Bu çalışma Postdocs için hibe Çin Özel Fonu tarafından desteklenmiştir (YF için No 2014T70392), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (YF için No 81673766), yeni öğretmen Priming Fonu, Bund'a Üniversitesi Zuoxue temeli ve geliştirme Shanghai en yüksek disiplinleri İntegratif tıp (20150407) projesi.

Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan Etik Komitesi Shanghai Medical College, Bund'a Üniversitesi (onay numarası 20160225-013) yönergeleri takip etti.
1. şeffaf Mouse ovarium hazırlanması
<ol><li>
Çözümler hazırlanması
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm (1 M, pH 7,6) % 0.1 ile hazırlamak Triton X-100 (PBST). 10 x PBS hisse senedi çözüm 1 L yapmak, 87 gram NaCl, NaH2PO4 · 3.1 g mix 2H2O ve 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L ve heyecan ~ 2 h. ayarlama pH 7.4 için 1 N NaOH ile ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Bu 10 x hisse senedi çözüm 1/10 tarafından seyreltik dH2O kullanarak ve % 0.1 yapın PBS Triton X-100.</li>
		<li>Mixings % (wt/vol) 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm, %4 (wt/vol) Akrilamid, % 0.05 (wt/vol) bisacrylamide ve % 0.25 (wt/vol) VA-044 başlatıcı buz üzerinde çift distile suda hidrojel çözüm (pH 7.5) hazırlayın.</li>
		<li>Takas çözüm (pH 8,5) 200 mM sodyum Borat arabellek içeren %4 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çift distile su karıştırılarak hazır olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial perfüzyon ve yumurtalık hazırlık
	<ol>
<li>Buz üstünde tüm çözümleri tüm işlemler sırasında tutmak.</li>
		<li>Yetişkin kadın vahşi türü C57BL/6 fare mayi enjeksiyonu Fentobarbital (0.35 mg/kg) çözüm ile anestezi. Toe-çimdik yanıt gösterir sonra fare düzgün anestezi.</li>
		<li>Kullanım fare ile bacaklarda düzeltmek için bant bir düz köpük tahta üzerine uzanmış.</li>
		<li>Kalp makas ile bir kesik göğüs, cilt ve kemik xiphoid süreci tarafından ortaya çıkarmak.</li>
		<li>Hayvanın Sağ atrium içine bir kesi yapmak ve buz gibi 1 x PBS 10 mL/dk 20 mL ile sol ventrikül sıvı.</li>
		<li>En az 20 mL hidrojel çözeltisi 10 mL/dk hayvanla sıvı.</li>
		<li>Cilt medioventral hattı boyunca karın üzerinde bütün enterocoelia ortaya koyar, makas ile deşmek ve bağırsak kaldırın. Yumurtalık yumurtalık Morfoloji bütünlüğünü korumak için rahim toplamak.</li>
		<li>Mikroskop altında yumurtalık etrafında yağlı doku kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gaz Giderme
	<ol>
<li>3 gündür fiksasyon için 4 ° C'de 10 mL hidrojel çözüm yumurtalıklar yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık 5 mL tüp içine aktarmak ve tüp hidrojel çözüm ile doldurun. Parafilm tüp üst üzerinde streç ve sonra parafilm tüp boyun etrafında sarın. Dikkat: hava kabarcığı yok parafilm ve hidrojel çözüm arasında olduğundan emin olun.</li>
		<li>Bir shaker en fazla polimerize hidrojel izin vermek için 3 h 37 ° C'de kuluçka tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yumurtalık bir spatula kullanarak jel kaldır ve yumurtalık etrafında gelen jel aşırı doku kağıt tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. Yumurtalık dört kez 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pasif takas
	<ol>
<li>10 ml Temizleme çözüm yumurtalık daldırın. 37 ° C'de temizleme işlemini başlatmak için 80 rpm'de hafifçe sallayın.</li>
		<li>İlk haftasında 3 günde çözüm değiştirin. Bir hafta öncesine kadar yumurtalık açık olur sonra bir hafta sonra takas çözüm yenileyin. Genellikle bu süreç yaklaşık 2-3 hafta sürer. Not: Yumurtalık immunostained olabilir doğrudan veya immunostaining önce birkaç hafta 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir sodyum azid (%0.02).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunostaining
<ol><li>Yumurtalık bir shaker olarak 37 ° C'de 1 günde iki kez PBST yıkayın.</li>
	<li>Bir shaker gün 2-3 37 ° C'de (Tablo 1) birincil antikorlar/PBST çözümünde tarihinde yumurtalık kuluçkaya İş burada, birincil antikorlar trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (CD31) sunuldu ve tirozin hidroksilaz sırasıyla 1:10 ve 1:50 PBST içinde seyreltilmiş. Dikkat: birincil antikor iki veya daha fazla tür kullandıysanız, farklı hayvan kaynakları olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile birincil antikorlar kapalı gün 4 bir shaker tarihinde yıkayın.</li>
	<li>Gün 5-6 bir shaker olarak 37 ° C'de PBST içinde istediğiniz ikincil antikorlar ile yumurtalık kuluçkaya. Burada sunulan çalışma, ikincil antikorlar tirozin hidroksilaz ve Alexa un 594 1:50 PBST de seyreltilmiş CD31 için Alexa un 488 içindi.</li>
	<li>PBST arabellek 37 ° C'de ile ikincil antikorlar kapalı bir shaker üzerinde 7 günü yıkayın.</li>
	<li>Doku Kırılma indisi homojenizasyon günde 8 için Kırılma indisi eşleşen çözüm içine aktarın. Kılavuz çizgilerini kılavuz çizgileri görülebilir olup olmadığını kontrol ederek onun görsel netlik kontrol etmek için bir kağıt doku koymak. Bir kez doku tam olarak açıklık vardır, yansıma.</li>
	<li>Sadece çevreler olabilir bir macun silindir doku yapmak ve bir at nalı Şekil şekil ve dış ridge bir cam slayt üzerine sıkıca kapalı bir yer açmak için tuşuna basın. Macun yüksekliğini yumurtalık biraz daha uzun olmalı.</li>
	<li>Açıklanan yumurtalık dikkatle macun ortasına yerleştirin ve Kırılma indisi çözüm eşleme ekleyin. Cam-alt çanak sıkıca macun koymak ve macun yemek düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>3. confocal mikroskobu
<ol><li>Confocal mikroskop ile görüntüleme için uygun çalışma mesafesi (içinde bu durumda 2.0 mm) ile (Bu durumda su daldırma 25 X objektif lens, 1.1-NA, 2 mm-WD) lens "Ni-E" panelinde seçin.</li>
	<li>
"Satın alma" panelinde kanal sayısını seçin. Burada, üç kanal kullanın.
	<ol>
<li>İlk olarak, "göz port" sekmesini ve XY denetleyicisi joystick ile mikroskop göz mercekleri kontrol ederek alanın ortasına doğru doku taşımak için kullanın.</li>
		<li>Çekim ışığı kapatıp açtıktan sonra "lazer gücü", "HV (kazanç)", ayarlamak için "canlı" sekmesini tıklatın ve "ofset ' her biri için ayrı ayrı kanal. Yüksek lazer gücü ve HV daha yüksek sinyalleri açabilir ve daha yüksek ofset arka plan gürültü azaltabilir.</li>
		<li>Uygun "tarama boyutu" ve "Count" seçin. Tarama boyutu 1024 x 1024 µm2 ve 4-8 sayısını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku derinliği panelinde tanımlamak için görüntü kalitesi "Z yoğunluğu düzeltme" ayarladıktan sonra ve sonra Yumurtalık (doku Center'da) en üst tabakası üzerinde objektif bulma ve üst katmanı edinmesinin ayarlama "artı" tıklayın üst katmanı tanımlamak için düğmesine basın.
	<ol>
<li>Lens aşağı taşı ve uygun HV ve lazer güç dokunun alt için ayarlayın ve en düşük katman bilgisi Z-yoğunluk düzeltme tabloya ekleyin. Bu ayar "ND edinme" paneli ile eşitlemek için "için ND" tıklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İçinde "ND edinme" paneli, ilk seti tarama sayısını adımlar. O zaman, belgili tanımlık tabs "Z" ve "Büyük resmi" kene.
	<ol>
<li>Doku sınır doku görselleştirme yoluyla göz mercekleri yardımıyla göre alanın boyutu tanımlamak için "İnceden inceye gözden geçirmek büyük görüntü" penceresine gidin. Tarama alanının ("alanlar") boyutunu girip % 10 ve % 15 arasında örtüşme seçmek için "ND edinme" paneli geri dön.</li>
		<li>"Run Z düzeltme", "otomatik olarak uygun HV, lazer güç ve ofset her bir katman için ayarlamak ve görüntüyü işlemek beklemek değil çalışma şimdi",'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D imar bireysel köklerinin ve onların Vasculatures
<ol><li>İlk olarak, ImageJ5 özgün NIS dosyasının açmak için kullanın. "Görüntü" düğmesini tıklatın ve "Renk" ve "Bölünmüş Kanallar" seçin. Ardından, "dosya" ve "Kayıt" "Görüntü sıralarını" seçeneğini kullanarak TIFF dosya serisi ayrı ayrı kanallar kaydedin.</li>
	<li>TIFF dosyası dizilerinde birini açmak için Imaris kullanın. "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ekle Kanallar" Seç gerisi kanalları eklemek için. Kanalın rengini ve adı "Ekran ayarlama" sekmeleri değiştirebilirsiniz. Doku kalınlığı "Düzenle" altında aşağı açılan listesinde "Görüntü özellikleri" panelinde düzeltilmesi gerekebilir.</li>
	<li>3D son görüntüleri ve aşırı bölümleri kaldırılması kırpma için "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ürün 3D" seçin. Alanın büyüklüğü kenarlığı sürükleyerek ayarlanabilir.</li>
	<li>
Gemi sinyalleri Surpass Masası'ndaki filamentler algoritması ile yeniden oluşturmak için yeni bir Filament oluşturmak ve İleri'yi tıklatın "Filamentler" düğmesini tıklatın.
	<ol>
<li>En büyük ve en ince çapı tanımlamak için "Dilim" Masası'na gidin ve izleme Taşıyıcıyı bulmak. Mesafe, "Ölçü" panelde iki noktada en büyük genişliğe geminin seçerek otomatik olarak gösterilecek.</li>
		<li>Tekrar "Surpass" Masası'na gidin ve ölçülen genişliği girin ve İleri'yi tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlangıç ve tohum noktası eşik ayarlayın. "Kamera" panelinde, "Seç". Bazı otomatik olarak üretilen küreler kaldırılması gerekiyorsa, Shift tuşunu basılı tutun ve üzerinde noktasını tıklatın. "Bul" seçme ve fareyi hareket ettirerek, yapısı doğru noktaları muhafaza edilmiştir ve İleri'yi tıklatın emin olmak için döndürülebilir.</li>
	<li>Yerel kontrast için en yüksek eşik seçin ve İleri'yi tıklatın. Değil "Tespit Spines" seçin ve kan damarı silindir yeniden inşası sonuçlandırmaya devam. Rengi "Renk" sekmesine tıklayarak düzenlenebilir. İstatistik verilerini yeniden oluşturulan Filament "İstatistik" panelinde elde edilebilir. Aşırı parça-ebilmek var olmak çıkarmak "Düzenleme" paneline. Not: Toplam köklerinin veya Folliküler duvarlar ses düzeyini ölçmek için diğer algoritmalar kullanılabilir. Burada sunulan çalışma, yumurtalar her iki ikincil antikorlar autofluorescence tarafından işaretlenen. Büyük miktarda veri nedeniyle bir iş istasyonu sunucu veri analizi için kullanıldı.</li>
</ol>5. istatistiksel analiz
Not: Görüntü analiz veri ± standart hataları aracı olarak sunulmaktadır.
<ol><li>Bağımsız örnek t-testi kullanarak köklerinin arasında karşılaştırmalar yapmak ve Pearson korelasyon testi korelasyon katsayıları foliküler duvar ve kılcal damar uzunluğu karşılaştırmak için kullanın. P değeri < istatistiksel anlamlılık sınırı olarak 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, H. M., Russell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculature+in+the+ovary:+development,+function+and+disease.">Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease.</a> Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).</li><li>McFee, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+signal+transduction+blocks+follicle+progression+but+does+not+necessarily+disrupt+vascular+development+in+perinatal+rat+ovaries.">Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries.</a> Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).</li><li>Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+analysis+of+vascularization+during+primary+development+of+an+organ,+the+gonad.">Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji: an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1-null+mice.">Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice.</a> Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).</li><li>Manni, L., Holm&#228;ng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+expression+of+alpha+(1)-+and+beta+(2)-adrenoceptors+and+p75+neurotrophin+receptors+in+rats+with+steroid-induced+polycystic+ovaries.">Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries.</a> Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).</li><li>Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+and+periovulatory+changes+in+tyrosine+hydroxylase+activity+in+the+ovary+of+the+catfish+Heteropneustes+fossilis.">Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis.</a> Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li><li>Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Serotonergic+Fibers+in+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+the+CLARITY/CUBIC+Technique.">Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique.</a> J Vis Exp. (108), e53673 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum:+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease.">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Sci Rep. 6, 26013 (2016).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).</li><li>Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ovarian+follicular+antrum+and+follicular+fluid.">Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid.</a> Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).</li><li>Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-follicle+barrier+(BFB)+in+disease+and+in+ovarian+function.">The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function.</a> Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clear(T):+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationalisation+and+validation+of+an+acrylamide-free+procedure+in+three-dimensional+histological+imaging.">Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging.</a> PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159, 911-924 (2014).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-of-acrylamide+SDS-based+tissue+clearing+(FASTClear):+A+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualisation+of+human+brain+tissues.">Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+three-dimensional+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue.</a> Sci Rep. 7, 9895 (2017).</li><li>Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+an+essential+role+of+vasoconstriction+in+rupture+of+the+ovarian+follicle+at+ovulation.">In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).</li><li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice.">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut çalışmada, kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki ilişkileri değerlendirmek için görüntüleme 3D tanıtacağız. Önceki çalışmalarda, aynı protokolü 9kullanarak rolleri büyük damarlara, köklerinin ve köklerinin olduğu gibi fare yumurtalık içinde konumunu arasındaki etkileşimler okudu. Pasif NETLİK yaklaşımı mikro ve makro vasculatures, folliculogenesis ve karşılıklı ilişkileri arasında corpora lutea ve köklerinin de yumurtalık mimarisi farklı gelişim dönemleri yeniden olarak çalışmaya izin verdi.
3D görüntü verileri olduğu gibi dokuların elde etmek için takas işleminin ilk önemli adımdır. İki ana strateji vardır — dehidratasyon ve hidrofilik reaktif tabanlı yöntemleri, pasif NETLİK10gibi. Su kaybı yöntemleri genellikle floresan sinyallerini azalmasına yol ve genellikle zehirli organik çözüm atık üretmek çünkü dikkatimizi pasif NETLİK yöntemi kullanmak için bazı adımlar çeşitli doku tipleri ile basitleştirilmesi üzerinde odaklanmıştır.
İlk kritik takas işleminin transcardial perfüzyon işlemdir. Perfüzyon sırasında kalp pompalama arka plan Floresans azaltmak için kan floş PBS ve hidrojel çözümün tüm vücut dolaşımda önemli bir rol oynar. Böylece, perfüzyon ameliyat doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken ve hızlı bir şekilde hayvan hidrojel önce erken ölümü önlemek için tamamen hayvan dağıtılır. Tüm ajanlar buza tüm deneme sırasında Liang et al. tarafından belirtildiği gibi tutulmalıdır 11veya perfüzyon tamamlanmadan önce polimerize başlayacak. Önemli bir adım hidrojel kaldırıyor ve mümkün olduğunca çok fazla jel olarak antikorlar korur çünkü kaldırmak gereklidir. Doku temizlenir sonra takas çözümden kaldırıldı ve takas çözüm çok fazla zaman çok fazla protein kaybolmasına neden olacağından PBS 4 ° C'de depolanan gerekir. Confocal mikroskobu görüntülemede Z-ayarlar her zaman önce X-Y aralığı ayarlamanız gerekir. İlk önce X-Y aralığı ayarlarsanız, Z-ayarlar X-Y alanın tamamı eşitlenemiyor.
Pasif NETLİK ilk Yang vd tarafından kullanılmıştır 12 onların protokolündeki onlar perfüzyon adım gerçekleştirmedi ve bunun yerine azot ile degassed. Buna ek olarak, onların takas çözüm bisacrylamide hidrojel çözüme eklemek değil, onlar % 8 SDS takas çözümde kullanılan ve Kırılma indisi için medya eşleşen jantlar kullandılar. Bu yöntem daha sonra SDS konsantrasyon13artan, perfüzyon adım ve nitrojen içermeyen gaz giderme yordamı14ekleme ve PARS mPACT15gibi diğer Temizleme yöntemleri yöntemiyle birleştirerek tarafından geliştirildi. Burada, daha fazla iletişim kuralı transcardial perfüzyon birleştiren ve nitrojen içermeyen gaz giderme, % 4 takas çözümde SDS azalan ve FocusClear kırılma daha kaliteli sağlayan medya, eşleşen dizin olarak kullanarak geliştirdiğimiz mikroskopi görüntüler.
Pasif NETLİK sonra yumurtalık foliküler damarlara sağlam 3D mimari elde etmek için confocal multiphoton mikroskobu ve görüntü analizi gerçekleştirilebilir. Bu iletişim kuralı tarafından antikorlar16oluştururlar penetrasyon için uygun bir optik şeffaf hidrojel melezleşmiştir nanoporous formu ışığı geçirgen olduğu gibi yumurtalık dönüstürür. Klasik 2D Seksiyonel histolojik analizler pasif NETLİK ve belirli işaretleri ile boyama kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki bağlantıların 3D eşleme sağlar.
Yetişkin dokularda etkin vasküler remodeling ve anjiogenezi ağırlıklı oluşur yara iyileşmesi, kırık tamir, tümör ve metastaz oluşumları, retinopathies, fibroses ve romatoid artrit17gibi patolojik süreçler sırasında. Ancak, folliculogenesis sırasında döngüsel değişiklikler damarlara remodeling için benzersiz kapasite temsil eder. İkincil foliküller test oluşumu sonra foliküler sıvısı doldurur ve oosit olgunlaşma ve foliküler gelişim18için uygun bir microenvironment sağlayan oosit ferahlık veriyor. Önceki 2D çalışmaları Imaging yumurtalık köklerinin bir ağ kılcal granulosa olaraktan19ile çevrili gösterdi. Granulosa katman nonvascular ve her folikül kendi kılcal damarlar tarafından çevrilidir. CD31 önemli rol vasculogenesis6ile tutarlı, artış kılcal damar uzunluğu folliculogenesis birincil ikincil foliküller (rakamlar 2 g ve 2 H) geçiş sırasında bulduk. Yerine rasgele bir dağıtım kapiller çevresinde bireysel birincil veya ikincil foliküller kapiller 3D imar kılcal damar dalları folikülleri içinde dağıtılmış büyük köklerinin algılanabilir olduğunu gösterdi ve bunlar çoğu durumda kılcal damar dalları içi boş alan (şekil 3) kurdu.
Bir büyük endişe adapte yöntemi yumurtalık temizlemek için oldukça uzun bir zaman alır, ama uzun süre için en iyi etkisi temizlenmesi gereklidir. Biraz zaman kazanmak için tüm gerekli örnekleri aynı anda toplama ve temizlenen doku PBS ve %0.02 sodyum azid 4 ° C'de birkaç ay için saklanabilecek olan çünkü onları birlikte temizlemek öneririz. Çalışma mesafesi confocal mikroskop başka bir kısıtlamadır. Yüksek büyütme objektif lensler görüntüleme kalın örnekleri için bir engel olabilir daha kısa çalışma mesafeler var.
Birkaç protokol şeffaf ve sağlam dokular, BABB20, ölçek21, 3DISCO22, berrak23, SeeDB24, NETLİK16, pasif açıklık da dahil olmak üzere görüntüleme için ortaya konan (4 ya da hidrojel25), tüm yumurtalık dokusu temizlenmesi ve değerlendirme9PAKTI12, kübik26,27, FASTClear28ve aslında29, ama sadece üç tane kullanılmaya başlandı, 30,31. SeeDB30 ve ScaleA231 tüm yumurtalık dokuları görüntüleme için getirilmiştir, ancak bu iletişim kuralları yalnızca bir tek immunostaining adım. Pasif NETLİK, ancak, bu da çalışmanın ve bizim önceki çalışma9gösterildiği gibi birden fazla protein etiketleme reaksiyonlar için sağlar.
Sonuç olarak, foliküler katmanları ve kan damarları tamamen açıklık yumurtalık dokusu kullanarak 3D yapısal ilişkisi belirlenmesi için adapte bizim protokol angiogenez farklı yumurtalık hastalıkları gibi çalışmak için yeni bir yaklaşım sağlar polikistik over sendromu ve yumurtalık kanserleri.

Folikül temel yapısal ve Fonksiyonel yumurtalık birimidir ve onun gelişme son derece yumurtalık içinde damarlara ilgilidir. Kan damarları beslenme ve hormonlar köklerinin sağlamak ve böylece büyüme ve olgunlaşma köklerinin1önemli rol oynarlar.
Seçici kan damarı işaretleri, transgenik fare modelleri ve ilaç geliştirme teknolojileri kombinasyonu yumurtalık damar ağları, anjiogenez ve kan damarlarının fonksiyonu hakkında bilgimizi artmıştır folliculogenesis. Bu remodels çeşitli doku ve damar ağları folliculogenesis ve yumurtlama sırasında yumurtalık etkin bir organ bilinir. Boyutu ve yapısı damarlarının etkin böyle remodeling geliştirme ve köklerinin işe biyolojik fonksiyonu için gereklidir.
Yumurtalık bölümler ve immunolabeling kan damarlarının kullanarak geleneksel histolojik ve histomorphometric yöntemleri için iki boyutlu (2B) görüntüleri2sınırlıdır. Üç boyutlu (3D) imar teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte, dokusu dilimlerin 2D görüntüleri 3D bir yapı yapmak için örtüşen, ancak bu yöntem, hala bazı sınırlamalar vardır — doku kesit microstructures, bazı kısımları yok doku genellikle eksik ve önemli emek dilimleri elde edilen görüntülerden 3B rekonstrüksiyonlar yapımında ilgilenmektedir. Bütün doku 3D görüntüleme confocal mikroskobu ile bu sınırlamaların çoğunu üstesinden gelebilir, ama bu yöntemlerin angiogenez embriyonik Over3değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Bütün doku NETLİK4 gibi yöntemleri takas kullanarak doğum sonrası ve yetişkin yumurtalık bu sorunları çözmek için görüntülenmeyecektir birimin artırabilir ve optik izni olmadan herhangi bir yapısal deformasyonlar yumurtalık tür yöntemler sağlar. Sağlam yumurtalık 3D mimari görüntüleme için görüntü analiz yazılımı, bu çalışmada kullanılan Imaris yazılım paketi gibi bir doğru görüntü veritabanı sağlar.
Yumurtalık yetişkinlik boyunca remodeling dinamik bir fizyolojik sistemin ve bu yönetmelik angiogenez soruşturmalar için mükemmel bir model yumurtalık yapar. Ayrıca, polikistik over sendromu veya yumurtalık kanserleri gibi kadın üreme sisteminin patolojik koşullarında yumurtalık kan damarları rolünün değerlendirilmesi tüm yumurtalık dokusu görüntüleme aracılığıyla okudu. Pasif NETLİK yöntem geliştirilmesi ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı kullanımı olması koşuluyla detaylı mekansal bilgi kan damarları ve köklerinin gibi yumurtalık yapıları arasındaki ilişkileri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1664">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:189px;">Vetec</td>
			<td style="width:127px;">v900845</td>
			<td style="width:861px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">A11039</td>
			<td style="width:861px;">https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Alexa Flour 594 (Dilution 1:50)</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">A11012</td>
			<td style="width:861px;">https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Bisacrylamide</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:127px;">172</td>
			<td style="width:861px;">http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Black wall glass bottom dish (Willco-Dish)</td>
			<td style="width:189px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:127px;">14032</td>
			<td style="width:861px;">http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Boric acid</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">10004818</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:487px;">Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O)</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">10020318</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">FocusClear</td>
			<td style="width:189px;">Celexplorer</td>
			<td style="width:127px;">FC-102</td>
			<td style="width:861px;">http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&#38;BRDarea=1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Parafilm</td>
			<td style="width:189px;">Bemis</td>
			<td style="width:127px;">PM996</td>
			<td style="width:861px;">http://www.parafilm.com/products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">80096618</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10)</td>
			<td style="width:189px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab28364</td>
			<td style="width:861px;">http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Photoinitiator VA044</td>
			<td style="width:189px;">Wako</td>
			<td style="width:127px;">va-044/225-02111</td>
			<td style="width:861px;">http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:189px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">S2002</td>
			<td style="width:861px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">10019318</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:487px;">Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O)</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">20040718</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">30166428</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">10019718</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:189px;">Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td style="width:127px;">30188928</td>
			<td style="width:861px;">http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:487px;">Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50)</td>
			<td style="width:189px;">Abcam</td>
			<td style="width:127px;">ab76442</td>
			<td style="width:861px;">http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional reconstruction of the vascular architecture of the passive clarity-cleared mouse ovary

Yumurtalık kadın üreme sisteminin ana organ ve kadın gamet üretim için ve endokrin sistem, karmaşık yapısal ilişkiler ve üç boyutlu (3D) damarlara mimarileri, ama kontrol etmek için önemlidir Yumurtalık de açıklanan değildir. 3D bağlantıları ve bozulmamış yumurtalık kan damarlarının mimarisini görselleştirmek için ilk önemli adım yumurtalık optik açık hale getirmektir. Doku büzülme önlemek amacıyla, biz hidrojel kullanılan pasif NETLİK fiksasyon tabanlı (Akrilamid melezleşmiştir Rigid temizleyin Lipid değiş tokuş görüntüleme / Immunostaining/In situ hibridizasyon-uyumlu doku hidrojel) protokol yöntemi sağlam bir yumurtalık temizlemek için . Immunostaining, Gelişmiş multiphoton confocal mikroskobu ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu yumurtalık damarlarının ve foliküler kılcal görselleştirme için kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, önemli bir pozitif korelasyon gösterdi (P < 0,01) foliküler kılcal damarlar ve foliküler duvar hacmi uzunluğu arasında.

Biz pasif yumurtalık foliküler ve vasküler mimari koruma ve damarları ve köklerinin etiketli işaretleri en yüksek floresan sinyal alma sırasında takas için hızlı ve basit bir yöntem pasif NETLİK yöntemi uyarlanmış. Foliküler damarlara 3D mimari CD31, endotel hücreleri6avans için immunostaining tarafından tespit edilmiştir. Yetişkin fareler yumurtalıklarda CD31 boyama Filament algoritmasıyla ve foliküler kılcal damarlar ve birincil ve ikincil foliküller (şekil 1) arasındaki karşılıklı ilişkileri gösterdi takip ettiler.
Yüzey algoritmaları ve nokta dönüştürme tirozin hidroksilaz-immunostained yumurta ve granulosa ve thecal Katmanlar algılamak ve köklerinin7,8toplam hacmini hesaplamak için kullanılmıştır. Köklerinin sıkıştırma nedeniyle, bazı bölümleri kırpılmış köklerinin yarı el ile tespit edilmiştir. Nokta dönüştürme bireysel foliküler birim ve yumurta ve foliküler duvar katmanların yüzey yeniden yapılanma ve gemilerin inşası Filament sonra bireysel foliküler vasculatures ve diğer arasındaki ilişkileri temizleyin ölçülen endeksi, özellikle granulosa ve thecal katman birimleri, (Şekil 2) tespit edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig1.jpg"> Resim 1 : Bir bozulmamış yetişkin mouse ovarium yüksek çözünürlüklü görüntü adapte pasif NETLİK protokolü ile takas sonra. (A-B) Bölümler ve XYZ büyük-edinme inceden inceye gözden geçirmek. Üç boyutlu (3D) kesilmiş orta (C) ve birincil (D) köklerinin (üst satır) ve 3D yeniden kılcal damarlar, yumurta ve granulosa/thecal (alt satır) aynı folikül hücrelerinin Filament tarafından tanımlandığı gibi gösterilir yüzey, ve Nokta dönüştürme algoritmaları. Ölçek çubukları 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D) =.  <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56141/56141fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig2.jpg"> Resim 2 : Birincil ve ikincil yumurtalık köklerinin ve onların vasculatures arasındaki ilişkileri karşılaştırmalı endeksleri. Oosit birim(a)foliküler birim ve yumurta nokta dönüştürme algoritması tarafından belirlenen bireysel folikülleri içinde 3D rekonstrüksiyonlar sonra ayıklandı ve (B) foliküler duvar birim yüzey tarafından belirlendi algoritma ve kılcal Filament algoritması tarafından takip edildi. Foliküler birim (C), oosit birim/kılcal uzunluğu oranı (D), foliküler duvar birim/kılcal uzunluğu oranı (E), foliküler birim/kılcal damar uzunluğu oranı (F), kapiller süre (saat) ve kılcal damar uzunluğu ve foliküler duvar hacim (G) korelasyon hesaplanan uygun araçları yazılım paketi kullanarak. Hata çubukları temsil eden standart hataları anlamına gelir. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56141/56141fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56141/56141fig3.jpg"> Şekil 3: Mouse ovarium ikincil köklerinin kılcal üç boyutlu rekonstrüksiyon. Bu ortaya (beyaz kareler göster alanı sınırları) köklerinin oosit yan üstüne içi boş bir boşluk. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56141/56141fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary at JoVE.com

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Görüntüleme.  Fudan University. Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.

Video: Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biyoloji

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Slide Preparation Method to Preserve Three-dimensional Chromatin Architecture of Testicular Germ Cells

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve the three-dimensional chromatin arrangement of testicular germ cells found in mice; this method has been termed as the three-dimensional (3D) slide method. In this method, testicular tubules are directly treated with a permeabilization step that removes cytoplasmic material, followed by a fixation step that fixes nuclear materials. Tubules are then dissociated, the cell suspension is cytospun, and cells adhere to slides. This method improves sensitivity towards detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) and the combination of these detection methods. As an example of a possible application of the 3D slide method, a Cot-1 RNA FISH is shown to detect nascent RNAs. The 3D slide method will facilitate the detailed examination of spatial relationships between chromatin structure, DNA, and RNA during testicular germ cell differentiation.

The material here describes a method developed to preserve the three-dimensional chromatin structure of testicular germ cells. This has been termed the three-dimensional (3D) slide method. This method improves sensitivity for detection of subnuclear structures and is applicable for immunofluorescence, DNA, and RNA fluorescence in situ hybridization (FISH).

Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

During testicular germ cell differentiation, the structure of nuclear chromatin dynamically changes. The following describes a method designed to preserve ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Dörtlü Dama Tahtası: İlaç Kombinasyonlarını İncelemek için Üç Boyutlu Dama Tahtasının Modifikasyonu

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...