Resimlerle ilgili yardım için örnek eserleri ve Tin Ki Tsang&#39;a yardım için Ye Zhang&#39;a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ray Thomas Edwards Vakfı Erken Kariyer Ödülü ve JWW&#39;ye verilen C.-YS ve NIH hibelerine (R01DC009597 ve R01DK092640) NIH hibe (R01DC015519) tarafından desteklendi.

1.4 Kayıt için Donanımın Hazırlanması <ol><li> Alüminosilikat cam kapiller (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm) ile elektrotlar hazırlamak için bir pipet çekme aletini kullanın. Sineğin sivri içine sokmayı kolaylaştırmak için referans elektrodun ucunu hafifçe bir çift forsepsle hafifçe kıvırın ( ör . Sinek başının önünde, ağız parçalarının üzerinde yuvarlak bir plaka). NOT: Bu çalışmada 7 günlük WT erkekleri (Berlin) kullanıldı. Her iki elektrot için elektrolit olarak AHL tuzlu su çözeltisi 14 kullanın. </li><li> NaCI 6,312 g, KCI 0.373 g, NaHCO 3 0.337 g damıtılmış su 900 mL karıştırılmasıyla AHL 1 L hazırlayın, NaH2? 4, Trehaloz ּ 2H 2 O 1.892 g 0,1120 g, sükroz 3,423 g HEPES 1.192 gr, ve 1 M MgCl2 8.2 ml&#39;si. Damıtılmış su kullanarak toplam hacmi 1 L&#39;ye getirin. 1 N NaOH kullanarak pH&#39;ı 7.4&#39;e getirin ve çözeltiyi bir a ile sterilize edinVakumla çalışan filtre sistemi. Uzun süreli saklama için AHL alikotları 4 ° C&#39;de tutun. NOT: Tutarlı palmitoleik asit salınımı, kartuşlar arasındaki tekdüzeliğe bağlıdır. Her kartuşun tekrarlanabilir bir şekilde monte edilmesi kritik önem taşır. </li><li> Bir tıraş bıçağı kullanarak, 200 ml&#39;lik pipet ucunun ucundan 0,9 cm çıkarıp, ilk kartuş bölümünü oluşturun, 4,1 cm ölçün; Şekil 1A&#39;da ayrıntılı olarak verilen boyutlara bakın. Başka bir 200 mcL pipet ucu kullanın ve 1,8 cm ( Şekil 1A ) ikinci kartuş bölümü oluşturmak için, sırasıyla ucu ve tabandan 1,7 cm ve 1,5 cm kaldırın. Tekrarlanabilir olmasını sağlamak için bir cetvel kullanın. </li><li> Diskleri filtre kağıdından kesmek için ¼ &quot;delik açıcı kullanın. </li><li> İkinci kartuş bölümünün ucuna bir filtre kağıdı diski yerleştirmek için forseps kullanın. Kartuş ucunda hava yoluyla geçebileceği bir açıklık olduğunu görsel olarak teyit edin. </li><li> Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, birinci ve ikinci kartuş bölümlerini bir arada tutturun. İkinci kartuş bölümünü ön hazırlığa doğru kare oluşturmak için aşağı doğru eğin ( Şekil 1B ). </li><li> Kartuşu bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş koku iletme tüpüyle bağlayın. NOT: Bu tasarım kartuşun değiştirmeyi kolaylaştırmak için dışa doğru döndürülmesini sağlar ( Şekil 1C ). </li><li> Bir kütle kontrolöründe sabit nemlendirilmiş hava akışını 2 L / dk olarak ayarlayın ve odorant akışı başka bir kütle kontrolöründe 500 mL / dakika&#39;a ayarlayın. </li><li> Yazılımı kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın), 500 ms&#39;lik bir koku püskürtmeyi yönetmek için prosedürü programlayın. </li></ol> 2. Teslimat İçin Palmitoleik Asit Odorant Çözümlerinin Hazırlanması NOT: Or47b ORNs hem cis- hem de trans- palmitoleik aside tepki verir. Palmitoleik asit R&#39;de kararsız olduğu içinT, stoklar -20 ° C&#39;de saklanır ve açıldıktan sonra bir ay içinde kullanılır. Etanol, palmitoleik asit için tercih edilen çözücüdür. <ol><li> 1.7 mL mikro tüplerde on kat seri dilüsyonlar için 10 uL cis- veya trans- palmitoleik asit stoğu veya dilüsyonları 90 uL% 100 etanol ile iyice karıştırmak için bir girdap mikseri kullanın. Deneylerden önce günlük taze palmitoleik asit seyreltileri hazırlayın ve bir gün içinde kullanın. NOT: Etanolde çözünmeyen koku maddeleri için, diğer organik çözücülerle koku giderme hazırlamak için cam şişe kullanılması önerilir. </li><li> Bir P10 mikropipet kullanarak, ilgili her kartuştaki filtre kağıdına istenen dilüsyonların 5 μL cis- palmitoleik asit solüsyonları uygulayın. NOT: En yüksek dozaj miktarı (10 -1 ) bileşikten 450 μg içerir. Trans- palmitoleik asit solüsyonları için bunun yerine en yüksek dozajın (10 -1 ) 450 μg t içermesi için 4.5 μL uygulayınO bileşik. </li><li> Çözücüyü tamamen buharlaştırmak için, palmitoleik asit kartuşlarını bir vakum desikatörde oda sıcaklığında 1 saat ve basınç olarak 7.59 mmHg yerleştirin. NOT: Kartuşlar oda sıcaklığında 4 saate kadar kullanılabilir. </li></ol> 3. İn vivo Elektrofizyolojik Kayıtlar için at4 Sensilla&#39;ya Hazır Erişim için Drosophila&#39;nın Hazırlanması NOT: WT sinekleri (Berlin) standart mısır mezesi ortamında 25 ° C&#39;de 12:12 açık karanlık döngüde yetiştirilir. Ekillenme üzerine, sinekler cinsiyete göre onlu gruplara ayrılırlar; böylece gruplar 7 yaşına kadar gruplandırılırlar. Or47b erkek ve dişi sineklerde ORNs, palmitoleik aside tepki verir. Basitlik amacıyla, yalnızca erkek sinekler mevcut çalışmada incelenmektedir. <ol><li> Bir sinek hazırlama slaydı oluşturun: cam slaytta, cam slaytla ~ 3 ° açı oluşturan küçük bir modelleme kilinin üzerine bir cam lamel yerleştirin (18 x 18 mm 2 ). İç tarafa çift taraflı bant yerleştirinDg lamel ve hemen altındaki slayt alanı. Her kayıt günü için yeni bantla değiştirin ( Şekil 2A ). </li><li> Boru içinde ilgi sinek toplamak için bir sinek aspiratör 15 kullanın ve daha sonra boru sonuna 200 mcL pipet uç takın. Aynı anda pipet ucunun sonuna kadar sinek itmek için tüp içine hava üfleme sırasında tüp ileri hareket. Sinek gövdesinin hemen altında ve sinek üzerinde 2 baş uzunluğunda kesmek için traş bıçağı kullanın. </li><li> Pipet ucunun altını modelleme kili ile sıkıştırın, hem havadaki hem de antenler açık kalana kadar yukarı doğru itin ( Şekil 2B ). Sinek öldürmekten kaçınmak için, sineklerin karnının ezilmesine engel olduğu için, antenleri ve aristeleri ortaya çıkarmak için yalnızca yeterli kil ilave edin. Ayrıca, ani bir daralmayı önlemek için kil yavaş yavaş ve nazikçe ekleyin. Sinekin canlı olup olmadığını antennal&#39;ı kontrol ederek doğrulayın.Veya hortum hareketi. </li><li> Sineği barındıran pipet ucunu manevra yapmak için forseps kullanın. Kafanın gözlemcinin sağında olacağı şekilde başın yönünü ayarlayın. Antenin yan tarafı bantlanmış örtücü yüzeye ( Şekil 2B ) dayanıncaya kadar ince forseps kullanarak lamel boyunca hazırlıkları yapın. </li><li> Hareketi önlemek için antenin çift taraflı banda sabitlenmesi için tutucu çubuğu arista üzerine yerleştirin ( Şekil 2B ). NOT: Tutucu çubuk borosilikat cam kapilerden bir pipet çekici ile çekilir ve modelleme kili ile konumunda tutulur ( Şekil 2A ). </li><li> Hazneyi teçhizatın sahnesine yerleştirin ( Şekil 2C ). Mikroskopu kullanarak, trikoidlerin antenin üçüncü bölümünün distal-yanal kenarı boyunca görünür olduğunu teyit edin. NOT: İdeal olarak, sensilla, arka plana karşı açıkça siluetlenmelidir;<html> Kayıt etmeyi kolaylaştırır ( Şekil 3 ). Bu hazırlıkta erişilebilir trichoid sensürün çoğunluğu at4 tipindedir. </li><li> Hazırlık 2 , 15&#39;te tarif edildiği gibi, hazneden yaklaşık 2 cm uzaktaki ayrı bir hava besleme tüpü aracılığıyla verilen nemlendirilmiş hava akışının (2 L / dak.) Hazırlanmasını sağlayın ( Şekil 4 ). </li></ol> 4. Palmitoleik Asit&#39;e Yanıt Vermek İçin AT4 Trikoidlerde Or47b ORN&#39;lerinden At4 Sensillum Aktivitesinin Kaydedilmesi <ol><li> Referans elektrodu cıvataya sokun ( Şekil 3A ). Doku hasarını önlemek için, elektrotun, kütikül altındaki hemolimfe temas edebileceği yüzeyin hemen altına, hızlı ve düzgün bir hareketle yerleştirildiğinden emin olun. </li><li> Kayıt elektrodunu, hedef sensillum ile aynı görüş alanına girene kadar yavaş yavaş indirin (= &quot;Xfig&quot;&gt; Şekil 3B). 50X objektif lens altında kaydedin. NOT: Sert trikoidal kütikül, kayıt elektrodunun, daha geniş olan alanı, elektrotun dışarıya sapma ihtimalini azaltan daha büyük bir hedef sağlayan sensil tabana yerleştirilmesini gerektirir ( Şekil 3B , yerleştirme). </li><li> Bir duyarlığa koku uyarılarını uygulamadan önce, aşağıdaki seçim kriterlerine uyun; Bu standartları karşılamayan herhangi bir trikoid reddedilmeli ve bunun yerine bir başka sensillum seçilmelidir. <ol><li> Yüksek bir sinyal-gürültü oranına dikkat edin (bir örnek için Şekil 3C&#39;ye bakın). </li><li> At4A ve at4C nöronlarından belirlenebilir sivri gözlemleyin ( Şekil 3C ). Not: at4B başak genliği at4A 10&#39;a çok benzemektedir ve koku uyarımı olmadan kolayca tanımlanamaz. </li><li> At4A nöronlarının bazal ateşleme hızının20 Hz civarında veya altında. NOT: nöron için bazal ateşleme hızı basiconic ORNs 2 daha yüksek olduğu için bu kriter at4A özeldir. Çok daha yüksek bazal bir ateşlenme, elektrot yerleştirilmesi sırasında nöronların hasar görmüş olabileceğini gösterir. </li></ol></li><li> Kartuşu koku giderme borusuna bağlayın. Solvent kontrolü ile başlayın ve daha sonra düşük konsantrasyonlardan yüksek konsantrasyona kadar olan lokantaları kullanın. Kartuşu hazneye doğru manevra yapmak için mikromanipülatörü kullanın ve kartuşu hazırlığın başında kare şeklinde tutun. Kartuşun doğrudan birkaç milimetreden itibaren antene ( Şekil 4 ) işaret ettiğini görsel olarak teyit edin. NOT: Amaç, kartuşun açılmasını direkt olarak antende yönlendirmek ve hedef dokuya çok yakın konumlandırmaktır. </li><li> Odorant kartuşunun kayıt elektrodundan sağa 1 - 2 mm ve sinek önünden ayrıldığından emin olunP aşağıya yaklaşık 1 mm kaydırın. NOT: Burada açıklanan kurulumda, odorant kartuşu kayıt elektrodu, referans elektrotu ve slayt hazırlama slaydı ile yakından sınırlanmıştır ( Şekil 4 ). NOT: Kartuş ile kayıt / referans elektrotları arasındaki mesafeye dikkat edin. Yaklaşık 4 mm&#39;lik bir mesafe önerilir 1 . Kasıtsız temas, sinyali sonlandırabilir ve kayıt elektrotunun ucunu kırabilir, mevcut nörona zarar verebilir ve sonraki kayıtları zorlaştırabilir. NOT: Kartuşu ve hazır önlü slayt arasındaki mesafeyi göz önünde bulundurun. Lamelliğe dokunulduğunda, kaydı kesmek için kayıt elektrodunu yerinden oynatabilir. </li><li> Kaydı başlatmak için veri toplama yazılımındaki &quot;Kaydet&quot; düğmesine basın. NOT: Her 10 saniyelik kayıt için, 1.9. Adımda anlatıldığı gibi tek bir 500 ms koku kaynağı doğrudan antene gönderilir. </li><li> Odorant uygulamasından sonra,Kartuşu bir sonraki en yüksek yoğunluğa sahip bir kartuşla değiştirmeden önce dikkatlice geri çekin. Tüm dozaj aralığı elde edilinceye kadar devam edin. NOT: Uyumun muhtemel etkilerinden kaçınmak için, her sineğin tek bir Or47b ORN kaydettirilmesi önerilir. </li><li> Gün kayıt işlemini tamamladıktan sonra kayıt elektrodunu damıtılmış su ile iyice yıkayın. </li><li> Piyasada bulunan çevrimdışı analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve çizin. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems.">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li><li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila.">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila.">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li><li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons.">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li><li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein.">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li><li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins.">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).</li><li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila.">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li><li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids.">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li><li>Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+back+or+front:+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males.">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li><li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila.">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada Or47b ORN&#39;lerin palmitoleik aside verdiği yanıtların sağlam bir şekilde indükte edilebildiği ve kaydedilebildiği bir prosedürü açıkladık. Yetersiz feromon odorant verme sorununu gidermek için 2 , 7 , 10 numaralı geleneksel uzun mesafe koku alma yöntemini değiştirdik. Bileşimi, açılışları hazırlığın milimetre içinde konumlandırılmış olan odorant kartuşları vasıtasıyla dağıtarak düşük odorant volatilite sorununu ele aldık. Her bir odorant kartuşunun tutarlı yapımı ve yerleştirilmesi göz önüne alındığında, bu protokol kendiliğinden erişilemeyen odorantları tekrarlanabilir bir şekilde sunmanın etkili bir yöntemi olarak kendini gösterir. Burada açıklanan yakın menzilli koku sunma prosedürü, mevcut koku verme yöntemlerine göre önemlidir. Tarama dahil olmak üzere gelecekteki çeşitli uygulamalara izin verir.ow uçuculukta trichoid Sensilla 1 &#39;de yer sadece ORNs tepkiler için koku, ancak herhangi bir Sensillum türü bulunanlar. Prosedür, odorantları taşıyan bir cam kılcalı fiziksel olarak anten 6&#39;ya doğru hareket ettirmek yerine feromon oda sıcaklığının etkili bir şekilde havaya gönderilmesine izin verir. Modifikasyonumuz, sadece koku nabızını verdikten sonra palmitoleik asidin tetiklediği tepkileri gözlemlediğimiz deney sonuçları tarafından desteklendiği üzere, odorant içeren cam kılcalla doğrudan dokuya dokunma olasılığını en aza indirir. Buna ek olarak, yöntemimiz hızlı koku başlangıcı ve ofsetinin mükemmel zamansal kontrolü sağlar. İşlemin gösterilen potansiyeline rağmen sınırlamaları içermediği de belirtilmelidir. Prosedürümüzde, kartuşun konumlandırılması tamamen el ile yapılan ayarlara bağlıdır, bu kartuşu teknik olarak kartuşunDeneme duruşmaya kadar aynı yerde sally. Ek olarak, başarıyla yürütülmesini sağlamak için protokolün kritik adımlarına özel dikkat gösterilmelidir. Bazen belirli bir koku yoğunluğuna karşı oldukça değişken tepkiler elde edilir. Çoğu durumda, neden tutarsız kartuş yerleşimi izlenir. Buna ek olarak, kaydetmeden önce at4 sensilla için sıkı seçim kriterlerine uyulmalıdır. Yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip ( Şekil 3C ) düzgün at4A başak büyüklükleri, temel bir kriter iken mütevazi bir bazal ateşleme oranı nöronal hasarın yokluğunu gösterir. Bu prosedürün teknik zorluk derecesi, kuralı olan bir erkek ile hedef kadın arasındaki gözlemlenen yakını taklit eden aralıklardan feromon odorantlar verme kabiliyeti ile dengelenmiştir. Özetle, odorant sunum yöntemimiz Or47b ORN&#39;lerden SSR&#39;de kullanılmak üzere palmitoleik aside erişmenizi sağlar. Bununla birlikte,Bu teknik tek bir feromon ile sınırlı değildir, fakat daha önce erişilemeyen odorantları test ederken onu çok yönlü bir analitik teknik haline getiren diğer düşük volatiliteli odorantlara kolayca adapte edilebilir.

<html> Drosophila ORNs, geniş çapta karbon zinciri uzunlukları ve esterler, alkoller, ketonlar, laktonlar, aldehitler, terpenler, organik asitler, aminler, kükürt bileşikleri, heterosiklikler ve aromatikler dahil olmak üzere çeşitli işlevsel gruplarla çok sayıda kokuya tepki verirler 2 , 3 . Fizikokimyasal özelliklerinde çeşitlilik gösteren koku maddeleri, bileşiğin buhar basıncı ile belirtilen belirgin derecede farklı uçuculuklara sahip olabilirler. Özellikle, Drosophila melanogaster için biyolojik açıdan önemli olan odorantlar, uçuculuklarında muazzam farklılıklar göstermektedir. Örneğin, Ir92a ORNs 20 ° C&#39;de 6.432 mmHg buhar basıncı ile yüksek oranda uçucu olan amonyak 4&#39;e tepki verir. Buna karşılık Or67d ORN&#39;leri 20 ° C&#39;de 43 mmHg buhar basıncı olan bir erkek feromon cis- vekseten asetat ( c VA) 5 , 6&#39;ya cevap verir. Düşük uçuculuktaki odorantlara karşı olfactory yanıtını incelemek, odorantların bir taşıyıcı hava akımı yoluyla nispeten uzun bir mesafe boyunca ( yani, birkaç santimetre) iletildiği klasik koku iletme yöntemleri ile özellikle zordur.Böylece, bildirilen koku yanıtları Koku giderme sisteminin tasarımına bağlı olarak, büyük oranda değişiklik gösterebilir Örneğin Or67d ORN&#39;lerin yüksek bir c VA dozuna karşılık gelen yanıt, ~ 40 7 -&gt; 200 çarpı / s 6 aralığındadır Ayrıca c VA&#39;nın konvansiyonel verme yöntemleri ile etkisiz hale getirilmesi büyük olasılıkla sahte negatif sonuçlara neden olmakta ve bu da c VA&#39;nın Or67d ORN&#39;leri 8 harekete geçirmek için yeterli olmadığını yorumlamasına yol açmaktadır. Yakın menzilli koku iletme yöntemi 9. Bu nedenle imperaDüşük uçuculukta koku veren maddelerin etkin bir şekilde sunumu için sağlam bir koku iletim sistemi geliştirmek. Son zamanlarda, Or47b ORN&#39;ler için ligandlar olarak birkaç uzun zincirli kekiküler yağ asitleri tespit ettik. Tip 4 Antenn Trichoid Sensillum&#39;da (at4) yer alırlar. Uzun zincirli yağlı asit koku arasında, Or47b ORNs 1 etkinleştirerek erkek kur teşvik afrodizyak feromon olarak bu palmitoleik asit fonksiyonları bulundu. Bununla birlikte, geleneksel koku iletim yöntemini kullanan başka bir çalışmada, metil lauratın Or47b ORN&#39;lerinden yanıtlar çıkardığı gösterilirken, palmitoleik asit, aynı mesafeden 10 sunulduğunda tepki vermedi. VA C ile kıyaslandığında, uzun zincirli yağ asitleri, 25 ° C&#39;de 11 dan daha az 0,001 mm Hg buhar basınçları ile, daha az uçucu olan. Uzun zincirli yağlı asit odorantlarının doğal olarak düşük uçuculuğu, antene etkili sunumun önünü engeller;Geleneksel koku giderme sistemleri, muhtemelen sahte negatif sonuçlardan sorumluydu 10 . Bu tutarsızlık, düşük uçuculukta olan odorantları sunarken geleneksel koku iletim sistemlerinin yetersizliğini vurgular. Daha önce sinek cuticular kokuların etkili teslim koku kaynağı ve hedef dokuya 6 arasındaki yakınlığı gerektirdiğini gösterilmiştir. Bu nedenle, 12 , 13 doğadaki meyve sinekleri tarafından muhtemelen karşılaşılan mesafeyi taklit ederek biyolojik olarak aktif feromonların etkilerini tam olarak karakterize etmek için prosedürümüzde minimum mesafeye öncelik verilmesi gerektiği konusunda anlaşmıştık. Metodumuz, standart elektrofizyoloji teçhizatları ve teknikleriyle uyumluluk da dahil olmak üzere diğer avantajları barındırır. Mevcut teçhizat kurulumları, bu protokolü barındırabilmek için minimal modifikasyon gerektirir ve çoğu SSR basamağı küçük ayarlamalar gerektirir. BuTekniğini SSR&#39;de deneyimli araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilir kılmaktadır. Ayrıca, tekniğimiz, uyaran iletimini nöronal yanıt ile ilişkilendirerek keskin başlangıçlı ve ofsetli düşük volatiliteli odorantların sunumuna izin verir. Sonunda, donanım yerleşimi, odorant kartuşları arasında hızlı alışveriş yapılmasını kolaylaştırarak, istenen bir doz aralığında veri toplamanın hızlandırılmasını sağlar. Başvuru ve kayıt elektrotlarının, Yetişkin Hemolimf-Benzeri (AHL) çözeltinin, koku iletici kartuşların ve ilgili olfaktometre hazırlığının incelenmesi ile başlayacağız. Ardından, palmitoleik asit odorant solüsyonlarının hazırlanmasını ve ardından kayıt için sineğin hazırlanmasını tartışırız. Bu yöntemi kullanarak elde edilen temsili verileri sunmadan önce, odorant kartuşunun konumunu daha yakından kaydetmek ve daha yakından incelemek için trichoid sensillum seçme kriterlerini dikkate almaya devam ediyoruz. Son olarak, bu tekniğin faydalı uygulamaları keşfederek sonuçlandırıyoruzUe, bazı karşılaşılan sorunlar ve çözümleri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Böcekler, yiyecek arayışı, yırtıcılardan kaçınma, yumurta akı sağlığı ve çiftleşme gibi hayatta kalmaları için kritik olan geniş bir davranış yelpazesini yönlendirmek için koku duygularına güvenirler. Değişen uçuculuktaki sayısız kimyasal, böcek Koku Alıcısı Nöronlarını (ORNs) aktive eden doğal odorantlar olarak tanımlandı. Bununla birlikte, düşük uçuculuktan etkilenen odorantlara karşı olfaktör tepkiler üzerinde çalışmak, bu tür uyarıcı maddeleri geleneksel koku giderme yöntemlerini kullanarak etkin bir şekilde sunamamasından dolayı engellenmiştir. Burada, in - vivo Tek-Sensillum Kayıt (SSR) için düşük uçuculukta olan odorantların etkili bir şekilde sunumuna izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Koku kaynağı ile hedef doku arasındaki mesafeyi en aza indirerek, bu yöntem, palmitoleik asit, kur ve çiftleşme davranışı 1 &#39;de yer ORNs üzerinde gösterilen etkisi olan bir uyarıcı feromon içeren biyolojik olarak çıkıntı ama şimdiye kadar ulaşılamayan koku, uygulama için izin verir.Prosedürümüz böcek kokusu ve feromon iletişimi için düşük volatiliteli bir odorantı test etmek için yeni bir yol sağlar.

Tekniği, palmitoleik asidin cis ( Şekil 5B ) izomerlerine karşı trans ( Şekil 5A ) nispi etkinliğini belirlemek için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Temsilcili verilerimiz, trans- palmitoleik asidin, cis izoformuyla karşılaştırıldığında Or47b ORN&#39;ler için daha etkili bir ligandı olduğunu göstermektedir ( Şekil 5C ). Her sinekten, toplam 24 sinek için, dozaj eğrisi başına kaydedilen on iki sinek bulunan tek bir nöron kaydedildi. Kolektif veriler her birinde 8 sinek kaydedilmiş ve deneylerin üç bağımsız tekrarından elde edilmiştir. Hata çubukları sem&#39;i temsil eder Dikkat çekin, koku kartuşunun açıklığı ile sinek başı arasındaki mesafe kayıt sonucunda önemli bir etkiye sahiptir. P&#39;ye önemli bir cevap getirmek içinOr47b ORN&#39;lerde almitoleik asit, biz anten 1&#39;den yaklaşık 4 mm uzaklıktaki yakındaki yeşeyi takdim ettik ( Şekil 6A ). Palmitoleik asit antenden (~ 11 mm) uzakta sunulduğunda, aynı Or47b ORN&#39;lerinden anlamlı herhangi bir yanıt izleyemedik ( Şekil 6B ). Bu sonuçlar, palmitoleik asidin yakın menzil sunumunun önemini vurgulamaktadır ( Şekil 6C- D ). Veriler, 6 erkek sinekten (Berlin, 7 yaşında) paralel deneylerden toplanmıştır. Tek bir Or47b ORN kaydedildi / sineklendi. Hata çubukları sem&#39;i temsil eder <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig1.jpg" /> Şekil 1: Kartuş ve Olfaktometre Ayarı. ( A ) Koku kartuşlarının hazırlanması. Soldan sağa: standart 200 μLPipet ucu, birinci ve ikinci kartuş bölümleri ve tamamlanmış bir odorant kartuşu. ( B ) Kartuş, ikinci bölümün aşağı doğru eğim açısını gösteren, olfaktometreye bağlandı. ( C ) Mikromanipülatör üzerine monte edilmiş koku iletme tüpünü gösteren, koku veren bir kartuş bulunan olfaktometre ayarı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig2.jpg" /> Şekil 2: Drosophila Hazırlama. ( A ) Sinek, lamel ve tutma çubuğunun göreli konumlarını gösteren eksiksiz bir hazırlık. ( B ) Hazırlamanın yakın plan görüntüsü, sinek, anten orientasyonu ve sivri uçlarının konumunu gösterir. Tutucu çubuk arista üzerine yerleştirilir,Üçüncü anten segmentinin çift taraflı banda sabitlenmesi. ( C ) Rig kurulumu. Tüm önemli bileşenlere açıklama yapılır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig3.jpg" /> Şekil 3: SSR için at4 Sensillum&#39;un Tanımlanması. ( A ) hazırlamanın 4X görüntüsü, referans elektronun klipee yerleştirildiğini, tutma çubuğunun arista üstte olduğunu ve kayıt elektrodunun üçüncü anten bölümünün yakınına yerleştirildiğini gösterin. ( B ) at4 trikoid içine sokulmaya hazır elektrodun 50X görüntüsü. Başlangıç: Kayıt elektrodunun konumunun gösterimi. ( C ) Temsilci SSR temel sivri aktivite izleri, iyi (üst) veya zayıf (alt) sinyal-to-nois olduğunu gösterirE oranı. İyi bir sinyal-gürültü oranı, at4A ve at4C sivri uçlarının güvenilir tanımlanmasına izin verir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig4.jpg" /> Şekil 4: Kartuş Yerleştirme. ( A ) Odorant kartuşu birkaç mm&#39;lik bir mesafeden sivri başlı kare şeklinde hedeflenmektedir. ( B ) Farklı açıdan hazırlık ve olfaktometre hakkında bir başka görüş. ( C ) Hazırlık ve olfaktometre yakınlaştırma görüntüsü, yanıcı preparatın hazırlık öncesi slayt üzerindeki konumunu gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Şekil 5: Or47b ORN&#39;lerin, cis - veya trans- palmitoleik Asite tepki olarak Temsilci İzleri ve Dozaj Eğrileri. Or47b reseptörünü trans- ( A ) veya cis- palmitoleik asit ( B ) ile ifade eden at4A ORN&#39;lerden ( AB ) SSR. Kayıtlar, 7 günlük WT Berlinli erkeklerle yapıldı. Karşılık gelen başak rasterleri (ortada) ve bir peri uyarı zamanı histogramı (alt, 50 ms&#39;de binned) örnek izlerin altında (n = 12) gösterilmektedir. ( C ) Or47b ORN başak yanıtlarını cis - veya trans -palmitoleik aside kıyasla doz-yanıt eğrileri. Ortalama ± sem (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; t- testi). Ctrl: Palmitoleik asit içermeyen negatif kontrol. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig5large.jpg" target="_blank">Lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için. <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56147/56147fig6.jpg" /> Şekil 6: At4A&#39;nın palmitoleik asit ile aktivasyonu, yakın menzil stimülasyonunu gerektirir. ( AB ) 7 gün yaşlı vahşi tip Berlin erkek at4A ORN&#39;lerinden SSR. Cis- palmitoleik asit yakın bir aralıkta (~ 4 mm) veya daha uzakta (~ 11 mm) (n = 6) verildi. ( C ) Karşılık gelen tepe tepkilerinin karşılaştırılması (50 ms&#39;de binned, yumuşatılmış peri uyarı zamanı histogramları). ( D ) Karşılık gelen ortalama spike tepkilerinin karşılaştırılması. At4A&#39;nın palmitoleik asit yanıtları, uyaran mesafesi arttıkça belirgin şekilde düşer. Referans 1&#39;de Şekil S4&#39;ün izniyle basılacaktır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56147/56147fig6large.jpg" target="_blank">Görüntülemek için lütfen tıklayınız.</a>Bu rakamın daha büyük versiyonu.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K Görüntüleme.  University of California San Diego.  Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Nörobilim

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Koku için Arthropod Tepki için Dikey T-labirent Seçim Testi

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording<em&gt; Xenopus</em&gt; Sinir-kas Co-kültürlerin

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrofizyolojik Kayıt

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sirkadiyen Rhythms Eğitim ve Parametreler Uyku Lokomotor Aktivitesi Assaying Drosophila

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster

Larva Zebra balığı olarak önbeyin Elektrofizyolojik Kaydı

Koku için Arthropod Tepki için Dikey T-labirent Seçim Testi

Eşzamanlı Öncesi ve Sonrası-sinaptik Elektrofizyolojik Recording

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Elektrofizyolojik Kayıt

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem