAI-1 monosit kanser hücrelerine çeken soruyu cevaplamak için açıklanan protokolünü kullanır. Bu metodoloji diseksiyon tümör ve TME arasında çapraz karışma kanser hücrelerinde salgılanan protein susturmak ve TME bileşenlerini analiz sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Tet-pLKO-puro lentiviral vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">21915</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS (Tetracycline-free)</td>
			<td style="width:177px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque</td>
			<td style="width:177px;">Sigma</td>
			<td>10771-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td style="width:177px;">StemCell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasySep Magnet</td>
			<td style="width:177px;">StemCell</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI HF</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AgeI HF</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R3552S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cut Smart buffer</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>B7200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:177px;">Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System</td>
			<td style="width:177px;">PROMEGA</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G vector</td>
			<td style="width:177px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:405px;">One Shot Stbl3 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C737303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain</td>
			<td style="width:177px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">123-869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td style="width:177px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XhoI restriction enzyme</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ligase buffer</td>
			<td style="width:177px;">NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA 0.5 M solution</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td style="width:177px;">Stem Cell</td>
			<td style="width:119px;">18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.1% Poly-L-Lysine solution</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;M syringe filters</td>
			<td style="width:177px;">VWR International</td>
			<td>28145-479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5881-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15504-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride(NaCl)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653-5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dithioerythritol (DTE)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B8255-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">792780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tryptone</td>
			<td style="width:177px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">J859-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">yeast extract</td>
			<td style="width:177px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">70161-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ampicillin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9393-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">puromycin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R1021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0&#956;m Transparent PET Membrane</td>
			<td style="width:177px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:177px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton-Tipped Applicator&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">MDS202000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol Hema 3 STAT pack&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">123-869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Resolve Immersion Oil, High Viscosity</td>
			<td style="width:177px;">Richard Allan Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:177px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conditional knockdown of gene expression in cancer cell lines to study the recruitment of monocytes/macrophages to the tumor microenvironment

siRNA ve gen ifadesinin düzenlenmesine (KD) yöntemleri yıkmak shRNA-aracılı protein ve gen işlevini anlamak için çok değerli araçlardır. Ancak, KD ilgi proteinin hücre öldürücü etkisi veya KD beklenen etkisini durumda Saat-bağımlı, koşulsuz KD yöntemleri uygun değildir. Koşullu sistemleri bu gibi durumlarda en uygun ve çok ilgi konusu olmuştur. Bunlar Ecdysone-indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir.
Düzenlenmiş tetrasiklin gen ifade sistem indüksiyon shRNA ifade tetrasiklin huzurunda tarafından protein ifade üzerinde ters çevrilebilir kontrol sağlar. Bu protokol için biz gen ekspresyonu koşullu düzenlenmesi için insan kanser hücre hatlarında fonksiyonel Tet-ON sistemiyle bir deneysel tasarım mevcut. Sonra tümör hücre-monosit etkileşim çalışma programında küçük bir sistem kullanımını göstermektedir.

Üç shRNA dizileri en verimli KD, PAI-1 için test edildi. Bunun için yukarıda açıklanan protokol sonrası Tet-pLKO-puro ifade vektör içine shRNA dizileri PAI-1 ve şifreli (Tablo 1) karşı klonlanmış. HT-1080 Fibrosarkom hücre kültürünü stabil oluşturulan yapıları ile transfected ve hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi edildi. PAI-1 ifade tarafından Western Blot ()şekil 2Adoğrulandı) ve PAI-1 ve tübülin karşılık gelen grup yoğunluğunu Dansitometresi tarafından analiz edildi. En etkili KD serisi (shRNA 2), biz Ayrıca MDA-MB-231 epitel meme adenokarsinom hücre (şekil 2B) ve HCT116 kolorektal Karsinom hücre (şekil 2C) stabil oluşturulan kullanarak bir tetrasiklin-düzenlenir ile transfected pLKO-shRNA2-PAI-1 ifade vektör (ve bir denetim olarak şifreli shRNA). MDA-MB-231 hücre kültürünü (şekil 2B) ifadesinde PAI-%1 74'ü azalma ve HCT116 hücre kültürünü Doksisiklin (1 µg/mL) varlığında % 17,5 azalma elde()şekil 2C) gibi Batı kurutma ve densitometric analizi tarafından değerlendirildi Bu bantlar. Boyden odası tahlil monosit kanser hücrelerinin doğru göç ölçmek için kullanıldı. O kanser hücre kaynaklı PAI-1 monosit tümör hücrelerinin doğru göç teşvik ve PAI-1 downregulated olduğunda bu nedenle daha az geçiş Doksisiklin eklenmesi tarafından tespit edilecektir onaylanmadığına karar. Kanser hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi edildi ve 40.000 hücreleri/iyi bir 24-şey plaka dibinde tohumlari. Arıtılmış birincil insan monosit tahlil ve 24 saat sonra en iyi odasında uygulandı, membran altına yapıştırılmış monosit lekeli ve mikroskop altında sayılır. Doksisiklin yokluğu ve PAI-1 varlığı bu nedenle, MDA-MB-231 ve HCT116 hücreleri (PAI-1 shRNA ve şifreli denetimleri), önemli ölçüde artmıştır ki insan monosit (şekil 3) geçiş göstermektedir. Monosit geçiş sonra % 33 ve % 74'ü tarafından Doksisiklin ortak kültürler eklendi ve PAI-1 tarafından tümör hücrelerinin üretimini aşağı düzenlenir (şekil 3A, C) inhibe. Monosit geçiş yok inhibisyonu Doksisiklin monosit geçiş üzerinde inhibitör etkisi vardı belirtilmiştir şifreli shRNA kontrolleri ile transduced tümör hücreleri ile gözlenmiştir. Doksisiklin tedavi kanser hücrelerinin şartına orta chemoattractants (3B rakam, D) kaynağı olarak kuyu dibine yerleştirildiğinde benzer sonuçlar elde edilmiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56333/56333fig1.jpg"> Resim 1 . XhoI kısıtlama analiz 16 bakteri kolonileri çıkarılan DNA'ın. DNA 16 bakteri kolonileri çıkarılan ve kısıtlama tepki XhoI enzim ile tabi. Elde edilen DNA parçalarının özel Jel Elektroforez tarafından analiz edildi. XhoI kısıtlama Özet sonra 2 kb parçası eksikliği olumlu klonlar (şerit 3, 8 ve 11) oklarla işaretlenmiş. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56333/56333fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56333/56333fig2.jpg"> Resim 2 . Kanser hücre hatları ifadede koşullu KD PAI-1. PAI-1 ifade hücre hatlarında analizini stabil kurutma Western tetrasiklin düzenlenir pLKO-shRNA-PAI-1 ile (shRNA 1-3) transfected ve ifade vektör Doksisiklin tedavi 3 gün sonra şifreli. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. Dansitometresi analysis of bands Batı yolları belirtilen çöplerinizi PAI-1 yoğunluk oranı olarak tübülin grup yoğunluğu üzerinde. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56333/56333fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56333/56333fig3.jpg"> Şekil 3 . PAI-1 teşvik makrofaj geçiş. (A)MDA-MB-231 ve (C) HCT116 hücre hatları stabil shRNA 2 PAI-1 karşı ve şifreli shRNA, koşullu ifade vektör ile transfected doğru insan monosit geçirilmesi ölçülen Boyden odası tahlil kullanarak. Kanser hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi ve nüsha bir 24-şey plaka numaralı seribaşı. İnsan birincil monosit üst Ekle uygulandı. 24 saat sonra filtre alt tarafındaki monosit lekeli ve mikroskop altında sayılır. İnsan monosit şartına orta doğru göç koşullu olarak PAI-1 Doksisiklin de ifade HCT116 hücre hatları 72 h (B) MDA-MB-231 ve (D) tarafından oluşturulan. Veri [+/-standart sapma (SD)] teknik triplicates ortalamasını temsil eder. Her çoğaltma için geçirilen monosit 9 alanlarda 20 X objektif büyütme sayıldı. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56333/56333fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oligo adını</td>
			<td></td>
			<td colspan="4">Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>shRNA 1 (anti PAI-1 sıra 1 - 8 )</td>
			<td>İlet:</td>
			<td colspan="4">shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ters:</td>
			<td colspan="4">shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>shRNA 2: (PAI-1 anti 2 sıra)</td>
			<td>İlet:</td>
			<td colspan="4">shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ters:</td>
			<td colspan="4">shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>shRNA 3 (PAI-1 Serisi - 3 anti 9)</td>
			<td>İlet:</td>
			<td colspan="4">shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ters:</td>
			<td colspan="4">shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Scramble (mücâdele serisi - 4 9)</td>
			<td>İlet:</td>
			<td colspan="4">1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3 mücâdele '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Ters:</td>
			<td colspan="4">Kapış 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. shRNA dizileri. Burada 3 shRNA dizileri PAI-1 karşı en güçlü silencing etkisi için test edilmiştir: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3 ve şifreli

Watch this Scientific Journal Video about Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

conditional-knockdown-gene-expression-cancer-cell-lines-to-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.2K Görüntüleme.  University of Southern California. Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Video: Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of nuclear apoptotic characteristics, including chromatin condensation and DNA breakage. Once the MMP collapses, cell apoptosis will initiate irreversibly. A series of lipophilic cationic dyes can pass through the cell membrane and aggregate inside the matrix of mitochondrion, and serve as fluorescence marker to evaluate MMP change. As one of the six members of the Cl- intracellular channel (CLIC) family, CLIC4 participates in the cell apoptotic process mainly through the mitochondrial pathway. Here we describe a detailed protocol to measure MMP via monitoring the fluorescence fluctuation of Rhodamine 123 (Rh123), through which we study apoptosis induced by CLIC4 knockdown. We discuss the advantages and limitations of the application of confocal laser scanning and normal fluorescence microscope in detail, and also compare it with other methods.

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Here we present a detailed protocol for the application of rhodamine 123 to identify the mitochondrial membrane potential (MMP) and study CLIC4 knockdown-induced HN4 cell apoptosis in vitro. Under common fluorescence microscope and confocal laser scanning fluorescence microscope, the real-time change of the MMP was recorded.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic probes to provide quantitative information on the chemical tumor microenvironment (TME), including pO2, pH, redox status, concentrations of interstitial inorganic phosphate (Pi), and intracellular glutathione (GSH). In particular, an application of a recently developed soluble multifunctional trityl probe provides unsurpassed opportunity for in vivo concurrent measurements of pH, pO2 and Pi in Extracellular space (HOPE probe). The measurements of three parameters using a single probe allow for their correlation analyses independent of probe distribution and time of the measurements.

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Low-field (L-band, 1.2 GHz) electron paramagnetic resonance using soluble nitroxyl and trityl probes is demonstrated for assessment of physiologically important parameters in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell lines or increasing its expression with overexpression cell lines. Transient and stable transfection are two methods that are often used for exogenous gene expression. Transient transfection is only useful for short-term expression, whereas stable transfection allows exogenous genes to be integrated into the host cell genome where it will be continuously expressed. As a result, stable transfection is usually employed for research into long-term genetic regulation. Here we describe a simple protocol to generate a stable cell line overexpressing tagged death receptor 3 (DR3) to explore DR3 function. We picked single clones after a retroviral infection in order to maintain the homogeneity and purity of the stable cell lines. The stable cell lines generated using this protocol render DR3-deficient HT29 cells sensitive to antimitotic drugs, thus reconstituting the apoptotic response in HT29 cells. Moreover, the FLAG tag on DR3 compensates for the unavailability of good DR3 antibody and facilitates the biochemical study of the molecular mechanism by which antimitotic agents induce apoptosis.

Establishing a stable cell line overexpressing a gene of interest to study gene function can be done by stable transfection-picking single clones after transfecting them via retroviral infection. Here we show that HT29-DR3 cell lines generated in this way elucidate the mechanisms by which death receptor 3 (DR3) contributes to antimitotics-induced apoptosis.

Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility in analyzing differential expression of groups of genes in tumor RNA-seq in a way that may be helpful for advancing precision oncology. However, CorEx produces many factors that can be challenging to analyze and connect to existing understanding. To facilitate such connections, we have built a website, CorExplorer, that allows users to interactively explore the data and answer common questions related to its analysis. We trained CorEx on RNA-seq gene expression data for four tumor types: ovarian, lung, melanoma, and colorectal. We then incorporated corresponding survival, protein-protein interactions, Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichments, and heatmaps into the website for association with the factor graph visualization. Here we employ example protocols to illustrate use of the database for comprehending the significance of the learned tumor factors in the context of this external data.

We introduce the CorExplorer web portal, an resource for exploration of tumor RNA sequencing factors found by the machine learning algorithm CorEx (Correlation Explanation), and show how factors can be analyzed relative to survival, database annotations, protein-protein interactions, and one another to gain insight into tumor biology and therapeutic interventions.

CorExplorer Web Portalı ile Tümör Gen Ekspresyonu Faktörlerinin Analizi

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many studies in the last decades. Therefore, it is important to develop methods to investigate the role of key genes involved in cancer cell stemness. Gastric cancer (GC) is one of the most common and mortal types of cancers. Gastric cancer stem cells (GCSCs) are thought to be the root of gastric cancer relapse, metastasis and drug resistance. Understanding GCSCs&#160;biology is needed to advance the development of targeted therapies and eventually to reduce mortality among patients. In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...