The authors thank M. Gordon of the Queen's University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).

<ol>
	<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays.">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li><li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'chemoinvasion'+assay,+25+years+and+still+going+strong:+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis.">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture.">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li><li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering.">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4 (2007).</li><li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. 1078, 119-132 (2013).</li><li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension.">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells:+How+to+go+three-dimensional.">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz ucuz ve yaygın olarak kullanılan reaktifler kullanılarak in vivo dokuların mimarisi model 3D hücre parçacıklarının üretilmesi için hızlı ve esnek bir yöntem mevcut. Bizim protokol MC 8, 9 sitotoksik olmayan yapışkanlık arttırıcı özellikleri hücre toplama aracılık etmek ve hücre tekli-tabakası oluşumunu en aza indirmek için patlatır. hayvansal kaynaklardan izole edilmiş protein bazlı matrisler farklı olarak, MC, inert olan herhangi bir büyüme faktörlerini içerir ve kolay bir kalıntı matris olmadan da çeşitli uygulamalarda kullanılmak için parçacıklarının izolasyonuna izin yıkanarak uzaklaştırılır. Bizim protokol çeşitli deneysel koşullar altında yetiştirilen sferoitlerin doğrudan karşılaştırmalar izin homojen büyüklükte sferoidler oluşturmak için tutarlı hücre sayıları hızla toplanmasını kullanır. Bu yöntem, (çoklu tümör-ilişkili hücre tiplerinin sabit sayıda birleştirerek in vivo tümör büyümesinde model Karışık kültürler için uyarlanabilirörneğin fibroblastlar, lökositler, stromal hücreler) daha doğru tümör ortamını temsil etmek. MC yüksek konsantrasyonlarda tohumlandı protokol kullanılarak hücrelerin değişiklikler süspansiyonuna prolifere mümkün hücrelerinin ankrajdan bağımsız büyüme izlemek için yapılabilir ve tespit veya hücre dönüşümü ölçmek için bir anoikis tahlilinde (Bölüm 6) olarak kullanılabilir. Bizim protokol tarafından oluşturulan sferoidler tedavi koşulları arasındaki hücre büyüme, metabolizma, hayatta kalma ve invaziv karşılaştırılması sağlayan bu tür ilaç taraması gibi uygulamalar için idealdir. İzole sferoidler değerlendirmek ve 3D-mikro (Bölüm 2.2, Şekil 4) hücre istilası ölçmek için, kolajen gibi, hücre dışı bir matris içine gömülü olabilir in vivo tümör büyümesi daha doğru modelleri. Bundan başka, protokol u sağlayan bir protein veya bir RNA hazırlanmasına yönelik MC matris parçacıklarının büyük miktarlarda izole etmek için de kullanılabilirsers tedavi veya büyüme koşulları karşısında hücre sinyal veya gen ifadesi değişikliklerini tespit etmektir. Bizim küremsi oluşumu protokolü serum ve MC konsantrasyonları, her bir hücre hattı için tohumlanmıştır hücre sayısının optimizasyon gerektirir. Bu hücre canlılığı, hücre-hücre ve hücre-plastik yapışkanlık gibi hücre hattı özgü özellikleri, belirgin sferoidler meydana getirilmesindeki kolaylığı etkileyebilir. Genel olarak, tek tabaka kültüründe zayıf canlılığı ile hücre hatları daha yüksek MC konsantrasyonları yüksek yapışkan hücre hatları için tercih ederken, sfero oluşumunu teşvik etmek için daha yüksek serum konsantrasyonları gerekli. Bu nedenle tek tabaka ve uydu sfero oluşumunu (MC konsantrasyon) en aza indirirken serum ve MC titrasyonlar, hücre sağkalım (serum konsantrasyonu) için en uygun koşulları belirlemek için yapılması önerilir. Bu koşullar, uydular olmayan oyuk başına tek bir ayrı sfero üretimi ile sonuçlanmalıdır. Optimal sfero boyutuAnaliz uygulamaya bağlıdır ve tohumlandı hücreleri ve serum konsantrasyonu (Aşama 1.4.7) sayısına göre etkilenir. Daha az hücrelerin ekim daha kolay homojen boyanmış küçük agrega üreten, ancak in vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevresinin etkileşimleri yeniden olmayabilir. Tohumlanmış hücrelerin sayısını arttırmak hücre davranışını etkileyen büyüme veya hayatta kalma tahlilleri yorumunu değiştirebilir fizyolojik Örnek hipoksik çekirdek 10 içerebilir büyük parçacıklarının oluşturur. Ancak, ne zaman çok büyük, sferoidler kırılgan olabilir ve kolayca birbirinden kopuk veya izolasyon sırasında hasar görmüş. Büyük sferoidler da optik kesit için özel görüntüleme platformları (örneğin ışık levha floresan mikroskop olmadan) veya gömme veya sfero 11&#39;e kadar cryosectioning ve kesitlerin boyanması ile görselleştirmek için çok daha zordur. Biz esneklik 200-500 mikron bir hedef sfero boyutu tavsiye veBir çok uygulama için taşıma kolaylığı. Genel olarak, her iki hücre hattı spesifik ve uygulamaya özgü şekilde küremsi oluşturulması için koşulları optimize etmek için kritiktir. Sfero üretim protokolleri toz ve diğer partiküllerin tarafından sferoidler kirlenmesini önlemek için özellikle dikkat gerektirir. Hücreler düzensiz şekilli sonuçlanan, toz ve diğer çözünmeyen kirleticiler uygun, gevşek yapışık hücre analizlerde kullanılmak (Şekil 3A) için uygun bir araya getirir. kontaminasyon kaynakları kullanılmadan hemen önce filtrelenmiş, aşırı saf su ile çok kanallı pipet rezervuarı (Aşama 1.4.1) ayrışma önce filtre ortamı ile hücre mono tabakasının durulama, 0.45 um&#39;lik bir filtreden tüm çözümler geçen ve durulama ile en aza indirgenebilir (Aşama 1.4.6.1). Dahası, çözümler lifleri tutabilir pamuk filtreli serolojik pipetler, kaçınılmalıdır. kritik değildir, ancak, toz daha dissociat geçen azaltılabilirtohumlama (Adım 1.4.6) öncesinde 100 mikron hücre süzgecinden ed hücreleri. Ortamın Buharlaşma kaybı, özellikle, sferoid oluşumu (Tablo 1) ya da anoikis deneyleri (Bölüm 6) içinde belirli bir hücre çizgileri gerektirdiği gibi 1 hafta aşan inkübasyon süreleri için, ek bir teknik bir husustur. Buharlaştırma, çok oyuklu plakalar orta bölgesinde hücreleri kuyularda tohumlama, aşırı saf su ile kuyu çevre doldurulması ve gevşek plakanın kenarlarına sızdırmaz ya da nemli bir bölmede plaka içine en aza indirilebilir. 3D cep sferoidler normal ve tümör hücre davranış ve fizyolojisi çalışma için değerli modeller. Protokol deney ve uygulama yelpazesine de kullanılabilir tutarlı boyutlu 3D cep parçacıklarının oluşturulması için hızlı ve ekonomik bir yöntemdir. Bu sferoidler pr değerli tümör büyümesi ve mikroçevresinin etkileşimleri karakterizasyonu için araçlar yanı sıra modelleri temsilyeni tedavilerin eclinical değerlendirilmesi.

Tümör hücre davranışı biyolojik ilgili değerlendirme bu yeterli in vivo bulundu hücre mikro yansıtmaz, çünkü kısmen, geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültür yöntemleri kullanılarak meydan okuyor. Kültür (ör Boyden Chamber tahlilleri) halinde hücre dışı matris bileşenleri içeren alternatif yaklaşımlar, in vivo doku ortamının daha fazla fizyolojik olarak temsilidir. Bununla birlikte, tek tek hücre davranışının değerlendirilmesi ile sınırlı olabilir ve doku ya da tümör büyümesi 1, 2, 3 katkıda hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri in vivo kombinasyonlarında karmaşık özetlemek yoktur. Çok hücreli sferoidler kullanımı, daha doğru in vivo hücre büyümesi 1 kompakt mimarisini yeniden üreten bir son yaklaşımdır4. Sferoidler normal hücrelerin hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir, aynı zamanda bu tür metastatik büyüme ya da ilaç direnci 4 tümör progresyonu özelliklerini modeli tümör analogları olarak hareket edebilir. Sferoidler bir matris 5 veya daha hızlı bir şekilde yerleştirilmiş tek hücre çoğalması ile oluşturulabilir, birden fazla hücre toplanmasını teşvik ederek, tek bir hücre kümesi (örneğin, asılı damla, santrifüj yöntemleri) 6, 7 oluşturulur. Mevcut hücre toplama teknikleri pahalı malzeme veya özel ekipman gerekebilir. Buna ek olarak, bu sferoidler boyutları ve morfolojileri geniş bir yelpazede ve büyüme koşulları ya da zor tedaviler arasındaki karşılaştırmalar, büyük miktarlarda üretilmesi için zor olabilir. Son olarak, bu yöntem tarafından üretilen sferoidler proteinli ekstrasellüler izole etmek zor olabilirlular matrisi içinde diğer uygulamalarda kullanılmak üzere yerleştirilmiştir. Burada, ticari olarak temin edilebilen U tabanlı hücre itici plakalar ve bir atıl yapışkanlık arttırıcı matrisi, metil selüloz ile tutarlı bir şekilde boyutlandırılmış, hücre parçacıklarının hızlı oluşumu için sağlam ve kolayca değiştirilebilir hücresi agregasyonu yöntemler tarifedilmiştir. Oluştuktan sonra, bu çok hücreli küreler kolaylıkla geniş bir uygulama aralığında kullanım için izole edilir. Protokol de kolayca diğer hücre süreçleri değerlendirmek için kullanılabilir hücre çoğalması ile parçacıklarının üretilmesi için uyarlanmıştır. Burada, bu iki farklı küremsi oluşumu protokoller, örneğin uygulamaları immünofloresan boyama ile miktarı, hücre istilası deneyleri, bir anoikis deneyi göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21114</td>
			<td>Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Spheroid Formation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well U-bottom Cell-Repellent Plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12K Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2112722</td>
			<td>For culturing TT cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td>Filter prior to use to remove particulate contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7027</td>
			<td>Prepare in water to 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605028</td>
			<td>Dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Invasion Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Type I Collagen</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>354231</td>
			<td>Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Phenol Red Free Low Glucose&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11054-20</td>
			<td>Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Immunofluorescence Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1.5 Coverglass</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72225-01</td>
			<td>For mounting excised spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Used to stain actin at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>ALB001</td>
			<td>Used in BSA blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dabco 33-LV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>290734</td>
			<td>Antifade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>GLY001</td>
			<td>Used in MOWIOL mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>Freeware, NIH</td>
			<td>-</td>
			<td>Used for image analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-024</td>
			<td>For mounting excised spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOWIOL 4-88</td>
			<td>EMD-Millipore</td>
			<td>475904</td>
			<td>Used in MOWIOL mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMD-Millipore</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td>Used in fixation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bioshop Canada Incorporated</td>
			<td>TRX777</td>
			<td>Used in permeabilization buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and flexible cell aggregation method for 3d spheroid production

Tek tabakalı hücre kültürü yeterli kompleks hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini içeren dokuların in vivo davranış, modelde mevcut değildir. Üç boyutlu (3D) hücre kültür teknikleri yapışık hücre kültürü eksikliklerin giderilmesi için geliştirilen yeni bir yeniliktir. In vitro doku analogları üretmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir birlikte, bu yöntemler, kurma pahalı sıklıkla karmaşık özel teçhizat gerektirebilir ve genellikle sadece belirli hücre tipleri ile uyumluluğu ile sınırlıdır. Burada, tümör ve normal hücre çizgileri, çeşitli büyüme ile uyumlu uygun boyutta çok-3D parçacıklarının içine hücreleri toplanmasını sağlayan bir hızlı ve esnek bir protokol açıklar. Bu ankrajdan bağımsız sferoid nesil teşvik etmek ve yüksek ölçüde tekrarlanabilir biçimde, hücre mono tabakaları oluşumunu önlemek için, serum ve metil selüloz (MC) arasında değişen konsantrasyonlarda kullanmaktadır. Bireysel için en uygun koşullarınidual hücre çizgileri küremsi oluşturulması ortamda MC veya serum konsantrasyonlarını ayarlanması ile elde edilebilir. üretilen 3 boyutlu sferoidler hücre sinyal veya gen ekspresyon çalışmaları, bir aday ilaç tarama, veya tümör hücre istilası ve göç gibi hücresel süreçleri çalışma da dahil olmak üzere geniş bir uygulama aralığında, kullanım için toplanabilir. Protokol de kolayca tek hücre klonal sferoidler üretmek üzere uyarlanmış olan ve ankrajdan bağımsız büyüme ve anoikis direncini değerlendirmek için adapte edilebilir. Genel olarak, iletişim kuralı üreten normal ve tümör hücrelerinin in vivo büyüme dokuların 3D mikro-özetlemek ve model-leştirilmesi için 3D hücresi parçacıklarının kullanılması için kolaylıkla değiştirilebilir bir yöntem sağlar.

Bu hücre itici plakaları ve MC ile takviye sferoid formasyonu ortamını kullanarak ayn sferoidler oluşturmak için esnek ve etkili bir yöntem tarif eder. MC ve serum uygun koşullar altında, tek tek hücreler yerleşmek ve de alt az vermeden parçacıklarının oluşturulması için iyi merkezine bir araya yapışır. Bu protokol kullanılarak, küremsi hücre çizgileri, çeşitli (Şekil 2B) elde edilmiştir. MC ve serum titrasyonu tek bir küremsi parçalamadan manipülasyon sağlamak için yeterince sağlam, meydana gelen en uygun koşulları belirlemek için her bir hücre hattı için gereklidir. En uygun olarak, sferoidler çapı 200 ile 500 um arasında ve en az hücre artıkları ile sıkıca yapışan hücreler oluşmuştur. Küremsi bunları toplanmış ve testler, çok çeşitli kullanılmak üzere izin zarar vermeden hassas taşıma hayatta kaldı. (Şekil 3A), sayesinde bertaraf edilebilir. ele alındığında toz veya diğer elyaf kirlenme, çoklu veya sadece zayıf toplu oluşmuş düzensiz şekilli hücre kümeleri, ve ortaya çıkan küremsi varlığında kolayca parçalandı. Sfero oluşumu sfero oluşumu ortamı (Şekil 3B) suboptimal MC konsantrasyonları veya serum etkilenmiştir. Testlerde, çok sayıda hücre çizgileri MC, yokluğunda, veya düşük konsantrasyonlarda hücre itici plakalara yapışmaya mümkün ve hücre tek (Şekil 3B-II) ile çevrelenmiş bir küremsi oluşumu ile sonuçlanmıştır. optimal MC koşullarında BxPc-3 hücre büyümesini bir örnek olarak gösterilmektedir. Genel olarak, MC daha yüksek konsantrasyonlarda oyuk yapışan hücreler engelledi ancak MC çok yüksek bir konsantrasyonu, hücre-hücre yapışması ve önlenebilir hücreleri azaltılmışGevşek agrega ve çok sayıda uydu parçacıklarının (Şekil 3B-i) &#39;nin oluşumu ile sonuçlanır, kuyunun dibine çökelme. serum konsantrasyonu, hücre hayatta kalma ve hücre-hücre ve hücre-plastik yapışmasını etkilemiştir ve farklı hücre hatları için optimize edilmiş olması gerekiyordu. Bu HCT-116 ve Panc-1 gibi hücre hatları için, çok yüksek bir serum konsantrasyonu, aşırı hücre çoğalması ve kolay bir şekilde işleme zarar veya iyi plastik hücre yapışmasını teşvik edildi boy parçacıklarının üretim ve bir tek tabaka oluşumu (sonuçlandı Şekil 3B-iii). İlginç bir şekilde, yeterli serum etkileri hücre hatları arasında farklı. HCT-116 hücre hayatta kalması indirgenir ve oluşturulur sferoidler, düşük serum ölü hücrelerin büyük bir oranını ihtiva eden, küçük edildi. Bunun aksine, Panc-1 hücreleri, serum olmadan uygulanabilir, ancak daha yapışkan hale geldi ve birden çok agrega gibi bir hücre tekli tabakası oluşturan (Şekil 3B-IV, V). <pFO class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within-PAGE = &quot;1&quot;&gt; istilası deneylerinde, önceden oluşturulmuş sferoidler bir bükülmez hücre dışı matrisi (Bölüm 2.2, Şekil 4) oluşturmak için nötralize kollajen yeniden süspanse edilmiştir. Bir kemoatraktanttır kaynaklı tek tek hücrelerin sonradan ilave sfero dışarı doğru hareket eder ve çevre matris (Şekil 4B) içine işgal etmek. İstilacı hücreler ve mesafe işgal sayısı örneğin DAPI ya kalsein AM olarak canlı hücre leke mevcudiyetinde aydınlık mikroskobu aracılığıyla ölçülebilir ya da floresan mikroskobu ile gerçekleştirilebilir (Bölüm 3, 4). testlerde, bu uzantıların oluşumu gibi morfolojik değişiklikler, kemoatraktan ile muamele için 6 saat içinde görünür ve çok sayıda hücreleri tam sfero ayrılıp 18 ila 48 saat içinde kollajen içine işgal gözlenebilir. Deneyler için, daha uzun inkübasyon süreleri, hücreler çok hareket ile sonuçlanmıştır istilası 12 ila 18 saat, ideal olduğunu buldukOptimum görüntüleme için sfero. Sabit kollajen gömülü sferoidler hücreleri (Şekil 5B, 5C) tarafından oluşturulan invaziv yapıların görselleştirilmesi için mesafeyi ve işgalci hücrelerin sayısını veya immünofloresan mikroskopi (Bölüm 3-5), ölçmek için, aydınlık tarafından görüntülendi olabilir. tek tek hücreler daha yüksek bir konsantrasyon MC içerisinde süspanse edilir (30 mg / ml) anoikis direnci izlemek için kullanılabilecek tarif sferoid formasyonu protokolünün bir modifikasyonu. Bu MC konsantrasyonlarda, ortam hala 37 ° C &#39;de katı jele soğuk ise pipetle aktarılır, fakat esas itibarıyla kalınlaştırılmış olabilir. Bu ortam içine yeniden süspansiyon haline Anoikis-dirençli hücreler süspansiyon kaldı ve farklı boyutlarda (Şekil 6B) süspansiyon haline sferoidler oluşturan 2-4 haftalık bir süre boyunca çoğaldı. Ankraja bağımlı hücreler bu koşullar altında parçacıklarının oluşturmazlar. Biz uyuşmuş sayarak anoikis direncini ölçmek için başardıksferoidlerin er her bir meydana. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig1.jpg" /> Şekil 1: 3D Sfero Oluşumu Protokol bakış. tek tabakalı kültür içinde büyüyen hücrelerin, ayrışmış sayılır, topak ve metil selüloz (MC) ve serum (I-IV) ile desteklenmiş küremsi formasyonu ortamı içinde yeniden süspanse edilir. süspansiyon, arzulanan boyutta (V) parçacıklarının oluşumuna izin vermek için istenilen yoğunlukta bir U tabanlı hücre itici plaka içine ekilir ve plaka her bir (VI) olarak, tek ve hücre sfero üretilmesi için inkübe edilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55544/55544fig2.jpg" /> Şekil 2: Optimize Sfero Oluşumu Koşulları.(A), SH-SY5Y hücreleri için en iyi şartlar altında küre formasyonu. % 5 serumu ve 1 mg ile takviye edilmiş ortam içinde U-alt hücre itici plakalara ekilmiş 1.000 hücre / ml MC 24 saat içinde küçük parçacıklarının halinde toplanır. (B) Tablo 1&#39;de gösterilmiştir optimal koşullar altında çeşitli hücre hatları oluşturduğu sferoidler Temsilcisi görüntüler <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55544/55544fig3.jpg" /> Şekil 3: Suboptimal Koşullarında Sferoid oluşumu. (A), sferoidler kirletici varlığında oluşturulur. Mikrobiyal kontaminasyon hücre ölümü ve gevşek toplanmış küresellerde sonuçlandı. toz veya fiberler, bu malzemelerin yapışmış hücreler gibi çözünmeyen yabancı maddelerden, varlığında ve aggreg yoktuyemek yedi. Bırakıyorsa sfero oluşumu ortamında (B) Sferoid oluşumu. II (fazla MC mevcudiyetinde tohumlandı BxPc-3 hücreleri (10 mg / ml), bir çok uydu sferoidler (I) &#39;in oluşturduğu yetersiz MC ise (0 mg / mL) de taban yapıştırılır ve bir tek tabaka oluşturulmuştur hücre agrega ile sonuçlanmıştır ). Benzer sonuçlar, diğer test edilen hücre hatları için gözlenmiştir (gösterilmemiştir). Aşırı serumu (% 20) artmıştır HCT-116 hücre çoğalması ve tek tabaka formasyonu (III) ile sonuçlanmıştır. Yetersiz serumu (% 0) hücre ölümünden HCT-116 arasında değişen hücre çizgisi özgü etkiye sahip (IV) &#39;PANC-1 uydu sferoidler oluşumuna (h). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55544/55544fig4.jpg" /> Şekil 4: küremsilerin kullanılması Yayılması deneyindeki. (A), Ovküremsi işgal tahlil erview. Görüntüleme kabı nötralize kollajen tabakası ile önceden kaplandı ve kollajen (I-II) polimerize etmek için inkübe edilir. Önceden oluşturulmuş sferoidler 1.5 ml tüpler içinde toplanmış ve nötralize kolajen (III-VI) içinde tekrar süspanse edilir. sfero-kollajen karışımı kolajen taban katmanı üzerine kaplanmış ve kolajen (vii-viii) polimerize inkübe edilir. istenen bileşikleri içeren büyüme ortamı daha sonra polimerize küremsi-kollajen tabaka üzerine kaplanmış ve hücre istilasını (IX-X) izin vermek için inkübe edilir. Bir kimyasal çekici varlığında (B) hücreler, belirtilen zaman noktalarında gömülü Panc-1 sfero çevreleyen kollajen matrisi içine işgal gösterilmiştir. Her panel 10X objektif kullanılarak elde edilen bir faz kontrast görüntü gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55544/55544fig5.jpg" /> Şekil 5: Kolajen gömülü sferoitlerin İmmünofloresan Boyama. Sferoidlerin immünofloresan boyama için protokol (A) genel bakış. Gömülü sferoidler doğrudan görüntüleme kabında, yıkanmış (NBF) sabit ve (BSA) engellenir. Küremsi doğrudan lekeli veya kesilmiş ve bir 1.5 mL tüp gibi, daha küçük bir hacimde boyanmış olabilir. Sferoidler arka floresan en aza indirmek için her bir leke Aşağıdaki fazla tampon ile yıkanmalıdır. Lekeli sferoidler kap içinde, doğrudan görüntü verilen ya da görüntü ve depolama için lamel altına monte edilebilir. Bir TPC-1 hücre sfero kollajen gömülü ve 24 saat boyunca işgal bırakıldı (B) İmmünofloresan ve görüntüler. Hücreleri sfero b içinde: faloidin lekeli hücreleri gösteren (C) Görüntüler B. belirtilen bölgelerin tipik Her panel 20 mikron Z-projeksiyon (0.2 mikron adım) 60X objektif kullanılarak elde edilen gösterirODY yaklaşık 20 um yüzeyinden (1), kolajen (2) çıkıntı yapan hücreleri ve kollajen ile hücreleri istila (3). Ölçek çubukları 25 mikron =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55544/55544fig6.jpg" /> Şekil 6: küre formasyonu Anoikis Deneyi. Anoikis test protokolüne (A) genel bakış. Hücreler, Şekil 1 &#39;de tarif edildiği gibi hazırlanır, ancak hücre toplama (I-II) süspansiyonuna tek tek hücrelerin tutun ve önlenmesi için kalın bir tabaka oluşturur 30 mg / ml MC en az içeren sferoid formasyonu ortamı içinde yeniden süspanse edilir. Hücre süspansiyonu U tabanlı hücre itici plakalara ekilmiş ve (III-IV) inkübe edilir. süspansiyon hücreleri anoikis direnç gösteren çoğalması küremsi oluşumu için izlenir. ( <stRong&gt; B) anoikis tahlil sırasında koloni oluşumu Örnek ve görüntüler. TPC-1 hücreleri, 30 mg / ml MC ile süspansiyon içinde tutulan ve belirtilen zaman noktalarında görüntülenmiştir. anoikis dayanabilmektedir olan hücreler küreler oluşturma çoğalır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55544/55544fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Hücre çizgisi </td><td> MC (mg / mL) </td><td> Serum (%) </td><td> yaklaşık inkübasyon zaman </td></tr><tr><td> SH-SY5Y </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> BxPc-3 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3-5 gün </td></tr><tr><td> PANC-1 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5-7 gün </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> 3</td><td> 10 </td><td> 2-4 gün </td></tr><tr><td> TT </td><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 7-10 gün </td></tr><tr><td> TPC-1 </td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 1-2 gün </td></tr></tbody></table> Onaylanmış Hücre Hatları için en uygun Sferoid Formasyonu Orta Kompozisyon ve Kuluçka Times: Tablo 1.

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production at JoVE.com

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Görüntüleme.  Queen's University Cancer Research Institute. Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions. 

Video: An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biyoloji

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

3D Sferoid Modelinde Zaman Çözülen Floresan Görüntüleme ve Kanser Hücre İstilasının Analizi

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in turn requires accurate determination of disease phenotypes of plants upon infection with a particular fungal pathogen. However, accurate disease phenotyping with unculturable biotrophic fungal pathogens such as powdery mildew is not easy to achieve and can be a rate-limiting step of a research project. Here, we have developed a safe, efficient, and easy-to-operate disease phenotyping system using the Arabidopsis-powdery mildew interaction as an example. This system mainly consists of three components: (i) a wooden inoculation box fitted with a removable lid mounted with a stainless steel or nylon mesh of ~50 &#181;m pores for inoculating a flat of plants with fungal spores, (ii) a transparent plastic chamber with a small front opening for minimizing spore escape while conducting inoculation inside, and (iii) a spore-dislodging and distribution method for even and effective inoculation. The protocols described here include the steps and parameters for making the inoculation box and the plastic chamber at a low cost, and a video demonstration of how to use the system to enable even inoculation with powdery mildew spores, thereby improving accuracy and reproducibility of disease phenotyping.

We present a protocol for constructing a simple spore-distribution system consisting of an inoculation box with a ~50 &#181;m mesh and a transparent plastic chamber. This can be used to evenly inoculate plants with powdery mildew spores, thereby enabling accurate and reproducible assessment of disease phenotypes of plants under study.

Arabidopsis ve diğer bitkilerin külleme enfeksiyonu fenotiplerini doğru bir şekilde değerlendirmek için kolay ve esnek bir aşılama yöntemi

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), and so on. To detect and analyze soluble or diffuse protein oligomers or aggregates, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which can detect the diffusion speed and brightness of a single particle with a single molecule sensitivity, has been used. However, the proper procedure and know-how for protein aggregation detection have not been widely shared. Here, we show a standard procedure of FCS measurement for diffusion properties of aggregation-prone proteins in cell lysate and live cells: ALS-associated 25 kDa carboxyl-terminal fragment of TAR DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) and superoxide dismutase 1 (SOD1). The representative results show that a part of aggregates of green fluorescent protein (GFP)-tagged TDP25 was slightly included in the soluble fraction of murine neuroblastoma Neuro2a cell lysate. Moreover, GFP-tagged SOD1 carrying ALS-associated mutation shows a slower diffusion in live cells. Accordingly, we here introduce the procedure to detect the protein aggregation via its diffusion property using FCS.

We here introduce a procedure to measure protein oligomers and aggregation in cell lysate and live cells using fluorescence correlation spectroscopy.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...