Yazarlar, P20GM103541 hibenin yanı sıra P20GM10344615 hibe numarası altında bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) aracılığıyla maddi destek için Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Sağlık Bilimleri Enstitüsüne (NIH) teşekkür ederler. Buradaki ifadeler NIH&#39;nin görüşlerini yansıtmamaktadır. Ayrıca, İleri Teknoloji Biyosistem Merkezi (Bioscience CAT) ödülü (12A00448) aracılığıyla maddi destek için Delaware Biyoteknoloji Enstitüsü&#39;nü (DBI) ve Delaware Ekonomik Kalkınma Ofisi&#39;ni (DEDO) kabul ediyoruz.

1. siRNA Nanokarbonlarının Formülasyonu <ol><li> PH 6.0&#39;da 20 mM 4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) tamponunda seyreltilmiş eşit hacimlerde siRNA ve mPEG- b- P&#39;nin (APNBMA) ayrı çözeltileri hazırlayın. <ol><li> 20 mM HEPES solüsyonuna 32 ug / mL konsantrasyonda siRNA ekleyin. NOT: siRNA hedeflenmemiş, evrensel bir negatif kontrol dizisidir; Bununla birlikte, siRNA ilgi konusu herhangi bir geni hedef alacak şekilde tasarlanabilir. </li><li> MPEG- b- P (APNBMA) polimerlerini bir 20 mM HEPES çözeltisine çözün. N / P oranının (mPEG- b- P (APNBMA) üzerindeki N, amin grupları; siRNA üzerinde P, fosfat grupları) 220 μg / mL&#39;lik bir solüsyon elde etmek için uygun bir miktarda mPEG- b- P (APNBMA) 4&#39;tür. NOT: mPEG- b- P (APNBMA) polimerleri için sentetik protokol, başka yerlerde bildirilmiştir 30 . </li></ol></li><li> MPEG- b- P (APNBMA) solüsyonunu damla damla eşit volümeE&#39;yi yavaş yavaş bir vorteks makinesinde karıştırırken. Polimer ilavesinin ardından 30 saniye vorteks uygulamaya devam edin. Numuneleri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. </li></ol> 2. Jel elektroforezini kullanarak siRNA salınımının ölçülmesi <ol><li> Nanocarrier&#39;leri adım 1.1-1.2&#39;ye göre formüle edin ve hacimleri istediğiniz numune sayısına uyacak şekilde ölçekleyin. </li><li> Nanokarrier&#39;i sodyum dodesil sülfat (SDS) ile karıştırın. <ol><li> Su içinde 1 mg / mL SDS çözeltisi hazırlayın. S / P oranı (S, SDS üzerinde sülfat grupları, siRNA üzerinde fosfat grupları) olan çözeltiler üretmek için gereken SDS çözeltisinin miktarını ayırın. NOT: Polipplex solüsyon 1 μg siRNA içeriyorsa, S / P oranı 15 olarak elde etmek için 13 μg SDS eklenmelidir. </li><li> Her bir nanocarrier solüsyonuna damla damla SDS solüsyonu ekleyerek hafifçe bir vorteks makinesi üzerine karıştırın. SDS ilave edildikten sonra 30 saniye boyunca girdaba devam edin. </li><li&gt; Örnekleri 3,000 xg&#39;de 5 saniye boyunca santrifüjleyin. Numuneleri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. </li></ol></li><li> Kalibrasyon yapın ve 365 nm filtre ile 200 W / m&#39;lik bir yoğunluğa UV lazeri ayarlayın. Işık yoğunluğunun, numune çözeltisinin tabanının oturacağı yerden ölçülmesini sağlayın. </li><li> Nanocarrier / SDS solüsyonunu kauçuk bir conta ile ayrılmış cam kayalardan oluşan bir cam bölmeye yükleyin. <ol><li> Cam slaytları su içinde 7: 3 (v / v) etanol / su solüsyonunda yıkayın ve tamamen kurutun. Bir delik (~ 2 x 3 cm dikdörtgen) kauçuk contaya kesin. Kauçuk contayı bir cam slayt üzerine yerleştirin. </li><li> Nanocarrier / SDS solüsyonunu kauçuk contanın deliği içindeki cam slayt üzerine pipetleyin. Kauçuk contayla temas etmeyi önlerken cam slayt üzerine fazla miktarda bir solüsyon yükleyin (fazla 20 μL). NOT: Sonraki aşamalarda bir miktar sıvı kaybolacaktır. </li><li> İkinci camı yerleştirinSürgülü contanın üzerine sürün. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, önce sürgünün bir ucunu aşağıya yerleştirin ve ardından diğer ucunu yavaşça indirin. </li><li> Kapalı tutmak için cam bölmenin her iki yanına bağlayıcı klipsler takın. </li></ol></li><li> 200 W / m&#39;lik bir şiddette 365 nm&#39;lik bir filtre ile UV lazeri kullanarak numuneleri istenen uzunlukta ( örneğin , 0-60 dakika) radyasyon uygulayın. Bağlayıcı kelepçelerini çıkarın ve bölmeyi açın. </li><li> Işınlanmış nanocarrier / SDS numunelerinden 25 μL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Çözeltileri 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. </li><li> Standart protokoller 31&#39;e göre Tris / Borat / EDTA (TBE) tamponlanmış solüsyonda 0.5 μg / mL etidyum bromür ile önceden boyanan% 2 agaroz jeli hazırlayın. 3: 7 (v / v) gliserol / sudan oluşan bir yükleme tamponunu hazırlayın. </li><li> Her nanocarrier / SDS örneğinden 25 μL&#39;ye yükleme tamponu çözeltisinden 5 μL ekleyin. Numuneleri karanlıkta inkübe edinOda sıcaklığı 10 dakika boyunca. </li><li> Her nanocarrier / SDS örneğinin 30 μL&#39;sini% 2 agaroz jeline yükleyin. Karanlıkta jel 30 dakika boyunca 100 V&#39;de çalıştırın. Etidyum bromür filtreli jel görüntüleme sistemi kullanarak jel görüntüsü alın. Jel görüntü dosyalarını kaydedin ve bant yoğunluğu niceliklemesi için adım 2.10&#39;a geçin. Şerit yoğunluklarının, sinyallerin doygunluğunun görülebileceği kadar parlak olmadığı kadar parlak olduğundan emin olun. </li><li> Halka açık ImageJ yazılımı 32 kullanarak bant yoğunluklarını ölçün. <ol><li> ImageJ&#39;nin ROI aracını kullanarak, her bir şeritte bulunan serbest siRNA bantlarının flüoresan yoğunluğunu, her bir bandın etrafına bir dikdörtgen çizerek belirleyin. Her şeridin yoğunluk eğrilerini çizin ve eğri altındaki alanı, yoğunluk eğrileri boyunca yatay bir çizgi çizerek ve kapalı alanların içindeki izleme çubuğunu tıklayarak entegre edin. </li><li> Her şeridin göreli yoğunluğunu cu altındaki alanı bölerek hesaplayınSiRNA pozitif kontrol eğrisinin altındaki alanla (mPEG- b- P (APNBMA) eklenmedi ve SDS eklenmedi) her bir numunenin rve&#39;si eklendi. Her numunenin normalleştirilmiş bant yoğunluğu olarak salınan siRNA yüzdesini rapor edin. </li></ol></li></ol> 3. Fluoresans Korelasyon Spektroskopisi (FCS) Kullanılarak Ölçülen siRNA Salınımı <ol><li> Algılama ipliğinin 5 &#39;ucunda tek bir floroforla işaretlenmiş siRNA elde edin. NOT: siRNA istenilen yere konjuge edilen etiketlerle önceden tavlanmış olarak satın alınabilir. Florofor, foto dengede olmalı ve mPEG- b- P (APNBMA) ile UV ışığı söndürme ve enerji transferini önlemek için 450 ila 750 nm arasında emici / emici olmalıdır. </li><li> Etiketli siRNA kullanarak adım 1.1-1.2&#39;ye göre nanokarbonları formüle edin. İstenen örnek sayısına uyacak şekilde hacimleri ölçeklendirin. </li><li> Çözeltileri SDS&#39;de inkübe edin ve adımlar 2.2-2.6&#39;ya göre istenilen süre boyunca ışınlayın. </li><li> preparFCS numune odasının atılması. <ol><li> Cam slayt 7: 3 (v / v) etanol / su çözeltisiyle yıkanır ve bir silme bezi ve hava akımı kullanarak camı tamamen kurutun. </li><li> Çift taraflı yapışkan ara parçasını ortaya çıkarmak için kağıt parçalarını bir çift taraflı yapışkanlı ayırıcıdan çıkarın. Yerleştiriciyi bir cam lameline tutturun. </li><li> Nanocarrier / SDS çözeltisini, yapışkan ara parçasından deliğin ortasındaki kapak kaymasına pipetleyin. </li><li> Cam kapağı lamellerin üzerine yerleştirin. Cam sürgüsünün ve lamelinin iyi bağlandığından emin olmak için cam sürgüsünü itin ve bir sızdırmazlık oluşturun. </li></ol></li><li> FCS ölçümleri için konfokal bir mikroskop kullanın 33 . 1.2&#39;lik sayısal açıklık ile 40X daldırma apokromat objektif kullanın. Numune başına her biri 10 s en az 30 ölçüm toplamak için uygun uyartım lazer kanalı (488 nm) kullanın 34 . Lazer yoğunluğunun ve dedektör hizalamasının korunduğundan emin olunHer numune için aynıdır. <ol><li> Deneysel örneklere ek olarak aşağıdakileri içeren kontrolleri ölçün: etiketli siRNA içermeyen boş bir numune; Ve etiketli siRNA fakat mPEG- b- P (APNBMA) içermeyen bir serbest siRNA örneği. </li></ol></li><li> FCS&#39;ye özgü yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Nano taşıyıcıların konfokal hacimden 29 geçmediği bir süre boyunca kararlı sayım oranını belirleyerek her numunenin başlangıç ​​sayım oranını belirleyin. <ol><li> Boş örneklemin sayım oranını her örnek başlangıç ​​sayımı oranı değerinden çıkarın. Serbest siRNA 35&#39;in yüzdesini hesaplamak için elde edilen değerleri normal siRNA kontrolüne normalize edin. </li></ol></li></ol> 4. Gen Susturmayı Öngörene Kinetik Modelleme <ol><li> Gen susturma tahmini için sıradan diferansiyel denklemlerin basit bir setini kullanarak matematiksel bir programlama dili ile komut dosyası oluşturma 29. NOT: Komut dosyaları istek üzerine kullanılabilir hale getirilebilir. <ol><li> Adi diferansiyel denklem setini şu şekilde yazarsınız: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq1.jpg" /> (1) <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq2.jpg" /> (2) <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/55803/55803eq3.jpg" /> (3) NOT: 1-3 denklemleri için, sırasıyla k mRNA , k siRNA ve k prot terimi sırasıyla mRNA, siRNA ve proteinin üretimi için hız sabitleridir. Sırasıyla, mRNA, siRNA ve proteinin parçalanması için hız sabitleri olduğu k m, deg , k s, deg ve kp , deg terimleri. Bozulma hızı sabitleri bileşen yarı ömürleri temel alınarak hesaplanır ve üretim hızı sabitleri, mRNA ve protein sabit durum değerlerine,F siRNA. <ol><li> Referans 36&#39;da açıklandığı gibi deneysel olarak veya literatürden (bkz. Tartışma ) ilgili gen (ler) için mRNA ve proteinin yarı ömürlerini belirleyin. Ayrıca, hücre hattı için katlama süresini belirleyin. Bu değerleri uygun parçalanma oranı ifadelerine girin. </li><li> Üretim hızı sabitlerini ayarlayın, böylece eğer gen ekspresyon seviyeleri hiçbir siRNA verilmemişse normalleştirilmiş 100 değerinde sabit kalacaktır. Spesifik olarak, [siRNA] &#39;yı sıfıra ayarlayın ve [mRNA] ve [protein]% 100&#39;lük ilk normalleştirilmiş değerin% 1&#39;i içinde kalana kadar k mRNA , k siRNA ve k protatif üretim hızı sabitlerinin değerlerini değiştirin. Simülasyon. </li><li> Daha önce tarif edilen jel elektroforezi ve FCS tahlillerinden tahliye edilen nispi miktarlarda siRNA kullanarak tahmini olarak, senaryodaki siRNA&#39;nın başlangıçtaki nispi konsantrasyonunu ayarlayın. Özellikle, [siRNA] salınan siRNA&#39;nın nispi miktarı ile orantılı olmalı ve maksimum miktara karşılık gelen 100 değeri 29 olmalıdır . </li></ol></li></ol></li></ol> 5. Hücre Kültürü ve In Vitro siRNA Teslimatı <ol><li> Tedarikçiden gelen protokollere göre NIH / 3T3 fare embriyonik fibroblastları kültürü. <ol><li> Hücreleri büyüme ortamı içinde büyütün (Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetus sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir). % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında 37 ° C&#39;de hücreler koruyun. </li></ol></li><li> 6 oyuklu doku kültürü muamelesi yapılan plakalardaki hücreleri tohumlandı. <ol><li> Tedarikçiden önerilen alt kültür yöntemini uygulayın. Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın. Eklenen büyüme ortamındaki hücreleri, 75.000 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin. </li><li> 2 mL hücre süspansiyonu (75,000 hücreS / mL) 6 oyuklu plakanın her oyuğuna ilave edildi. Hücrelerin inkübatöre 24 saat boyunca yapışmasına ve iyileşmesine izin verin. </li></ol></li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayarak ve her bir göze serum ve antibiyotiksiz transfeksiyon ortamı ( Madde Tablosuna bakınız) 1.5 mL ilave ederek transfeksiyon için hücreleri hazırlayın. </li><li> SiRNA nanokarbonları, adım 1.1-1.2&#39;ye göre formüle edin. Her oyuğa 30 pmol siRNA içeren 25 μL nanokarrier solüsyonu ekleyin. Karıştırmak için yavaşça medyayı yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri inkübatöre 3 saat yerleştirin. </li><li> Transfeksiyon medyasını çıkarın ve her oyuğu PBS ile yıkayın. Eklenen büyüme ortamı 1 mL ekleyin ve 30 dakika için kurtarmak için kuluçka hücrelerini yerleştirin. </li><li> Hücreleri, bir ışık uyarısı ile tedavi için hazırlamak için, ilave büyüme ortamını çıkarın. Her göze 1 mL transfeksiyon ortamı (fenol kırmızısı olmadan) ilave edin. NOT: Transfeksiyon ortamının fenol kırmızısı içermediğinden emin olun. </li><li>Kalibrasyon yapın ve 365 nm filtre ile 200 W / m&#39;lik bir yoğunluğa UV lazeri ayarlayın. Işık yoğunluğunun, hücre plakasının tabanının oturacağı yerden ölçülmesini sağlayın. </li><li> Hücreleri 37 ° C&#39;ye ayarlanmış sıcak bir tabağa koyun. Hücrelerin plaka kapağını çıkarın. 200 W m- 2 yoğunluğunda bir 365 nm filtre ile UV lazeri kullanarak hücreleri plakanın üstünden istenen zamanda (20 dakikaya kadar) radyasyon uygulayın. </li><li> Transfeksiyon ortamı çıkarın ve 2 mL eklenmiş büyüme ortamı ekleyin. İnkübatörde daha fazla analiz yapılıncaya kadar yerleştirin ( örn. , QPCR için 24 saat ve Western blotlama için 48 saat). <ol><li> Western blotlama 37 ve qPCR gibi çeşitli teknikler kullanarak gen ekspresyonundaki değişiklikleri ölçün. 38 GFP gibi görünür sinyallere sahip genler için, floresan mikroskopisi 29 kullanın. NOT: Bu teknikler, kullanım kolaylığı ve doğruluğu nedeniyle önerilmektedirGen ifadesinin nicelleştirilmesinde </li></ol></li></ol> 6. Bir Genetiksiz Ortada Silencenin Kontrol Edilmesi <ol><li> 5.1-5.7. Adımlara göre kültür, tohum ve transfect hücreler. </li><li> Tamamen 365 nm ışığı bloke eden ve yansımaları en aza indiren bir fotomask hazırlayın. NOT: Bu durumda sırasıyla ışığı engellemek ve yansımaları azaltmak için 10 x 10 cm boyutlarında alüminyum folyo ve siyah yaprak kağıdı kullanılmıştır. Alüminyum folyo ve inşaat kağıdı, tek bir ünite oluşturmak üzere birlikte yapıştırılmıştır. <ol><li> İstenen şekli fotomakize kes / punch / machine. Örneğin, düz kenarlı bir desen (~ 5 cm uzunluğunda) ve fotomaskda dairesel bir desen (~ 7 mm çap) oluşturmak için keskin kenarlı bir bıçak ve delik açıcı kullanın. </li></ol></li><li> Yansıtıcısız tarafı olan hücreleri içeren kuyunun altında ortalanmış olarak, 6-kuyucuklu plakanın tabanına fotomakoz yapıştırın ( ör . Siyah cOnstruction kağıdı) tabağa bakar. Tutkalın desenin kenarına (~ 3 mm içinde) yerleştirilmemesine dikkat edin. </li><li> İki halka stantını yaklaşık 25 cm&#39;lik aralıklarla kurun ve platformların eşit yükseklikte olmasını sağlamak için her halka standına bir platform takın. Plakayı platformların üstüne dayayarak iki ayaklık arasında hücre plakasını askıya alın. Plakanın düz olduğundan emin olun. </li><li> 200 W / m 2 yoğunluğunda bir 365 nm filtre ile UV lazeri kullanarak hücreleri istenilen süre boyunca (20 dakikaya kadar) numunenin altından ışınlandırın. </li><li> Transfeksiyon ortamı çıkarın ve 2 mL eklenmiş büyüme ortamı ekleyin. En az 24 saat boyunca iyileşmek için inkübatöre yerleştirin. Floresan mikroskobisini tanımlanan hücreleri 29 tarif edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Forbes, D. C., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+small+RNA+and+DNA.">Oral delivery of small RNA and DNA.</a> J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).</li><li>Bouchie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Companies+in+footrace+to+deliver+RNAi.">Companies in footrace to deliver RNAi.</a> Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).</li><li>Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Polymeric+Delivery+Systems+Amidst+a+Nucleic+Acid+Therapy+Renaissance.">Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance.</a> ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).</li><li>Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Delivery:+From+Lipids+to+Cell-penetrating+Peptides+and+Their+Mimics.">siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics.</a> Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).</li><li>Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+drug+delivery+into+tissue+engineering.">Building drug delivery into tissue engineering.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).</li><li>Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+nanocarriers+for+drug+delivery.">Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery.</a> Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polymers+and+nanomaterials+for+gene+delivery+and+imaging+applications.">Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications.</a> Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).</li><li>Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+copolymer+solution+and+surface+assemblies+for+biomedical+applications.">Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications.</a> Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).</li><li>Weber, W., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biomedical+applications+of+synthetic+biology.">Emerging biomedical applications of synthetic biology.</a> Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Huschka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Gold+Nanoshell-Mediated+Delivery+and+Laser-Triggered+Release+of+Antisense+Oligonucleotide+and+siRNA.">Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA.</a> ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).</li><li>Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-detachable+nanoparticles+based+on+a+light-responsive+amphiphile+for+enhanced+siRNA+delivery.">Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery.</a> R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).</li><li>Braun, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-Activated+Gene+Silencing+via+Gold+Nanoshell-siRNA+Conjugates.">Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates.</a> ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+and+rational+materials+design+for+intracellular+delivery+of+oligonucleotides.">Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides.</a> Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).</li><li>Mao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+chain+length+on+the+physicochemical+and+biological+properties+of+poly(ethylene+imine)-graft-poly(ethylene+glycol)+block+copolymer/SiRNA+polyplexes.">Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes.</a> Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).</li><li>Raab, R. M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+gene+silencing+by+RNA+interference.">Dynamics of gene silencing by RNA interference.</a> Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).</li><li>Cuccato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+RNA+interference+in+mammalian+cells.">Modeling RNA interference in mammalian cells.</a> BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).</li><li>Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synthetic+gene+delivery+vector+design+properties.">Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties.</a> Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).</li><li>Chen, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+Dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET.</a> Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing+from+live-cell+and+live-animal+bioluminescent+imaging.">Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).</li><li>Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Mediated+Activation+of+siRNA+Release+in+Diblock+Copolymer+Assemblies+for+Controlled+Gene+Silencing.">Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing.</a> Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).</li><li>Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Design+of+Polymer+Nanocarriers+to+Spatiotemporally+Control+Gene+Silencing.">Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing.</a> ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+release:+photocleavable+cationic+diblock+copolymers+as+a+potential+platform+for+nucleic+acid+delivery.">Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery.</a> Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Lipid+Raft+Partitioning+of+Fluorescently-tagged+Probes+in+Living+Cells+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+(FCS).">Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS).</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Plasma+Membranes+of+Primary+Lymphocytes+Measured+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J Vis Exp. (120), e54756 (2017).</li><li>Buyens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+disassembly+of+siRNA+polyplexes+in+serum+is+crucial+for+predicting+their+biological+efficacy.">Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy.</a> J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).</li><li>Eden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+Half-Life+Dynamics+in+Living+Human+Cells.">Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells.</a> Science. 331 (6018), 764-768 (2011).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Fluorescence+Monitoring+of+Rapid+Cycle+DNA+Amplification.">Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification.</a> Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).</li><li>Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing-sequence-dependent+nucleic+acid+complexation+and+gene+transfer+efficiency+by+polyethylenimine.">Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine.</a> Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).</li><li>Liu, Y. M., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(glycoamidoamine)s+for+gene+delivery:+Stability+of+polyplexes+and+efficacy+with+cardiomyoblast+cells.">Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells.</a> Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+tuning+of+siRNA+dose+response+by+combining+mixed+polymer+nanocarriers+with+simple+kinetic+modeling.">Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling.</a> Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Metotta özellikle kritik olan birkaç adım vardır. Nanokarbonları formüle ederken, bileşen ekleme ve karıştırma hızı sırası, etkinliği etkileyen iki önemli parametredir 39 . Bu protokol, katyonik bileşen olan mPEG- b- P&#39;nin (APNBMA) anyonik bileşene, siRNA&#39;ya vorteks yaparken damla damla eklenmesini gerektirir. Toplam formülasyon hacmine bağlı olarak, bu karıştırma işlemi 3-6 s sürer. Nanokarbonların düzgün şekilde oluşturulup oluşturulmadığını test etmek için, dinamik ışık saçılması gibi bir teknik kullanarak boyut dağılımını ölçün. -P b mPEG- (APNBMA) 4 N / P oranına sahip / siRNA nano taşıyıcılar ~ 0.2 28 ortalama yaklaşık 140 nm arasında bir çapa ve polidispersiteye sahiptir. Ayrıca, N / P oranı, farklı ebat / kararlılıklardaki polipeksleri elde etmek için değiştirilebilir. Bu çalışmalarda N / P oranı 4 seçilmiştir, çünkü tam bir sekestrasyona imkan veren en düşük oran ve eliEtidyum bromid boyama minisyonu. Yöntemin bir diğer kritik parametresi, siRNA salım deneylerinde nanokarrier solüsyonlarına SDS eklenmesini içerir. Anyonik bir yüzey aktif cismi olan SDS, yüksek konsantrasyonlarda lipid membranlar ve polianyonlar içeren 29 , 40 hücre içi ortamları simüle etmek için kullanılmıştır. S / P oranı, hücrelerde bulunan anyonik lipidlerin çoğunu taklit etmek için yeterince yüksek olmalı, ancak nanocarrierlerin foto-uyaran ve daha ileri analizlerden önce ayrışması o kadar büyük olmamalıdır. Bir seri S / P oranı siRNA&#39;yı serbest bırakmadan eklenebilecek maksimum SDS miktarını belirlemek için jel elektroforezi kullanılarak test edilmelidir. Bu protokol nispeten yüksek bir S / P oranını 15 kullandı. Bu yöntemin potansiyel bir kısıtlaması kinetik modelleme ile ilgilidir. Model, ilgilenilen genin mRNA ve protein yarı ömrünün girilmesini gerektirir. TurnovEtüdü iyi incelenen genlerin oranları literatürde bulunabilir; Ancak, bu bilgi tüm genler için mevcut olmayabilir. Bu sorunu ortadan kaldırmak için benzer genlerin yarılanma ömrü tahminlerde bulunmak için literatürde bulunabilir. Alternatif olarak, ilgilenilen spesifik genin ciro oranlarını deneysel olarak belirleyebilirsiniz 36 . Binlerce gen için bilginin derlenmiş veri setlerinde 41 bulunabileceğini belirtmek de önemlidir. Bu yöntemin bir diğer önemli parametresi de hücre türüdür. NIH / 3T3 fibroblastları bu çalışmalarda bir model hücre dizisi olarak kullanılmıştır, çünkü bunlar geniş bir şekilde incelenmiş, çalışılması kolaydır ve birtakım rejeneratif tıp uygulamalarına uygulanabilir. Bununla birlikte, protokol, ilgi alanındaki diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Nanokarrier formülasyonu spesifik hücre tipi için optimize edilmelidir. Özetle, bu yöntem enSiRNA salınımını spatiotemporal olarak kontrol etmek için radyasyon koşullarının hızla belirlenmesini ve a priori gen susturulmasını öngörür. Bu yöntem, diğer foto-tepki veren nükleik asit iletim sistemlerine kolayca adapte edilebilir. Örneğin, mPEG- b- P (APNBMA) polimerleri, nanocarrierlerin 42 foto-duyarlı davranışını uyarlamak için blok uzunluklarını ve / veya fonksiyonel kısımları ayarlamak suretiyle değiştirilebilir. Bu protokolü kullanmak, nanocarrier istikrarını ve etkililiğini yöneten yapı-fonksiyon ilişkilerini aydınlatmaya yardımcı olacaktır. Bu mekanik bakış açısı, rejeneratif tıpta, gen sessizliği üzerinde spatiotemporal kontrol gerektiren uygulamaları mümkün kılabilir. Dahası, sulu dokularda 365 nm ışık dalgalanma derinliğinden dolayı, bu formülasyonlar cilt kanseri ve topikal yaralar gibi vücut yüzeyinde ortaya çıkan hastalıkların tedavisi için oldukça uygundur.

Az yer kaplayan RNA&#39;lar (siRNA&#39;lar), son derece spesifik, güçlü ve hemen hemen her hedef gen 1 için uyarlanabilir bir katalitik RNAi yolu ile transkripsiyon sonrası gen susturulmasına aracılık eder. Bu umut verici özellikler, siRNA terapötiklerinin insan klinik çalışmalarında metastatik melanom ve hemofili 2 , 3 dahil birçok hastalığın tedavisinde ilerlemesine imkân sağladı. Bununla birlikte, önemli dağıtım sorunları devam etmektedir 4 çeviri engelledi. Özellikle, nakil araçları istikrarlı kalmalı ve siRNA&#39;ları hücre dışı bozulmadan korumalı, aynı zamanda sitoplazmada 5 yükü serbest bırakmalıdır. Dahası, birçok RNAi uygulaması siRNA terapötiklerinin 7 yan etkilerini azaltacak ve dönüştürücü a&#39;yı etkinleştiren, gen silencingini uzayda ve zamanda 6 düzenlemeye yönelik gelişmiş yöntemler gerektirir.İlaç keşfi 8 için hücre mikroarray&#39;lerinden rejeneratif iskelelerde hücre tepkilerinin modülasyonuna kadar uzanan uygulamalardaki gelişmeler 9 . Bu zorluklar siRNA nano taşıyıcılar içinde serbest bırakılması vs bağlayıcı yeni malzemeler ve daha iyi kontrol yöntemlerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. SiRNA salınımını kontrol etmek ve spatiotemporal regülasyonu arttırmak için en umut verici stratejilerden biri uyarana cevap veren materyallerin kullanılmasıdır 10 . Örneğin, değiştirilmiş redoks potansiyeli veya pH, ya da uygulanan manyetik alanlar, ultrason ya da ışık 11&#39;e yanıt olarak değişebilir nükleik asit bağlanma afinitesi ile çok çeşitli biyomalzemeler geliştirilmiştir. Bu sistemlerin birçoğu nükleik asit aktivitesi üzerinde gelişmiş kontrol sağladığına rağmen, ışığın tetikleyici olarak kullanılması, ani geçici tepki, hassas mekansal çözünürlük ve ayarlanabilirlik kolaylığı nedeniyle özellikle avantajlıdır <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 12. Dahası, gen ekspresyonunu düzenleyen foto-duyarlı teknolojilerin potansiyeli, en modern teşvik edici promotör ve optogenetik düzenleyici sistemler tarafından gösterilmiştir; Bununla birlikte, bu sistemler, sınırlı endojen genleri düzenleyen kapasitelerin böyle immünojenisite gibi güvenlik kaygıları ve çok bileşenli tertibatları 13, 14, 15 teslim zorluklar dahil olmak üzere çeşitli zorluklar çeker. Foto-duyarlı siRNA nanokarbonları, bu dezavantajların üstesinden gelmek ve gen ekspresyonunu spesifik olarak modüle etmek için daha basit ve daha sağlam bir yaklaşım sağlamak için idealdir ( 16 , 17 , 18) . Ne yazık ki, ortaya çıkan protein knockdown tepkisini doğru bir şekilde öngörmeye yönelik yöntemler kaçınılmaz kalmaktadır. Kilit bir zorluk, siRNA salımının kantitatif değerlendirilmesidirBu değerlendirmeler yapılmaktadır bile az 19, 20, ve, bu da siRNA / protein devir dinamiklerinin analizlere bağlanmış edilmemiştir. Hem salınan siRNA miktarı hem de kalıcılığı / ömrü, ortaya çıkan gen susturucu dinamiklerinde önemli belirleyicilerdir; Dolayısıyla, böyle bir bilginin eksikliği, RNAi 21&#39;deki doz yanıtının doğru şekilde tahmin edilmesine engel olan önemli bir bağlantı kesitidir. Bu zorluğun çözülmesi, nanocarrier&#39;lerde uygun yapı-fonksiyon ilişkilerinin formülasyonunu hızlandıracak ve biyomateryal tasarımları daha iyi bilgilendirecektir 22 . Dahası, bu gibi yaklaşımlar, daha etkin siRNA dozlama protokollerinin geliştirilmesini mümkün kılabilir. Dinamik susturma tepkisini anlama girişiminde, birkaç grup RNAi 23 , 24 , 25&#39;in matematiksel modellerini araştırdı. Bu çerçeveler;Gen ekspresyonunda siRNA aracılığındaki değişikliklere ilişkin görüş sunma ve hızı sınırlayan aşamaları tanımlama konusunda başarılı olma 26 . Bununla birlikte, bu modeller kontrol siRNA salım yeteneğine sahip değildir ticari gen iletim sistemleri (örneğin, Lipofektamin ve polietilenimin (PEI)) tatbik edilmiştir, ve model karmaşıklık, faydalarını büyük ölçüde 27 sınırlıdır. Bu eksiklikler, hassas ve ayarlanabilir kinetik modellerle birlikte hassas ayarlanabilir siRNA salınımı yapabilen yeni malzemeler için karşılanmamış bir gereksinimi vurguluyor. Metodumuz, serbest siRNA ve model RNAi dinamiklerini nicelleştirmek için ışığa duyarlı bir nanocarrier platformunun birleştirilmiş yöntemlerle bütünleştirilmesiyle bu zorlukların hepsini ele alır. Özellikle, platformumuzun tam olarak kontrol edilen siRNA salınımı 28 , kapsüllenmiş ve karşılanmamış miktarları doğru bir şekilde ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemle izlenirBağlı siRNA. Bu tahlillerden elde edilen deneysel veriler, a priori 29 gen sessizleştirme etkinliklerini tahmin etmek için basit bir kinetik modele girilmektedir. Son olarak, nanocarrierlerin açık / kapalı doğası, hücresel uzunluk ölçeğinde uzamsal kontrolle gen ifadesinde hücre kalıpları oluşturmak için kolayca sömürülmektedir. Bu nedenle, bu yöntem, hücre davranışının zaman-zamanlı düzenlenmesinden fayda sağlayacak çeşitli uygulamalarda gen susturulmasını kontrol etmek ve tahmin etmek için kolayca adapte edilebilir bir yöntem sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">SIC001</td>
			<td style="width:195px;">non-targeted, universal negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">mPEG-b-P(APNBMA)</td>
			<td style="width:157px;">synthesized in our lab</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">photo-responsive polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">HEPES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP310-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">436143</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">rubber gasket</td>
			<td style="width:157px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">3788T21</td>
			<td style="width:195px;">0.5 mL thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">UV laser&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:145px;">Omnicure S2000</td>
			<td style="width:195px;">collimating lens and 365 nm filter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">agarose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP160-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP1302-10</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA labelled with Dy547</td>
			<td style="width:157px;">GE Healthcare Dharmacon, Inc.</td>
			<td style="width:145px;">custom order</td>
			<td style="width:195px;">fluorophore conjugated to 5&#8217; end of sense strand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">microscope slide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:195px;">pre-cleaned glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Secure-Seal Spacer</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">S24735</td>
			<td style="width:195px;">double-sided adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">LSM 780&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ZEN 2010</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">FCS analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">MATLAB</td>
			<td style="width:157px;">MathWorks</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">programming language</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">NIH/3T3 cells&#160;</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:145px;">ATCC CRL-1658</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:195px;">growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:195px;">heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">&#160;30-002-CI</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08-772-1B</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">11058021</td>
			<td style="width:195px;">transfection media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting gene silencing through the spatiotemporal control of sirna release from photo-responsive polymeric nanocarriers

Yeni malzemeler ve yöntemler iyi gen aktivitesi kontrol gerektiren uygulamalarda geniş bir nükleik asitlerin serbest bırakılması genel bağlanma kontrol etmek için ihtiyaç vardır. Özellikle, gen ekspresyonu üzerine geliştirilmiş spyatemporal kontrol ile yeni uyarı-tepki veren malzemeler, ilaç keşfi ve rejeneratif tıp teknolojilerinde çevrilebilir platformların kilidini açacaktır. Dahası, nükleik asit salınımını kontrol eden gelişmiş bir yetenek, materyallerin nano taşıyıcı etkinliğini önceden tahmin etmede aerodinamik yöntemlerin geliştirilmesini sağlayarak, teslimat araçlarının hızlandırılmış taramasına neden olabilir. Burada, gen susturucu etkinliklerini tahmin etmek ve modüler bir foto-tepki veren nanocarrier sistemi vasıtasıyla gen ekspresyonu üzerine spatiotemporal kontrol sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Küçük müdahale edici RNA (siRNA) mPEG- b -poli (5- (3- (amino) propoksi) -2-nitrobenzil metakrilat) (mPEG- b -P (APNBMA)) fo polimerler ile kompleks haline getirilirAyarlanabilir, açma / kapama siRNA&#39;yı serbest bırakmak için ışıkla kontrol edilebilen rm kararlı nanokarbonlar. Floresan korelasyon spektroskopisi ve jel elektroforezini kullanarak, hücre içi ortamları taklit eden solüsyondan alınan siRNA salınımının doğru bir şekilde hesaplanması için iki tamamlayıcı analizin ana hatlarını çiziyoruz. Bu tahlilden elde edilen bilgiler, çeşitli ışık uyarı koşullarına karşı dinamik susturma tepkilerini öngörmek için basit bir RNA girişim (RNAi) kinetik modeline dahil edildi. Buna göre, optimize edilmiş ışınlama koşulları, spesifik olmayan gen sessizliğini kontrol etmek için yeni bir protokolün arıtılmasına izin verdi. Bu yöntem, hücre-hücre çözünürlüğü ve belirlenemeyen hedef dışı etkileri olmayan gen ekspresyonunda hücresel modeller üretebilir. Birlikte ele alındığında, yaklaşımımız gen ifadesinde dinamik değişiklikleri tahmin etmek ve mekanda ve zaman zarfında siRNA etkinliğini tam olarak kontrol etmek için kullanımı kolay bir yöntem sunmaktadır. Bu test seti çok çeşitli otBiyomedikal araştırma ve tıbbında çok sayıda uygulamayla ilgili temel zorlukları gidermek için uyarıcı tepkisel sistemler.

Nanokarbonların formülasyonunu takiben, in vitro transfeksiyonlarda kullanılacak ışınlama koşullarını bildirmek için siRNA salım deneyleri gerçekleştirildi. Serbest bırakılan siRNA yüzdesini belirlemek için çeşitli ışık dozajları uygulandı. Birinci analizde, serbest siRNA moleküllerini polimer ile halen kompleksleşmiş / ilişkili olan siRNA moleküllerinden ayırmak için jel elektroforezi kullanılmıştır. Işık ile işlem görmeyen nanokarbonlar kararlı kaldı ve herhangi bir siRNA salmadı. Işınlama süresi arttıkça, serbest siRNA bantlarının flüoresan yoğunluğu artar. Görüntü analiz yazılımını kullanarak bant yoğunluklarının nicelendirilmesi, 20 dakikalık ışık maruziyetini takiben% 15&#39;in ~% 15&#39;inin serbest kaldığını ortaya koymuştur. İkinci siRNA salım deneyi, solüsyonda serbestçe difüze olan siRNA moleküllerinin yüzdesini ölçmek için FCS&#39;yi kullandıKatkı. Işığa maruz kalmayan nanokarbonları içeren numunelerin baz sayım hızları boş tampon kontrol numunesinin sayım hızlarıyla aynıdır ve bu da serbest siRNA&#39;nın mevcut olmadığını gösterir. Işınlama zamanı arttıkça, başlangıç ​​sayım oranları arttı. Serbest siRNA yüzdesi hesaplandı ve jel elektroforezinden elde edilen ölçümlerle uyumlu olduğu bulundu. Genellikle, iki tekniğin tahminleri birbirlerinin hata içindeydi (Öğrencinin t-testi ile p&gt; 0.05) ve salınan siRNA yüzdesinin 20 dakikadan fazla radyasyonla artmadığını belirtti. Jel elektroforezi ve FCS, kullanımı kolaydır, nispeten hızlı analiz edilmesi ve doğru sonuçlar vermesi nedeniyle siRNA salımını ölçmek için kullanılmıştır. Farklı ışık dozajlarını takiben serbest bırakılan nispi miktarlarda siRNA başlangıçtaki siRN olarak girildiKinetik modelde bir konsantrasyon. Şekil lA&#39;da gösterildiği gibi, her bir ışınlama koşulunda zamanın bir fonksiyonu olarak gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) mRNA, protein ve siRNA konsantrasyonlarını tahmin etmek için model çalıştırıldı. GAPDH protein ekspresyon seviyeleri için model tahminleri, Western blotting yoluyla elde edilen deneysel olarak belirlenen ekspresyon seviyeleri ile uyumluydu ( Şekil 1B ). Özellikle, ifade edilen GAPDH proteininin seviyesi ışınlama süresi arttıkça azaldı. En uzun süre (20 dakika) radyasyona maruz bırakılan hücreler, daha fazla miktarda siRNA salındığı için gen ifadesinde en büyük değişiklikleri sergiledi. Önemlisi, ışığa maruz kalmamış hücreler, nanokarrierlerin uyku halini muhafaza ettiğini ve fotoğraf uyaranından tetiklenmediği sürece herhangi bir siRNA salmadığını belirten hiçbir gen knockdown göstermedi. Sitotoksisite deneyleri, NIH / 3T3 hücrelerininnano taşıyıcılar ile muamele ve irradyasyon 28 20 dakika, aşağıdaki ≥% 90 canlılığını sürdürmüştür. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55803/55803fig1.jpg" /> Şekil 1 : Kinetik Modelleme Tahminleri ve Protein Ekspresyonunda Deneysel Olarak Belirlenen Değişiklikler. ( A ) jel elektroforezinden elde edilen siRNA salınım verileri, kinetik modelde başlangıçtaki siRNA konsantrasyonunu modüle etmek için kullanılmıştır. Bu grafikler, 20 dakikalık ışınlama alan hücrelerin model çıktısını temsil etmektedir. ( B ) Her bir ışınlama koşulundan elde edilen siRNA nispi miktarları, protein ekspresyonundaki değişiklikleri tahmin etmek için kinetik modele girildi. Bu tahminler Western blot analizlerinden elde edilen GAPDH protein ekspresyon seviyeleri ile karşılaştırılmıştır. Sonuçlar, d nin ortalama ± standart sapmasıAta üç bağımsız örnekten elde edilmiştir. Deneysel veriler kısmen 29 nolu referans ile yeniden basılmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55803/55803fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Gen sessizleşmesini zamansal olarak kontrol etmek için spesifik hücresel popülasyonları foto-uyarana sınırlandırmak için bir fotomask kullanıldı. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, hücrelerdeki GFP ekspresyonu yuvarlak bir desende mekansal olarak kontrol edildi. Işıktan korunan hücreler, siRNA ve ışık ile muamele edilmemiş kontrol numunelerinden ayırt edilemeyen floresan yoğunlukları sergilemiştir. Bununla birlikte, dairesel patern içindeki neredeyse tüm hücreler, etkin siRNA salınımını ve gen knockdown&#39;u belirten hiçbir GFP ekspresyonu sergilemedi. Dahası, ışığın tetikleyici olarak kullanılması, gen ifadesinin kontrol olmasını sağladıHücresel uzunluk ölçeklerine yol açtı. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55803/55803fig2.jpg" /> Şekil 2 : Gen Silensizliği Üzerinde Mekansal Kontrol. NIH / 3T3 hücreleri, GFP pDNA içeren lipopleksler ve GFP hedefleme siRNA / mPEG- b- P (APNBMA) nanokarbonları ile birlikte transfekte edildi. Yuvarlak bir fotomask, 20 dakika boyunca 365 nm ışıkla ışınlamadan önce uygulanmıştır. Hücreler, transfeksiyondan 48 saat sonra bir floresan mikroskopta görüntülendi. Kesikli kırmızı çizgi, fotomarkın kenarını temsil eder ve ölçek çubuğu 1 mm&#39;yi temsil eder. Referans izniyle uyarlanmıştır 29 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55803/55803fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers at JoVE.com

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Saptanabilir hedef dışı etkiler olmaksızın gen susturulmasının daha verimli dağılma zamanı kontrolü için foto-tepki blok kopolimerleri kullanan yeni bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler basit siRNA salım deneyleri ve basit kinetik modelleme kullanılarak tahmin edilebilir.

Fotoğrafa Duyarlı Polimerik Nanokarbonlardan SiRNA Salınımının Spatiotemporal Kontrolü ile Gen Silenceresinin Öngörülmesi

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

predicting-gene-silencing-through-spatiotemporal-control-sirna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Görüntüleme.  University of Delaware.  Saptanabilir hedef dışı etkiler olmaksızın gen susturulmasının daha verimli dağılma zamanı kontrolü için foto-tepki blok kopolimerleri kullanan yeni bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler basit siRNA salım deneyleri ve basit kinetik modelleme kullanılarak tahmin edilebilir. 

Video: Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

Nanoprecipitation Tekniği Diblock Polimerik Nanopartiküller formülasyonu

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Biyomühendislik

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorik Sentezi ve Polimer Film ve Nanoparçacık Kütüphaneler gelen Yüksek throughput Protein Yayın

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Kullanımı<em&gt; Ex vivo</em&gt; Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Biyomedikal Uygulamalar için Süperhidrofobik Polimer Malzemeler imalatı

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Darbe Lazer Tahrik olma üzerine Altın Nanopartikül Entegre Fotoğraf duyarlı lipozomlar ve Bunların Mikro-kabarcık Kavitasyon Ölçülmesi Sentezi

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Katyonik ve Anyonik lipozomlar kullanılarak merkezi sinir sistemine Terapötik siRNA teslimi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...