Alison Michels Frederick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu dan Kanada kurumları, Sağlık Araştırma (CIHR) bir alıcı var. Laura L. Swystun alıcının CIHR bursu var. David Lillicrap bir Kanada araştırma sandalyede moleküler hemostaz alıcı olduğunu. Bu çalışmada kısmen grant (paspas-97849) çalışan bir CIHR tarafından finanse edildi.

Bu çalışmalar araştırma Etik Kurulu, Kraliçe'nin üniversite, Kanada tarafından kabul edildi.
1. endotel hücre stimülasyon
<ol><li>
Kollajen-kat 6-iyi doku kültürü plaka.
	<ol>
<li>24 s önceden, kat 6-iyi doku kültürü plaka kollajen 1 mL ile 37 ° C'de tampon (50 µg/mL sıçan kuyruk kollajen tip 1 ile 0,02 M buzul Asetik asit).</li>
		<li>Wells 2 mL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) ile iki kez yıkayın. Not: Tabak olabilir kalay folyo sarılı ve hava geçirmez bir plastik torba 4 ° C'de depolanan</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tohum büyüme orta içeren % 10 fetal sığır serum (FBS) 2 mL bir kuyu başına 1 x 106 hücre yoğunluğu, endotel hücreleri. 24 h 37 ° C'de (%5 CO2) için hücreleri kuluçkaya. Not: Burada, kan akıbet endotel hücreleri (BOECs) pasajlar 5 ve 15 arasında kullanıldı. BOECs Starke vd içinde başvurulan bir yöntem kullanılarak wildtype VWF sırası ile sağlıklı gönüllü izole edildi 22 bir şekilde bir daha önce Jüpiter23tarafından açıklanan benzer.</li>
	<li>Orta 24 h sonra kaldırmak ve HBSS hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>1 mL serum-Alerjik orta (en az önemli büyüme orta FBS olmadan) içeren phorbol 12-myristate 13-asetat ekleyin (PMA; 100 nM), unfractionated Histon (UH) ve HK veya İK (25 µg/mL hiç) hücreleri için 2 h 37 ° C'de (%5 CO2) için. Not: Bu konsantrasyon Histon Xu et al. tarafından önceki vitro sitotoksisite raporlara dayanarak yapıldı. 24 ve Abrams ve ark. 50 µg/mL kullanılan 25 .</li>
	<li>Orta 2 h sonra toplamak ve analiz kadar-20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. VWF Quantification enzim bağlı Immunosorbent Assay (ELISA) tarafından
<ol><li>Mikroplaka arabellek (10 mM dibasic sodyum fosfat ve 145 mM Sodyum Klorür, pH 7.2) içeren 10 µg/mL poliklonal anti-VWF antikor gecede 4 ° C'de kaplama 100 µL ile kat</li>
	<li>Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL tabak yıkama (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2).</li>
	<li>1:2 ve 1:4 yıkama arabelleği ile orta ölçekli örnekler sulandırmak ve 1:10 başlayan bir standart eğri normal başvuru plazma kullanmak seyreltme.</li>
	<li>Seyreltilmiş örnekleri ve standartları gecede 4 ° C'de 100 µL plaka</li>
	<li>Üç kez ile yıkama arabelleği 250 µL plaka yıkayın.</li>
	<li>Seyreltilmiş anti-VWF, HRP Birleşik algılama antikor (1.1 µg/µL yıkama arabelleği) plaka 100 µL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka yıkama ve üreticinin yönergelerine göre O boya dihydrochloride (OPD) Reaktif ile 10 min için kuluçkaya.</li>
	<li>100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4 ve okuma 492 plaka nm.</li>
</ol>3. katı faz Histon-VWF bağlama tahlil
<ol><li>Bir Mikroplaka % 0.5 sodyum deoxycholate 50 mM karbonat arabelleği (pH 9,6) gecede 4 ° C'de 10 µg/ml sulandırılmış Histon ile kat</li>
	<li>Üç kez 250 µL % 0.1 ile desteklenmiş PBS ile tabak yıkama ara 20, 10 dk arasında yıkama için kuluçka.</li>
	<li>PBS ile % 0,1 ara 20 ve % 1 sığır serum albümin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için takıma 200 µL ile plaka engellemek.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Seri olarak plazma kaynaklı insan VWF/faktör VIII karmaşık 200 mU/mL 25 mU/ml serum fizyolojik arabelleği seyreltik (10 mM dibasic sodyum fosfat, 500 mM Sodyum Klorür ve % 0.1 ara 20, pH 7.2). 100 µL oda sıcaklığında 2 h plaka ekleyin.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>VWF bağlamaya immobilize Histon 100 µL HRP için oda sıcaklığında 1 h için Birleşik PBS-0.1% ara 20 ve 1:1,000 tavşan poliklonal anti-VWF antikor içeren bir çözüm kullanarak bulmak.</li>
	<li>3.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>100 µL ile 30 dk OPD reaktif plaka kuluçkaya ve 100 µL ile reaksiyon 1 M H2o yüzden bırak4. Optik yoğunluk itibariyle 492 ölçmek nm.</li>
</ol>4. tohum akışı Chambers üzerine endotel hücreleri
<ol><li>Kollajen-kaplama arabelleği (2.1. adımda açıklanan) 0.5 mL radarı-kilit 1 mL şırınga yükleyin.</li>
	<li>Şırınga radarı-kilit sonu bir akış odası slayt rezervuar twist.</li>
	<li>Pistonu yavaş yavaş tüm lane kaplı ve her depo dolu kadar basın. Her lane için yineleyin ve 24 saat için 37 ° C'de odası kuluçkaya.</li>
	<li>Kollajen-kaplama arabellek 200 μL pipet ile Aspire edin. 1 mL HBSS ile başka bir şırınga yüklemek ve dalgıç yavaş yavaş akış odasının her lane yıkamak için tuşuna basın. Yıkama akışı odası karşıt ucunda 200 μL pipet ile Aspire edin. İki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 100 µL % 10 büyüme ortamında 3 x 106 hücre/mL endotel hücre (BOEC) çözümünün pipet FBS lane, bir akış odasının içine. Not: Endotel hücreleri tohumlama yoğunluğu odası kapasitesini aşıyor. Bu maksimum kanal kapsama sağlamak için. yapışık olmayan hücreleri içinde belgili tanımlık sonraki yıkama adım kaldırılır.</li>
	<li>Odası 24 h değişiklik için 37 ° C'de orta radarı-kilit şırınga (aynı derecede içinde adım 4.4) kullanarak her 8-12 h kuluçkaya. Şerit içinde hava kabarcığı yok görünür olduğundan emin olun.</li>
</ol>5. insan tam kan trombosit yalıtma
<ol><li>Bir biyolojik Emanet 30 G iğne ile kabine, asit-sitrat dekstroz arabelleği (85 mM TRISODYUM sitrat, 111 mM D-glukoz ve 71 mM sitrik asit, pH 4.5) 300 µL bir katkı maddesi içermeyen 3 mL kan toplama tüp ekleyin.</li>
	<li>Tam kan (Anti-trombosit ve non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar yedi gün boyunca ücretsiz) sağlıklı gönüllülerden iz (3 mL üç tüpler), Bernardo ve ark26tarafından Yayınlanan benzer bir iletişim kuralı aşağıdaki toplamak.</li>
	<li>İz ile ilişkili ilk doku hasarı spontan trombosit aktivasyon neden olabilir ilk tüp atmak.</li>
	<li>Yavaşça vacutainers üç kez kan antikoagülan ile karıştırmak için tersine çevirin.</li>
	<li>Vacutainers vasıl 150 x g 24 ° c (oda sıcaklığında) 15 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Ve dikkatle 15 mL konik tüp transfer yavaş yavaş bir pipet ile (süpernatant) trombosit açısından zengin plazma biyolojik Emanet dolabı çıkarın. Her tüp trombosit açısından zengin hacmi potansiyel çapraz-harekete geçirmek önlemek için tek bir konik tüp için transfer. Not: Biyolojik Emanet bakteriyel kirlenme ve potansiyel yapay trombosit ve/veya endotel etkinleştirme önlemek için kabine trombosit yalıtım yapılmalıdır.</li>
	<li>24 ° c (oda sıcaklığında) trombosit cips için 10 dk 900 x g, konik tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Pipet ve trombosit-yoksul süpernatant atın.</li>
	<li>Pelet dikkatle sitrat-glikoz-sodyum (CGS) arabelleği (13 mM sodyum sitrat, 30 mM D-glukoz ve 120 mM Sodyum Klorür, pH 7,0) 1 mL ile yıkayın. Not: Trombosit-ecek gözükmek WISP benzeri oluşumlar CGS arabellek eklendiğinde ve Pelet hafifçe resuspended. Yapılan trombosit aktivasyon tarafından kontamine trombosit değil kolayca resuspend ve biçimsiz görünecektir.</li>
	<li>Bir kez tam olarak resuspended, 900 x g 10 min 24 ° c (oda sıcaklığında) için de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>CGS yıkama arabellek kaldırmak ve Pelet Tyrode'nın arabellek (138 mM Sodyum Klorür, 5.5 mM D-glikoz, 12 mM sodyum bikarbonat, 2,9 mM Potasyum klorür ve 0,36 mM dibasic sodyum fosfat, pH 7,4) 3 mL resuspend. Trombosit tam resuspension emin olun ve toplamalardan gözlenir, örnek atmak.</li>
	<li>20 mM DiOC6 hisse senedi çözüm (erime 57.25 mg 5 ml metanol) 1,5 µL 1 µM son bir konsantrasyon için yıkanmış trombosit her 3 mL konik tüp ekleyin. Not: DIOC6 etiket trombosit için bu deneyde kullanılan yeşil flüoresan mitokondrial boya var.</li>
	<li>Üç 1,5 mL microcentrifuge tüpler yıkanmış trombosit çözümü aliquot 1 mL. Not: Bu deneme için gerekli trombosit cilt akışı odası, istenen kesme stres ve deney (adım 6.5) uzunluğu boyutu üzerinde temel alınarak hesaplanır. Sıvı akış için yeterli hacim olması için koşullar değiştikçe bu protokol ayarlanabilir.</li>
	<li>2s tecrit içinde yıkanmış trombosit kullanın.</li>
</ol>6. akış aparatı montaj
<ol><li>Steril silikon bir erkek dirsek radarı bağlayıcıyı bir ucunda ve diğer kadın radarı kilit adaptörü (1.6 mm iç çapı) boru 70 cm parçası ekleyin.</li>
	<li>20 mL şırınga için tüp bağlı kadın radarı kilit adaptörü takın.</li>
	<li>6.1 ve 6.2 iki kez üç özdeş şırınga-boru bağlantıları oluşturmak için adımları yineleyin.</li>
	<li>
Bir şırınga pompa sıvı akış oluşturmak için kullanın. Giriş şırınga pompa içine aşağıdaki ayarları: iç çapı şırınga ve akış hızı. Not: 20 mL şırınga bir 19.55 mm iç çapında. Akış hızı temel alınarak istenen kesme hızı/makaslama stres ve akış odası boyutları hesaplanır. 1 dyn/cm2 (içinde gözlenen düşük Venöz kesme), elde etmek için mevcut çalışmada kullanılan akış odası için bir akış hızı 9,37 µL/dk gereklidir. Histon Venöz tromboz için bağlama kanıt yüzünden orta Venöz bükme 4,45 dyn/cm2 seçilir. Bu da tampon su benzer bir viskozite vardır varsayımına dayanır. Akış hızı sonra çeşitli akış odası boyutları için akış hızı-ebilmek bulunmak vasýl hesaplamakta kullanılan 41.7 µL/dak denklemler için eşittir:<ol>
<li>Pompa enjektör pompa üzerinde düğme seçeneğini kullanarak sıvı geri ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektör pompa tüp bağlı üç şırınga yük ve şırıngalar ve itici etrafına köşeli ayraçlar sıkıca güvenli.</li>
	<li>Erkek dirsek radarı ikinci 20 cm biteviye-in steril silikon tüp her iki ucuna iliştirin.</li>
	<li>Bir dirsek radarı körelmenin 18'lik iğne için bağlayın.</li>
	<li>İki kez, akış odası için şerit üç üç özdeş Intake Sistemleri oluşturma tekrarlayın. Not: Yeniden önce distile su ve ardından % 10 çamaşır suyu ile silikon tüp ve yapma yıkanabilir. Bu akış odaları yeniden kullanmak için tavsiye edilmez.</li>
</ol>7. mikroskop ayarları
<ol><li>Tam otomatik bir sahne ile donatılmış bir iplik disk mikroskop kullanın. Aydınlatma ile 405, 458, 491, 543 ve 633 nm lazer çizgiler sağlar bir lazer denize indirmek gerçekleştirin. 20 X amacı ile tüm görüntüleri yakalamak. Analiz yazılımı (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) ile tüm parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Kanal ayarları seçin (emisyon filtre: 520/35), 491, uyarma ile nm, Alım için. Tam dinamik veri aralığı elde etmek için şarj kuplajlı cihaz 150, 200 MS, bir çekim hızı ile bir elektron çarparak kazanç için çarparak elektron ayarlayın. Not: Bir yeşil flüoresan boya, DiOC6, dalga boyu maxima ile trombosit etiketli (uyarma, 482 nm; emisyon, 504 nm).</li>
	<li>491 nm lazer güç % 20 için ayarlayın.</li>
	<li>Tüm şerit üç Merkezi işaretlemek ve z aralığı için 1 mikron ve 0.5 mikron adım boyu için seçin. Her 10 saat Puanlar (Yani, süre) ve bir yansımasını yakalamak için görüntüleri (Yani, aralığı) arasındaki süre seçin s; "60 saat puan" slayt seçin. Şerit üç görüntüleri yakalama ve bunları bir belirlenen deneme klasöre kaydetmek için mikroskop ayarlayın. Not: akış odası şerit üç olduğundan, çekim için üç pozisyon arasında geçiş yapmak mikroskop gerekir.</li>
</ol>8. VWF-trombosit dize oluşumu
<ol><li>Kültür orta akış odasından (Adım 4) kaldırmak adım 4.4 olduğu gibi aynı tekniği kullanarak.</li>
	<li>Her iki histamin (25 µM), PMA 100 µL ekleyin (100 nM), UH, HK veya 15 dakika oda sıcaklığında ve ortam O2co2BOEC monolayer uyarmak için (aynı derecede içinde adım 1.4) serum serbest ortamda seyreltilmiş HR (25 µg/mL hiç). Not: VWF yayımı için değil gerekli olmasa da, bu uyarımı 37 ° C de performans VWF ekzositozu27artıracaktır.</li>
	<li>Bunu üç sağlamak akışı odası ayrı şerit deneysel bir denetimi olarak işlenmemiş kalır.</li>
	<li>1 mL şırınga kullanarak orta kaldırmak ve 100-200 µL endotel monolayer kapalı secretagogues yıkamak için PBS, onun yerine.</li>
	<li>Akış odası yer odasında güvenliğini sağlamak için vasküler küçük resimleri kullanma bir slayt stand üzerine monte.</li>
	<li>Kullanılabilir erkek radarı konektörü (şırınga için bağlı) 70 cm boru ucundaki akışı odası rezervuarı iliştirin. İki diğer akış odası şerit için yineleyin.</li>
	<li>PBS yıkama kaldırmak için şırınga pompa başlatın. Karşıt akışı odası rezervuar içine pipet ek PBS şerit kuru çalıştırmayın emin olmak için.</li>
	<li>Akış sistemi eşdeğer akışı için tüm üç yolları gözlemlemek ve şırınga pompa duraklayın.</li>
	<li>Albümdeki her lane, deneyler arasında kabaca aynı bölgede orta hakkında yakalamak için bir alan seçin. Not: mikroskop çalışan kişi deneysel koşullar kör. Bu adım mikroskop trombosit akışı önce odaklanmıştır sağlar (7. adıma bakın).</li>
	<li>Bir kadın radarı coupler eklemek<a> </a>5 mL şırınga ve daha sonra ücretsiz erkek radarı konektörü (adım 6,8) ve yıkanmış trombosit solüsyon (Adım 5.13) içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp körelmenin iğneyi daldırın. Yavaş yavaş yok hava kabarcıkları sistemi içinde emin olmak için tüp ile trombosit çözüme çizin.</li>
	<li>5 mL şırınga kaldırmak ve erkek radarı akışı odası açık rezervuarı ekleyebilirsiniz. Üç şerit için yineleyin.</li>
	<li>Enjektör pompa yeniden başlatın ve karanlıkta 10 min için adım 7 mikroskop ve iletişim kuralı ayarlarını kullanma trombosit akışı sırasında esir alma imge.</li>
	<li>10 dk sonra radarı akışı odası rezervuar üzerinde emme boru bağlantısını kesmek ve rezervuar üzerinde endotel monolayer akışını korumak için PBS ile doldurun.</li>
</ol>9. VWF-trombosit dize miktar
Not: PBS, sürekli akış VWF-trombosit dize uzama görüntü analizi için korumak için gereklidir. Akışı kesilmesi küresel hale VWF neden olur ve VWF-trombosit dize miktar zarar. Bu görüntü yakalama sırasında her rezervuar PBS ile kontör için esastır. Bu adımı sırasında hücre daralma veya dekolmanı gözlem yapılırsa HBSS PBS değiştirebilirsiniz.
<ol><li>İlk lane ile başlayan slaytın orta etrafında bir 20 X objektif lens kullanarak çakışma olmadan slayt başına 10 resim yakalama. Her lane için bu işlemi yineleyin. Not: su depoları çevreleyen alanları çalkantılı kesme stres nedeniyle kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Görüntü işleme yazılımı kullanarak, parlaklığı ayarlamak yanında tıkırtı "görüntü,"Ayarlama"ve" Parlaklık/Kontrast."" Yapıştırılan trombosit-ebilmek var olmak görüş için yeterince iyi miktar kadar kaydırma çubuğunu sürükleyin.</li>
	<li>Üç veya daha fazla hizalanmış trombosit resimdeki gözlendiğinde VWF-trombosit dize kaydedin. Görüntüdeki tüm VWF-trombosit dizeleri saymak. Tüm 10 resimler için yineleyin ve deneme için ortalama. Not: miktar gerçekleştiren kişi için deneysel koşullar kör. Bu bağımsız çalışmalar8,28,29tarafından onaylandıktan gibi VWF için ortak leke gerekli değildir.</li>
	<li>Denemenin en az her salgılatıcı değerlendirmek için üç kez tekrarlayın.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

VWF-trombosit fizyolojik alaka VWF fizyon proteaz ADAMTS13 huzurunda onların hızlı dağılması nedeniyle tartışmalı kalır dizeleri, onlar trombosit alımı VWF tarafından bir sitede bir ölçülebilir vitro model olarak hizmet Histon düzeyleri5artışlar yerelleştirilmiş bir trombüsü varlığı şeklinde. Ayrıca, trombotik trombositopenik purpura (TTP) olarak - veya inflamatuar microenvironments - ADAMTS13 etkinlik-böyle eksik patolojiler içinde ADAMTS13 etkinliği inhibe VWF trombosit dizeleri vivo içinde32 gözlenen ve olabilir VWF33hemostatik ve proinflamatuar işlevleri bağlama trombosit microaggregation ve lökosit ekstravazasyonu için katkıda bulunur. Son olarak, bu olan bu VWF-trombosit dize oluşumu başlatan bir olay bir patolojik trombüsü inşa nidus şekillendirme Venöz ve/veya Arteryel tromboz içinde olabilir.
VWF-trombosit dize oluşumu akış odası sistemi WPB ekzositozu, ADAMTS13 bölünme ve trombosit Bağlama kapasitesi VWF, çalışma için kullanılabilir. Bu deneyler başarıyla yürütmek için birkaç önemli adım vardır. Ancak, model uygulamaya bağlı olarak, protokole değişiklik yapılabilir.
Endotel hücreleri belirli vasküler yatak türdeş olmayan mekanik ve biyokimyasal sinyalleri34yanıt. Bu nedenle bu yöntem uygulama için uygun bir hücre türü seçmek yararlı olabilir. BOECs proliferatif potansiyellerini nedeniyle mevcut çalışmada kullanılmıştır; fenotip çeşitli (10 +) pasajlar arasında Bakımı; ve VWF ekzositozu miktar kolaylaştıran sağlam VWF ifade. Diğer araştırmacılar insan göbek kullanmış damar endotel hücreleri (HUVECs)5,8,28 ve sigara endotel hücreleri (insan embriyonik böbrek 293 hücreleri) VWD mutasyonlar35 ifade VWF cDNAs ile transfected . VWF ifade önemli ölçüde doku ve gemi Fizyoloji36arasında değişen kanıtlanmıştır. Çeşitli mikro - ve macrovasculature kaynaklanan kültürlü endotel hücreleri VWF protein Bazal salgı37gözlemlenebilir farklılıkları var ve kalsiyum kanal endotel hücre alt türleri arasındaki farklar WPB etkisi kanıt ekzositozu secretagogues38yanıt olarak.
Histon bu çalışmada bir roman salgılatıcı kullanılmıştır. Onlar pozitif kontrolü, histamin, sık sık anlatılan fizyolojik uyarıcı VWF sürümü için karşılaştırıldı. VWF:Ag ELISA VWF yayın statik koşullarda endotel hücrelerden doğrulamak için kullanıldı. VWF sürümü tetiklemek iki hücre içi mekanizmalar vardır: hücre içi kalsiyum39 veya pf siklik AMP yükselmesine40seviyeleri. Bu yollar farklı harekete geçirmek sırasıyla Trombin/histamin veya adrenalin/vazopressin gibi secretagogues tarafından indüklenen (ya da, ilgili VWD, desmopressin), olabilir ve bu iki yolları bu akışı odası kullanarak karşılaştırmak ilginç olabilir VWF-trombosit dize oluşumu modeli. Trombo-enflamatuar hastalik bağlamında daha fazla aydınlatma sitokinler41 veya moleküler desen (DAMPS/PAMPS), hasar/patojen-ilişkili gibi inflamatuar Biyomarkörler ve rolleri VWF-trombosit dize oluşumu teşvik edilmektedir.
A1 etki alanı bağlama site glikoprotein IB trombosit11için ortaya çıkarmak için küresel VWF izlerken sıvı kesme stres önemlidir. En az bir sıvı kesme stres yaklaşık 0.73 dyn/cm2 trombosit bağlama VWF dizeleri42için gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Ayrıca, bu dizeleri form endotel hücreleri üzerinde nispeten kesme vurguluyor (2.5 dyn/cm2) düşük ama kesme gerilmeler 20 dyn/cm2 ve üzeri8, yerinden. Güncel araştırmada, biz bir Venöz kesme endotel, VWF ve trombosit arasındaki etkileşimler perfüzyon arabelleğin bir 10 min deney tasarrufu yapılmasına izin stres (4,45 dyn/cm2) seçildi.
ADAMTS13 bölünme VWF-trombosit dizeleri değerlendirmek için bu akış odası sistemi kullanarak bu bu deneyde kullanılan akışkan kesme stresleri artış gerektirir. Maksimal ADAMTS13 bölünme VWF-trombosit dizeleri oluşur 10 ve 30 dyn/cm212, yüksek kapsayan bir Aralık arasında orta Arteryel kesme stres43Venöz. Bu sistemde kesme hızı değiştirme VWF-trombosit dize oluşumu ve çözünme, faktörler, arteriyel, Venöz veya mikrovasküler tromboz gelişiminde katkıda karşılaştırmak için kullanışlı olabilir.
Bu tekniğin ek değişiklikler perfüzyon malzeme ve akış odası için yapılabilir. Secretagogues in vivo ortamlar benzemeye akış koşullarında yönetilebilir. Trombosit agonistleri ile onların reaktivite değerlendirmek için macun veya lökosit nüfus dahil olmak üzere bu tekniğin uzantıları vardır. Ayrıca, VWF multimer uzunluğu, trombosit Bağlama kapasitesi veya trombosit reaktivitesini hedefleyen terapötik ajanlar da dahil olmak üzere trombüsü geliştirme inisiyasyon düzenleyen önemli mekanizmalar aydınlatmak. Diğer araştırmacılar yoksa her iki şirket içinde44 kullanılan cam coverslip45, polimer esaslı slaytlar aksine bu çalışmada kullanılan ve benzer sonuçları elde etmek için görünmek akışı odaları satın.
Bir kritik VWF-trombosit dize protokolündeki yıkanmış trombosit hazırlanması noktadır. Tam kan ADAMTS13 varlığı nedeniyle bu iletişim kuralını kullanmak için tavsiye edilmez. Bu daha sonra olumsuz trombosit adezyonu VWF için etkileyebilir gibi prostacyclin veya apyrase, trombosit aktivasyon önleme aracılarını kaçınılmalıdır. Trombosit yalıtım önce oda sıcaklığına arabellekleri getiren sağlanması ve dikkatli pipet yöntemlerle (kabarcıklar ve sert kesme vurguluyor kaçınarakYani ) trombosit etkin olmayan durumda onların bakımı için anahtarıdır. Ayrıca, DIOC6 veya rodamine 6 G, gibi mitokondriyal bir leke ile trombosit etiketleme VWF bağlama için önemli olabilir ekstrasellüler etki alanları engel üzerinden tercih edilir. DIOC6 membran geçirgen bir boya olduğu için ancak, o da küçük miktarlarda endotel hücreleri tarafından deneme boyunca alınabilir. Floresan mikroskop yokluğunda, diğer çalışmalar parlak alan mikroskobu46kullanarak VWF-trombosit dizeleri gözlemledim.
Sonuç olarak, bu akışı odası metodoloji VWF-trombosit dize oluşumu içinde vivo gözlemler tromboz patogenezinde desteklemek için mekanik, gerçek zamanlı veri sağlayabilir. Güçlü yamultmak için pozlama VWF Trombo-enflamatuar hastalik oynadığı patofizyolojik rolü etkiler akışı odası modeli herhangi bir laboratuar endotel hücre-trombosit etkileşimleri bu anlamada baktılar için hayati bir araştırmacı araç olduğu bağlam.

Tromboz ölüm dünya çapında1 önde gelen nedenidir ve yanıt todysregulated trombosit aktivasyon ve Trombin nesil her iki veinsand arterler içinde gelişebilir. VWF plazma seviyeleri kan pıhtılaşması anahtar bir regülatör, mademki düzeyleri düşük (< % 50) von Willebrand hastalığı (VWD)2 ve yüksek düzeyleri olarak bilinen kanama bozukluğu sonucu (> % 150) Venöz3 riski ile ilişkili olan ve Arteryel4 tromboz.
VWF megakaryocytes ve endotel hücreleri tarafından sentezlenen ve trombosit α-granül ve WPBs, sırasıyla depolanan bir multimeric glikoprotein var. Kan durdurucu sargı meydan okuma, VWF endotel WPBs aktive endotel hücreleri5 veya maruz kollajen damar duvarı6dolaşımdaki trombositler urgan üzerinden yayınlanacak. VWF endotel hücrelere ankraj P-selektin7 ve integrin αvβ38tarafından aracılı olduğu gösterilmiştir. Trombosit α-granül mağazaları sonraki sürümü daha da trombosit-trombosit etkileşimleri trombosit tak oluşumu, koagülasyon cascade ve fibrin yayılması için gerekli iskele için stabilize etmek için yerelleştirilmiş VWF konsantrasyonları artırabilirsiniz Yeminli ifade. VWF trombosit-bağlama etkinliği tarafından multimeric yapısı, daha fazla kan durdurucu sargı aktivite9,10sahip yüksek molekül ağırlığı multimers ile düzenlenmiştir. Dolaşımda, VWF da pıhtılaşma faktör VIII bir taşıyıcı olarak davranır.
Sıvı kesme stres VWF Fizyoloji temel bir düzenleyicisidir. Yamultma stres yokluğunda, VWF küresel bir formda, trombosit glikoprotein IB yapışma11için bağlayıcı etki alanlarını gizlemek bulunmaktadır. Yamultma stres olmadığı durumlarda, bir metalloprotease, bir disintegrin ve metalloprotease ile trombospondin motifi (ADAMTS13), bölünme sitesine maruz kalmaktadır. ADAMTS13 böylece onun kan durdurucu sargı etkinlik12azaltarak multimer boyutu, düzenleyen çıplak ve trombosit dekore edilmiş VWF dizeleri cleaves.
VWF bir Akut Faz proteinidir ve hipoksi13, enfeksiyon14ve proinflamatuar sitokinler, dahil olmak üzere çok sayıda çekim gücü, VWF yayın endotel hücrelerden aracılık gösterilmiştir. Benzer diğer inflamatuar ajanlar, hücre dışı Histon da sistemik VWF sürümde fareler15,16 ve trombosit vitro17,18, aktivasyonu teşvik gösterilmiştir 19. bu lizin farklılıkları olarak Histon alt türü bağımlı olmasını gösterildi ve arginin içerik işlev15etkileyebilir. Lysine açısından zengin (HK) etkisini araştırmak için bir akış odası kurmak için çalışma hedeflerimiz model ve arginin bakımından zengin (HR) Histon alt türlerini ve endotel VWF yayın ve gerçek zamanlı trombosit secretagogues yakalama, potansiyel erken olaylarda iltihap kaynaklı kan pıhtılaşması.
Bu akış odası metodoloji subendothelial kollajen, endotel hücreleri, VWF ve trombosit arasındaki etkileşimler vivo içinde görsel, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir vitro sistemde beyannamedir. VWF-trombosit etkileşimleri WPB salgılanması, trombosit aktivasyon ve VWF proteolizis dahil olmak üzere, düzenleyen yolu tüm yönleriyle gerçek zamanlı değerlendirmesi için sağlar. VWF çalışmalar kontrollü kesme stres koşullarında VWF yayın ve trombosit-bağlama işlevi20, WPB Fizyoloji21ve VWF bölünme zarar VWD mutasyonlar değerlendirmek için ADAMTS135tarafından kullanılmıştır. VWF-trombosit dize oluşumu sonucu iltihabi bir uyarıcı olarak ölçmek için bu yöntemi kullanın: hücre dışı Histon.

<table><tbody><tr><td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3&#039; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>For VWF ELISA</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>For histone-VWF binding assay</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>For VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td></tr><tr><td>Normal Reference Plasma</td><td>Precision BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>For VWF ELISA standard curve</td></tr><tr><td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>For culturing and initial seeding of BOEC</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rat-tail Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>For endothelial cell stimulations</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>This product has been discontinued. We suggest using &amp;micro;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Blunted 18G Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Processing Software</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Von Willebrand faktör (VWF) trombosit adezyonu ve endotel hasarı sitelerdeki toplama aracılık eder ve bu faktör VIII dolaşımda taşıyan bir multimeric glikoprotein koagülasyon faktördür. VWF endotel hücreleri tarafından sentezlenir ve de yapısal plazma serbest bırakılır veya Weibel Palade organları (WPBs) adı verilen özel organelleri içinde yanıt Kan durdurucu sargı meydan okuma olarak isteğe bağlı yayın için depolanır. Procoagulant ve proinflamatuar uyaranlara hızla WPB ekzositozu ve VWF yayın teşvik edebilirsiniz. Endotel hücreleri tarafından yayımlanan VWF çoğunluğu plazmada dolaşır; Ancak, VWF bir kısmı endotel hücre yüzeyine demirli. Fizyolojik kesme koşullar altında endotel demirlemiş VWF nidus trombüsü oluşumu temsil edebilir bir VWF-trombosit dize oluşturan trombosit için bağlayabilirsiniz. Bir akış odası sistemi görsel olarak endotel hücreleri VWF sürümünden ve tekrarlanabilir ve VWF aracılı trombüsü oluşumu Patofizyoloji alakalı bir şekilde yakalamak sonraki trombosit gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, endotel hücreleri bir akış odasında kültürlü ve daha sonra secretagogues ile WPB ekzositozu ikna etmek için teşvik vardır. Yıkanmış trombosit sonra aktive endotel üzerinde derin. Trombosit aktif hale gelir ve daha sonra sıvı akış yönü uzun VWF dizelerinde bağlayın. Hücre dışı Histon procoagulant ve proinflamatuar uyarıcı kullanarak, biz endotel hücreleri Histon tedavi tedavi edilmezse endotel hücrelere göre artan VWF-trombosit dize oluşumu gözlenen. Bu iletişim kuralı bir nicel, görsel ve gerçek zamanlı değerlendirme modelleri trombozu ve hemostaz VWF-trombosit etkileşimleri aktivasyon açıklar.

Doğrudan VWF yayın endotel hücrelerden Histon etkisini değerlendirmek için için 2 h serum-Alerjik orta içeren PMA (pozitif kontrolü), UH, İK ve HK Konfluent BOECs biz maruz. Biz HK indüklenen VWF protein (VWF:Ag) işlem görmüş endotel hücreleri (şekil 1) orta logosuna 2 kat artış gösterdi. BOECs Ah ve İK ile teşvik zaman ilginçtir, orada daha az VWF:Ag orta tedavi edilmemiş durumda algılandı. Histon için doğrudan30VWF bağlayabilirsiniz çünkü onlar differentially kültür orta VWF:Ag algılama ile girişime neden olabilir ki biz onaylanmadığına karar. Histon bağlama VWF için değerlendirmek için bir katı fazlı bağlama tahlil kullanılan. Biz UH ve algılama girişimi destekleyen daha güçlü VWF HK (Resim 2), daha bağlı İK şekil 1' de gösterilen gösterdi.
Hücre dışı Histon trombosit vitro19etkinleştirmek gösterilmiştir ve Histon VWF yayın endotel hücrelerden aracılık verilerimiz öneririz. Histon etkisi VWF-trombosit etkileşimleri ayırdetmek için akışı odası modeli, VWF-trombosit dize oluşum hangi uyarılmış endotel hücreleri üzerinde etiketli trombosit periosteum kullanılır. Temsilcisi görüntüler yakalanan sonrası akışı, ve VWF-trombosit dize sayısı sayılabilir.
Biz akışı koşulları girişimi, tedavi edilmemiş hücreleri çok az VWF-trombosit dizeleri vardı gözlenen (< gözden geçirme başına 1 dizi), histamin ve PMA tedavi hücrelerin ortalama 2.10 ve 3.10 dizeleri, sırasıyla varken. Hücreleri HK ile tedavi edildi zaman önemli ölçüde daha fazla VWF-trombosit dizeleri kuruldu (3.52 dizeleri, P = 0,019), insan kaynakları (6.00 dizeleri, P = 0,004) ve UH (5,51 dizeleri, P 0.012 =). VWF dize trombosit grafik gösterimi şekil 3 ggösterilir. Tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla UH karşılık olarak gerçek zamanlı VWF-trombosit dize oluşumu videoları 1A ve Biçinde gösterilmiştir.
Bu çalışmalar, araştırmalar diğer gruplara göre birlikte o Histon28 ve histamin5 ve sitokinler31 gibi diğer proinflamatuar ajanlar VWF salgı endotel hücrelerden sonraki trombosit arabuluculuk teşvik göster içinde vitroyakalamak. Endotel hücreleri statik uyarılması VWF yayın Histon bağlamak ve VWF çekilmek için yeteneği nedeniyle aydınlatmak için yeterli olmadığını gösterdi. VWF yayın ve trombosit adezyonu akışı odası modelinin tasarımını bu nedenle daha tamamen karakterize ve endotel, VWF ve trombosit vivo içinde Hofstede model için gerekli oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55917/55917fig1.jpg"> Şekil 1: Lysine açısından zengin Histon VWF yayın kültürlü endotel hücrelerden indükler. BOECs (UH), Histon unfractionated ile teşvik lysine açısından zengin (HK) ve arginin bakımından zengin (HR) Histon kesirler. HK kültür orta içine VWF yayın teşvik. UH ve İK tedavi VWF:Ag endotel hücre orta tedavi edilmemiş (Untr) denetime göre tespiti düşmüştür. N ≥3 bireysel deneyler yapıldı. Veri ortalama değerleri ± SE. gösterilir *P < 0,05, **P < 0,01, ve ***P < 0,001 tedavi edilmezse durum göreli önemini belirtir. Bu rakam Michels ve ark15değiştirildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55917/55917fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55917/55917fig2.jpg"> Resim 2: VWF Histon bağlama VWF algılama Vitroile müdahale. Plazma kaynaklı VWF daha güçlü bir doz bağımlı moda lysine açısından zengin (HK) Histon katı fazlı bağlama tahlil göre insan kaynakları ve UH bağlar. Verileri ortalama değerleri ± SE. N≥3 bireysel deneyleri gerçekleştirilmiştir gösterilir. Bu rakam Michels ve ark15değiştirildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55917/55917fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55917/55917fig3.jpg"> Şekil 3: Histon aracılık VWF-trombosit dize oluşumu. Endotel hücreleri (HK), slaytlar unfractionated Histon (UH), lysine açısından zengin tedavi akışı odası numaralı seribaşı veya arginin bakımından zengin (HR) Histon kesirleri veya histamin/PMA (pozitif denetimleri) ve 10 min için 4,45 dyn/cm2 kesme stres, derin yıkanmış ile fluorescently etiketli trombosit. Temsilcisi görüntüleri sonrası trombosit akış işlenmemiş kontrol(a)ve histamin ile (B), Phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) (C), (D), HK tedavi hücreleri elde İK (E) ve (F) UH. PMA tedavi 3.1 dizeleri görüş alanı, histamin için karşılaştırılabilir başına ortalama sonuçlandı. VWF-trombosit dizeleri 10 ardışık inceleme alanları sayısal ve n≥3 bireysel deneyler (G) ortalama. Veri ortalama değerleri ± SE. gösterilir * P < 0,05 ve ** P < 0,01 belirtmek tedavi edilmezse durum göreli önemi. Bu rakam Michels ve ark15değiştirildi. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55917/55917fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı videolar. VWF-trombosit dize oluşumu Unfractionated Histon (2) ile karşılaştırıldığında (1) Hayır tedaviye yanıt olarak: bu video Michels ve ark15. modifiye <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55917/Supplemental_Videos.zip">Bu video indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

investigating-von-willebrand-factor-pathophysiology-using-flow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K Görüntüleme.  Queen's University. Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Video: Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Biyoloji

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Biyomühendislik

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

<meta charset="utf8"></head><body>Travma ve Transfüzyonda Trombosit Fonksiyonunu Değerlendirme Platformu

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying aspects of thrombosis and hemostasis. At high-shear environments simulating arterial flow, a microfluidic assay facilitates the study of platelet function, as platelet-rich thrombi form in a localized stenotic region of a flow channel. Utilizing devices that allow for small sample volume can additionally aid in evaluating platelet function under flow from volume-limited patient samples or animal models. Studying trauma patient samples or samples following platelet product transfusion may aid in directing therapeutic strategies for patient populations in which platelet function is critical. Effects of platelet inhibition via pharmacological agents can also be studied in this model. The objective of this protocol is to establish a microfluidic platform that incorporates physiologic flow, biological surfaces, and relevant hemostatic mechanisms to assess platelet function with implications for the study of trauma induced coagulopathy and transfusion medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Platelet function under flow can be assessed and simulated hemostatic resuscitation can be modeled using a microfluidic device, which has applications in trauma and transfusion medicine.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...