This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universit&#228;tsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical &amp; Scientific Relations, Alzheimer's Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensf&#246;rbundet; and Emil and Wera Cornell's, Aina Wallstr&#246;m and Mary-Ann Sj&#246;blom's, Gun and Bertil Stohne's, Magnus Bergvall's, and Gamla Tj&#228;narinnor's Foundations.

NOT: Bu protokol, başlangıç ​​malzemesi olarak, her Aβ peptidi için 50 ug / ml bir konsantrasyonda en az 50 uL hacimde, gerektirir. Aβ peptidler, deiyonize su içinde% 20 asetonitril (ACN) ve% 4, konsantre amonyak çözeltisi (hac / hac) içinde çözülmüş ve 80 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir. Dikkat: güvenlik bilgisi için Tablo 1&#39;e bakınız. Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> ACN 20 ml deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 4 mL (~% 25) seyreltilmesi ile% 20 ACN ve% 4, 100 ml deiyonize edilmiş su (hacim / hacim) konsantre amonyak çözeltisi hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 100 mL nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun. </li><li> 50 mL&#39;lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde guanidin-hidroklorür 26.08 g çözülmesiyle 5 M guanidin-hidroklorid 50 mL hazırlayın. 20 ° C&#39;de saklayın ve taze Aylık&#39;ı yapmak. </li><li> (Deiyonize su içinde% 4 fosforik asit 200 mL Hazırlama V /h) deiyonize su içinde konsantre edilmiş fosforik asit (~% 85) 9.4 ml seyreltilmesiyle. iyonu giderilmiş su ile 200 mL nihai hacim ayarlayın. Buzdolabında saklayın ve taze haftalık yapmak. </li><li> ACN, 37.5 mL deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 5 mL (~% 25) seyreltilmesi ile deiyonize su içinde 50% 75 ACN mL ve% 10 konsantre edilmiş amonyak çözeltisi (hac / hac) hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 50 ml nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun. </li><li> Rutin klinik analizden de tanımlanan artık örneklerden elde edilen kalibratör, insan CSF en az 2.5 mL çözülme. </li><li> 150 mM Na, 3.0 mM K, 1.4 mM Ca, 0.8 mM Mg, 1.0 mM p ve deiyonize su içinde 155 mM CI ihtiva eden suni CSF hazırlamak ve 4 mg / mL&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar sığır serum albümini ekleyin. Sadece 1 ml gelecekte kullanılmak üzere kısım bunu, ve mağaza, analiz başına gerekli, ama büyük hacimli hazırlamak olduğunu. </li></ol> Kalibratörlerimizden 2. Hazırlık <ol><li> 4 ug 0.5 mL hazırlayın / ml 10.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / 15 mL NAβ 142 50 ug 40 uL eklenmesiyle 5 NAβ 1-42 peptid. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.95 mL 4 ug / ml 15 NAβ 142 50 uL eklenmesiyle, 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptid 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> Tablo 2&#39;de belirtilen her bir çözelti miktarı karıştırılarak altı kalibratör solüsyonları (AF) hazırlayın. 0.5, 1.5, ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> karşılık gelen kalibrasyon çözümleri ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda Tablo 3. Karışımı uygun olarak insan CSF eklenerek 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (çift olarak) son kalibratörleri hazırlayın. </li></ol> Dahili standardın 3. hazırlanması <ol><li> 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.968 mL / 13 mL CAβ 142 50 ug 32 uL eklenmesiyle / ml 13 CAβ 1-42 peptid 0.8 ug 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 4.9 ml 0.8 ug / ml 0.1 ml ilave edilerek 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptid 5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li></ol> Yanıt Faktörü Numunenin 4. hazırlanması Not: yanıt faktörü (RF) belirlenmesi kalibrasyon (15 NAβ 1-42) için kullanılan işaretli peptidin konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu yerli Aβ 1-42 peptid konsantrasyonu amino asit analizi (AAA) ile tespit edilmiştir gerektirir. Bu durumda, ses ve yerli Aβ 1-42 peptid alikotları konsantrasyonuAAA gereklerini yerine getirmek gerekir. <ol><li> 0.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / mL nativ Aβ 1-42 50 ug 40 uL eklenmesiyle (etiketlenmemiş) 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 0.5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> % 20 1.96 mi, 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 ve 4 ug 20 ul / ml 15 NAβ 1-42 20 uL eklenmesiyle yerli 15 NAβ 1-42 bir 2 mL 40 ng / ml karışımı hazırlayın ACN ve% 4 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde amonyak konsantre edildi. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır. </li><li> 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde suni CSF 0.38 mL 40 ng / ml karışımı 20 uL ekleyin. çiftleri hazırlayın ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda karıştırılır. </li></ol> 5. Numune Hazırlama NOT: örnekleri çözülme rulo üzerinde oda sıcaklığında ölçülecek. <ol><li>Şekil 1&#39;e göre, bir 1 ml protein 96 derin oyuklu plakaya her kalibratör, yanıt faktörü ve (kullanıldığı takdirde kalite kontrol [QC] örnekleri dahil) bilinmeyen numunenin 0.18 mL ekleyin (tam bir plaka varsayılarak kullanılır). örnekleri eklemeyi unutmayın, ya da kuyu dibine, yakın olun. </li><li> Her iyi (yani, kalibratörler, tepki faktörleri, QCS ve bilinmeyenler) iç standardın 20 uL ekleyin; o pipet batış olmadan numunenin yüzeyine iyice yakın tarafında damla serbest bırakmak için önemlidir. </li><li> Her bir oyuğa 0.2 ml 5 M guanidin-hidroklorür ekleyin. </li><li> bir mikro çalkalayıcı örnek plakasını ve 1100 rpm&#39;de 45 dakika süre ile numuneler karıştırın. Optimal frekans enstrümantasyon bağlı olarak farklılık olabilir. Mikserin frekans ve genliği ayarlayın çözümler iyice karıştırılır ve iç standart veya CSF hiçbir damla kuyuların tarafında karışmamış bırakılır böylece. </li><li> % 4 fosforik asit 0.2 mL eklemeher oyuğa. Vortex kısaca karıştırın. </li></ol> 6. Katı Faz Ekstraksiyon Not: Tüm yıkama, yükleme ve elüsyon adımlarda, çözelti ilave edildikten sonra mümkün olan en düşük vakum uygulanır ve yük veya çözelti elüt edilmesi için gerektiği şekilde yavaş yavaş artar. Her yükleme ve elüsyon adım arasındaki vakum devre dışı bırakın. <ol><li> karma modunda atıklar için bir rezervuar tepsi koyun, ekstraksiyon plakası manifold bölmesi katyon-değişim, 96-çukurlu bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) plaka. </li><li> Her bir oyuğa 0.2 ml metanol eklenerek SPE sorbent hale getirin. </li><li> her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek sorbent dengelenmesi. </li><li> SPE plakasına derin kuyu plaka tüm örnekleri (her kuyuda yaklaşık 0.62 ml) aktarın. SPE plakasına derin kuyu plaka örnekleri aktarırken sekiz kanallı pipet kullanın; Numuneler, bir intern içeren, çünkü tüm örneklerin tamamı veya eşit hacimlerde aktarmak için önemli değildirdeğişimleri telafi edecek al standardı. </li><li> Numuneler her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek üzerinden geçtikten sonra sorbent yıkayın. </li><li> yıkayıcı çözücü sorbentten elüt sonra, bir toplama plakası ve tüpler haznesi tepsisini değiştirin. </li><li> iki kez% 75 ACN /% 10 konsantre amonyak 50 uL eklenmesiyle sorbentten örnek Zehir, ve bu çözelti, sorbent geçmesi için çok düşük bir vakum gerektirdiğini not edin. her ilave arasında vakum devre dışı bırakmak için unutmayın. <ol><li> İSTEĞE BAĞLI: toplama plakası veya tüpleri Seal ve -80 ° C&#39;de onları dondurmak. 6.8.2 adıma geçmeden önce toplama plakası veya tüplerden contayı sökün. </li><li> (Isı uygulamadan) vakum santrifüj kullanılarak eluatları Kuru; Bu vakum santrifüj bağlı olarak birkaç saat birinden alabilir. </li><li> kapları mühür ve -80 ° C&#39;de onları dondurmak. </li></ol></li></ol> 7. Sıvı Chromatografisi <ol><li> Ve iğne yıkama (% 50 ACN (ACN [hacim / hacim]% 4, deiyonize su ve% 0.1 konsantre edilmiş amonyak), B (iyonu giderilmiş su [hacim / hacim]% 5 ACN ile% 0.3 konsantre edilmiş amonyak), mobil faz A Hazırlama ve% 4, deiyonize su içinde amonyak konsantre edildi: [hacim / hacim]). <ol><li> Mobil faz A, 500 ml ACN 25 mL deiyonize su konsantre amonyak 1.5 ml. iyonu giderilmiş su ile 500 mL nihai hacim ayarlayın. </li><li> mobil faz B, 500 ml konsantre amonyak 500 uL ACN iyondan arındırılmış 25 ml su ilave edin. ACN ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> ACN, 120 ml deiyonize su, konsantre amonyak 10 ml ilave iğne yıkama 250 mL hazırlayın. deiyonize su ile 250 mL son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> LC sistemi kullanmadan önce 20 dakika süreyle sonikasyon banyosunda açık mobil fazlar A ve B iğne yıkama şişeleri koymak </li></ol></li><li> 25 uL konsantrasyon% ACN% 20 ve 4 ile her bir örnek çözülürted amonyak çözeltisi, 20 dakika süre ile bir çalkalama üzerine yerleştirin ve. örneklerin aşağı santrifüj ve alıcısı içinde koyun (7 ° C&#39;de tutmak). </li><li> 50 ° C &#39;de muhafaza edilen bir 1 x 250 ila 2 mm polistiren-divinilbenzen (ters faz) monolitik kolon üzerinde örneğin 20 ul enjekte edilir. <ol><li> 0.3 mL / dakika bir akış oranı ile Tablo 4&#39;te gösterilmiştir LC gradyanı kullanın. kütle spektrometresi kirlenmesini azaltmak için yönlendirme vanası kullanılarak (post-sütun) atık ilk iki ve son beş dakika yönlendir. </li></ol></li></ol> 8. Kitle spektrometrik analiz NOT: Bu parametreler aheated elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile teçhiz edilmiş bir dört kutuplu-Orbitrap hibrid kütle spektrometresi kullanıldı. <ol><li> Tablo 5&#39;e uygun iyon kaynağı parametrelerini ayarlar. </li><li> (Yerli Aβ 1-42 4+ şarj durumlarını izole etmek için 1,129.48 kütle cinsinden MS cihazı ayarlayın2,5 m / z yalıtım genişliği kuadruple kitle analizatöründe için şarj oranı [m / z]), 1-42 15 NAβ (1,143.00 m / z), ve 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z). </li><li> 17.0 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE) ile çarpışma hücresinde izole peptidler parçalara. (Örneğin, bir üçlü dört MS gibi araçlarla diğer türleri, kullanımı ve özellikle de) da aynı türde Bu, her enstrüman için ayarlanmış olması gerekebilir. </li><li> 2 x 10 5 ücretleri otomatik kazanç kontrol hedefine ve 250 ms maksimum enjeksiyon süresi ile 17.500 çözünürlüğe sahip fragmanı spektrumları kaydedin. </li></ol> 9. Veri İşleme <ol><li> Her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için Tablo 6&#39;da (± 250 mili kütle birimlik [mmu] kütle toleransla) Ürün iyonlarının toplamı kullanın. iyon türleri ve sayıları yalnızca yerel Aβ için gösterilen unutmayın <sub&gt; 1-42 ürün iyonları, bu 15 NAβ 1-42 ve 13 CAβ 1-42 için aynı olduğundan. </li><li> Yerel Aβ 1-42 eğri altında kalan alan 15 NAβ 1-42 eğrisi (kromatografik tepe) altındaki alanı bölünmesiyle iki farklı yanıt faktörü numunelerin ortalama yanıt faktörünü belirleyin. </li><li> Adım 9.2 hesaplanan tepki faktörü ile çarpılarak kalibrasyon için kullanılan 15 NAβ 1-42 konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Konsantrasyonuna karşı kalibratör iki grup 13 CAβ 1-42 kadar NAβ 1-42, 15 alan oranları işaretlenmesiyle bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak. </li><li> lineer regresyon kullanılarak kalibrasyon eğrisinin eğimini ve kesişme hesaplayın. </li><li> Un iç standart (CAβ 1-42 13) yerli Aβ 1-42 alanı oranını hesaplamakBilinen örnekler. </li><li> Adım 9.5 &#39;de elde edilen eğim ve kesişme kullanarak kalibrasyon eğrisinden bilinmeyen örneklerinin konsantrasyonunu tahmin. </li></ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer's+disease.">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li><li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li><li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer's+disease:+the+IWG-2+criteria.">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+levels+of+beta-amyloid+1-42,+but+not+of+tau,+are+fully+changed+already+5+to+10+years+before+the+onset+of+Alzheimer+dementia.">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li><li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer's+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li><li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid.">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li><li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer's+disease+biomarkers+in+clinical+setting.">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li><li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer's+Association+quality+control+program.">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li><li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Utility+and+Analytical+Challenges+in+Measurement+of+Cerebrospinal+Fluid+Amyloid-beta1-42+and+tau+Proteins+as+Alzheimer+Disease+Biomarkers.">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li><li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer's+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers:+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42.">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li><li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle's+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach.">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li><li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine:+method+validation,+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte,+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard.">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li><li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid.">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li><li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix.">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li><li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+collection+tubes:+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis.">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li><li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides.">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li><li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+(A&#946;)1-42+and+the+CSF+A&#946;1-42+/A&#946;1-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET.">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (A&#946;)1-42 and the CSF A&#946;1-42 /A&#946;1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li><li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes.">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li><li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceability+in+laboratory+medicine.">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li></ol>

JP and EP reports no disclosures. HZ has served on the advisory boards of Roche Diagnostics, Eli Lilly, and Pharmasum Therapeutics. KB has served as a consultant or on the advisory boards for Fujirebio Europe, IBL International, and Roche Diagnostics. HZ and KB are co-founders of Brain Biomarker Solutions in Gothenburg AB, a GU Venture-based platform company at the University of Gothenburg.

Tarif edilen yöntem için, bunun yerine bir yedek matris kullanılarak, insan CSF kalibrasyon sağlar taşıyıcı analit yaklaşım 13, 14, 15, 16, kullanılır. vekil analit yaklaşım iki farklı izotopik olarak etiketlenmiş standartları içerir. Başka bir (13 CAβ 142), dahili standart olarak kullanılır ise bir (15 NAβ 142), insan CSF kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır. Kalibrasyon eğrisi hesaplanan endojen Aβ 142/13 CAβ 142 oranında 15 NAβ 142/13 CAβ 142 oranı kullanılarak inşa bilinmeyen endojen Aβ 142 konsantrasyonları sonra hesaplanmıştır. 142 kurtarma hiçbir analit içermeyen CSF kullanılabilir ve düşük Aβ beri vekil analit yaklaşımı kullanılmıştıryöntem geliştirme sırasında bir vekil matris içinde yerli Aβ 142 kullanırken gözlenmiştir. NAβ 142 ve ana Aβ 142 15 yana bilinen bir konsantrasyonu, 15 NAβ 142 ve ana Aβ 142 eşit konsantrasyonlarını ihtiva eden bir RF numune yapay CSF örnek ölçülerek ayarlanır, MS 15 NAβ 142 konsantrasyonunun farklı tepkiler verebilir nedeniyle 15 izotop saflıkta olası varyasyonlar farklı kütle spektrometre arasında farklılık olabilir AAA.The tepki faktörü ile belirlenir partiler arasındaki peptit N-etiketli. Bu nedenle, Yanıt Faktörü her ölçüm gün için belirlenmelidir. Bu protokolde en kritik adımlar kalibratörlerinin ve RF örneklerinin hazırlanması bulunmaktadır. Özellikle Aβ 1-42 Aβ peptidler, çok hidrofobik ve kolayca pipet uçları sopa birnd tüpleri 8, 17, 18 yüzeyleri. pipetleme sırasında Aβ peptidler kaybını en aza indirmek için, teslimattan önce pipet uçları doyurmak için son derece önemlidir. Tercihen, peptid solüsyonu üç hacim önce yeni bir tüp ihtiva eden çözeltiye teslim atılmalıdır. Stok çözeltisinin hacmi ve konsantrasyonu ile ilgili olarak, bu her zaman mümkün değildir. İkinci en iyi yaklaşım yukarı ve teslimattan önce üç kez aşağı peptid çözüm pipetle için tabii ki. Aynı nedenle, büyük boş hacimlere kaçınarak borular için uygun boyutları kullanmak önemlidir. Yöntem, daha önce yayınlanan veri kurtarma% 100 (% 15) 15 içinde olduğunu göstermektedir. Arka hesaplanan kalibratörlerinin için göreli hatalar kalibratör eğrisi 19 tarafından tanımlanan tüm aralığın% 15&#39;in altında idi. Bir OBu tekniğin bvious sınırlama düşük verimli otomatik bağışıklık göre olmasıdır. Bununla birlikte, tarif edilen metodun amacı, yüksek hassasiyet ve kapasiteye sahip olmasıdır. Bu yöntem aynı zamanda 19 daha kısa Aβ 1-38 ve Aβ 1- 40 içerecek şekilde genişletilebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama operatör alet üzerinde analize geçmeden geniş kütle spektrometresi eğitime ihtiyaç olacaktır. immün kullanılarak miktar tayini antikor ile antijen arasındaki etkileşime bağlıdır. Bu etkileşim, engelleyen veya etkileşim ile rekabet edebilir numune bileşenlerinin mevcudiyetinde etkilenebilir. Buna ek olarak, bir etkileşim de antijenin uygunluğunu etkilenebilir. Bu etkiler kontrol etmek zordur ve immunoassay platformları arasında ve laboratuarlar arasındaki sonuçların uyumlu hale getirilmesine zor olmuştur temel nedeni olduğuna inanılmaktadır. becMS ause miktar, doğrudan bir kararlı, izotopla işaretli standart göre hedef molekülleri sayımı dayanır, miktar, matris etkilerinden mutlak ve genellikle etkilenmemektedir. böylece Karşılaştırılabilirliği iyileştirilmesi, LC-MS / MS ve RMPS stabil izotop etiketli dahili standartların ve CRM valide gelen ek olarak, immünoeseylerle tanı protein ölçümleri, yüksek dereceli ölçüm prosedürleri ve malzemelerin kesintisiz bir zincir ile desteklenmeli ve sonuçlar 20, 21 güvenilirlik. Sonuç olarak, BOS Aβ 142 ölçümü için açıklanan RMP BOS Aβ 142 için genel kesme konsantrasyon kurmak için yardımcı olacak bir CRM geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Tam cut-off değerleri doğru erken AD teşhisine yönelik son derece önemli olan ve hastalık modifiye ilaçların yeni tip klinik ulaştığında büyük önem taşımaktadır.

Alzheimer hastalığı (AD), demansın en yaygın biçimidir ve dünya çapında 1 ila yaklaşık 35 milyon insanı etkiler. Yaygın AD patogenezinde özünde yalan inanılan hastalığın nöropatolojik işaretlerinden toplu amiloid-beta (Aβ) peptitler 3 oluşan hiperfosforile tau proteininin 2 hücre içi nörofibrillerin ve hücre dışı plaklar vardır. Buna paralel olarak, biyomarkerların tarafından in vivo plak patoloji değerlendirmesi son zamanlarda AD 4 araştırma tanı kriterleri dahil edilmiştir. Aβ 1-42 BOS ölçümleri için, çok sayıda bağışıklık mevcuttur ve çok sayıda klinik laboratuarlarda 5 kullanılır. BOS Aβ 1-42 konsantrasyonu br plaklarda peptidin birikme yansıtan bilişsel normal yaşlılarda daha AD hastalarında yaklaşık olarak% 50 daha düşüktürain 6, 7. Bu biyolojik esas olarak immün (örneğin, antikor bazlı teknikleri) kullanılarak analiz edilir, ancak bu deneyler, matriks etkileri 8 etkilenebilir. Farklı teknoloji platformları üzerinde immunoassay ve tahlil standardizasyon 9 eksikliği kullanımı 10 11, 12 zorlu küresel kesme konsantrasyonlarının giriş yapar. Analitik doğrulanmış RMP ideal analitik platformlarda daha iyi karşılaştırılabilirlik ve genel ölçüm değişkenliği katkıda bulunan faktörlerden daha iyi kontrol sonuçlanan farklı tahlil platformları üniforma kalibrasyonunu imkan verecek. Geliştirilmiş LC-MS / MS yöntemi kullanılarak Aβ 1-42 mutlak ölçümü antikor bazlı techn ile bağlantılı sorunların üstesinden geliriques. Laboratuvar Tıp İzlenebilirlik için Ortak Komitesi (JCTLM veritabanı kimlik numarası C11RMP9) tarafından bir RPM olarak listelenen yöntem, BOS Aβ 1 uyumlaştırmak için bir Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) içinde Aβ 1-42 mutlak konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır teknikleri ve analitik platformlarda -42 ölçümler. açıklanan iş akışı Tıbbın diğer alanlarında peptidler ve proteinler için aday başvuru yöntemlerinin geliştirilmesi için alaka olmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951032905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom</td>
			<td>Micronic</td>
			<td>MPW32071BC3</td>
			<td>Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes</td>
			<td>Micronic</td>
			<td>MP53026</td>
			<td>Caps for Micronic tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded</td>
			<td>Micronic</td>
			<td>MPW51015BC3</td>
			<td>Holder for Micronic tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohit Optifit tips 1.2 mL</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>791210</td>
			<td>Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Oasis MCX 96-well &#181;Elution Plate</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001830BA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Plate manifold reservoir tray</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT058942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30501-1L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0627/17X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1005731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride, 500 g</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>With bundled Dionex Ultimate 3000 LC &#38; autosampler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)</td>
			<td>Dionex</td>
			<td>066640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA</td>
			<td>rPeptide</td>
			<td>A-1002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled</td>
			<td>rPeptide</td>
			<td>A-1102-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled</td>
			<td>rPeptide</td>
			<td>A-1106-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate shakers, TiMix 2</td>
			<td>Edmund B&#252;hler</td>
			<td>6110 000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of a&#946;1-42 in csf using a mass spectrometric reference measurement procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Şekil 1 &#39;de plaka kurulumu numune tam levha kullanılır. Daha az bilinmeyen numuneler analiz edilecek ise, ikinci kalibratör, RF, ve QC setleri bilinmeyen numunelerin ilk yarısından sonra konulmalıdır. Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, kalibratörler, düşük ve standart sapmalar, regresyon çizgisine yakın bulunmaktadır. Bu yöntem, 150 pg / ml ve 4,000 pg / ml miktarının bir üst düzeyde miktarının daha düşük bir seviyede bulunur. Kalibrasyon kalan standart sapması tabii ki mümkün olduğu kadar düşük olması gerekmektedir. Kalibrasyon non-lineer ise, çalıştırma (şiddetine bağlı olarak) atılmalıdır ve sapma nedeniyle kalibratörlerinin seyreltme yanlış pipetleme tekniği ve / veya hatalar büyük olasılıkla. çoğaltır varyasyon (CV) katsayısı% 20&#39;nin altında, tercihen% 10 altında olmalıdır. ogether.within-page = &quot;1&quot;&gt; simetrik doruklarına yakın ve önemli kuyrukçuluğunda olmadan aynı anda LC sütunundan yerli 15 N ve 13 CAβ 1-42 elute (onlar sadece izotop düzeyde farklılık beri), (Şekil 3 ). En az on ölçümleri her kromatografik tepe için yapılmalıdır ve alet yöntemi maksimum enjeksiyon süresi ile ayarlanabilir. Her üç peptidler MS analizi sırasında tüm ölçümlerde (kalibrasyon, RF, ve bilinmeyenler) için eş zamanlı olarak ölçülebilir. Yöntemin duyarlılığı suboptimal, ancak sadece ilgilenilen peptitlerin (her enjeksiyon için ölçülmelidir yani., Sadece RF örnekleri için yerel kalibratör 15 N, 13 CAβ 1-42 ve 15 NAβ 1-42 ölçmek ) yerli ve bilinmeyen numuneler için 13 CAβ 1-42. Şekil 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: SPE ve derin oyuklu plakalar Düzenleri. kalibratörlerinin tipik düzeni (AF), tepki faktörü numune (RF), kalite kontrol numuneleri (QC) ve bilinmeyenler. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55386/55386fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55386/55386fig2.jpg" /> Şekil 2: Kalibrasyon eğrisi. Kalibrasyon eğrisi 172 15 NAβ 1-42, 572, 1,144, 2,287, 3,431 ve 4,574 pg / ml (yanıt faktörü kullanılarak ayarlanmıştır) ve insan CSF iç standart olarak 13 CAβ 1-42 kullanılarak inşa (n = 2) . 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 alan oranı taslak haline getirilir (Y-ekseni)konsantrasyonu (X-ekseni) karşı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55386/55386fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55386/55386fig3.jpg" /> Şekil 3: kromatogramı. 0.500 ng / ml yerli (endojen) Aβ 1-42 (üst panel) ve insan BOS 1.6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (alt panel) kromatogramı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55386/55386fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55386/55386fig4.jpg" /> Şekil 4: bilinmiyor örneklerinde bilinmeyen Aβ 1-42 Niceleme &lt;./ strong&gt; pik alanı oranı iç standart (13 CAβ 1-42) kromatografik tepe alanı ile yerel Aβ 1-42 kromatografik tepe alanı bölünmesiyle hesaplanır. Örnek doğal Aβ 1-42 konsantrasyonu kalibrasyon eğriden yola çıkılarak hesaplanır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55386/55386fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55386/55386table1.jpg" /> Tablo 1: Güvenlik Bilgileri. Bu protokol için kullanılan kimyasalların güvenlik bilgileri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kalibratör çözümü </td><td> 100 ng hacmi / ml 15 NAβ 1-42 çözeltisi (mi) </td&gt; <td> % 20 ACN% 4 amonyak hacmi (mi) </td><td> Nihai hacmi (mi) </td><td> Nihai 15 NAβ 1-42 konsantrasyonu (ng / ml) </td></tr><tr><td> bir </td><td> 0.20 </td><td> 0.30 </td><td> 0.50 </td><td> 40.00 </td></tr><tr><td> B </td><td> 0.15 </td><td> 0.35 </td><td> 0.50 </td><td> 30.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 0.20 </td><td> 0.80 </td><td> 1.00 </td><td> 20.00 </td></tr><tr><td> D </td><td> 0.10 </td><td> 0.90 </td><td> 1.00 </td><td> 10.00 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.05 </td><td> 0.95 </td><td> 1.00 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0.03 </td><td> 1.97 </td><td> 2.00 </td><td> 1.50 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Kalibratör çözümleri. Kalibratör solüsyonları% 20 ACN içinde hazırlanır ve% 4 amonyak konsantre edildiBOS kalibratörler spike kullanılır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kalibratör </td><td> Kalibratör çözümü karşılık gelen hacim (ml) </td><td> İnsan BOS hacmi (ml) </td><td> Nihai hacmi (mi) </td><td> Nihai 15N-Aβ1-42 konsantrasyonunun (ng / ml) </td></tr><tr><td> bir </td><td> 0,02 (A) </td><td> 0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 4.00 </td></tr><tr><td> B </td><td> 0.02 (B) </td><td> 0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 3.00 </td></tr><tr><td> C </td><td> 0,02 (C) </td><td> 0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 2.00 </td></tr><tr><td> D </td><td> 0.02 (D) </td><td> 0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 1.00 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.02 (E) </td><td> 0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 0.50 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0,02 (F) </td><td>0.18 </td><td> 0.20 </td><td> 0.15 </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Kablibratörler. İnsan CSF hazırlanan kalibratörler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Süresi (dak) </td><td> % Mobil faz B </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: LC gradyan. 300 uL / ​​dakika bir sabit akış oranı ile kullanılan LC gradyanı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parametre </td><td> değer </td></tr><tr><td> Kılıf gazı </td><td> 50 </td></tr><tr><td> munzam gaz </td><td> 6 </td></tr><tr><td> sprey gerilimi </td><td> 4.4 kV </td></tr><tr><td> S-lens RF </td><td> 61 </td></tr><tr><td> Isıtıcı sıcaklığı </td><td> 190 ° C </td></tr><tr><td> kılcal sıcaklığı </td><td> + 350 ° C </td></tr></tbody></table> Tablo 5: İyon kaynağı ayarları. iyon kaynağı için parametreler cihaz ayar yazılımında ayarlanacak. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> prekürsör iyon </td><td> ürün iyonları </td></tr><tr><td> Yerli Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) </td><td> 915,19 (b334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (b354 +), 1000,74 (b364 +), 1029,51 (b384 +), 1054,03 (b394 +), 1078,79 (b404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (b313 +), 1200,25 (b323 +), 1257,29 (b343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (b363 +), 1372,00 (b383 +), 1405,02 (b393 +) </td></tr><tr><td> 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) </td><td> 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 </td></tr><tr><td> 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) </td><td> 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 </td></tr></tbody></table> Tablo 6: ölçümü için kullanılan iyonlar. Ön-madde iyonları 4+ yük durumları 2,5 m / z bir izolasyon genişliği, kuadruple kitle analizatöründe izole edilir. (± 250 MMU kütle toleransla) ürün iyonları her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için kullanılır. İyon türleri ve sayıları onl olanY, her 15 NAβ 1-42 ve 13 CAβ 1-42 için aynı olduğundan, ana Aβ 1-42 ürün iyonları için gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of AÃŽÂ²1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure at JoVE.com

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Aβ mutlak Niceleme<sub&gt; 1-42</sub&gt; BOS bir kitle Spektrometrik Referans Ölçüm Prosedürü kullanma

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Görüntüleme.  The Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, Sahlgrenska University Hospital. A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Video: Absolute Quantification of Aβ1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

Akciğer Perfüzyon Kalibreli Arter Spin Etiketleme kullanarak Manyetik Rezonans Görüntüleme Niceleme

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

Tıp

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentasyon ve Mürin Obezite Modelleri Yağ Hacimleri ölçümü X-ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Bir Fiber optik Basıç kullanarak Sıçanlarda Epidural İntrakraniyal Basınç Ölçümü

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

İlaca dirençli Temporal Lob Epilepsi Hastalarında Foramen Ovale Elektrot Kayıtları Ağ Analizi

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical density (L-OD) and zeaxanthin optical density (Z-OD) in the central 1 degree of the fovea. A modification of the technique was developed to evaluate in vivo carotenoid density eccentric to the fovea. An adjustable track system with red LED lights was placed 6.1 m away from the participant to facilitate ocular fixation. Lights were spaced appropriately to create increments of 1 degree retinal disparity during the reflectometry measurements. All reflectometry measurements were obtained with pupillary dilation. The mean MPR-MPOD value for the central measurement was 0.593 (SD 0.161) with an L-OD to Z-OD ratio of 1:2.61. The MPR-MPOD value at 1 degree was 0.248 and the mean MPR-MPOD value at 2 degrees in the parafoveal region was 0.143. The L-OD to Z-OD ratio at 1 degree and 2 degrees off center was 1.38:1.0 and 2.08:1.0, respectively. The results demonstrate that MPOD measurements obtained using the MPR decrease as a function of retinal eccentricity and that there is a higher concentration of zeaxanthin centrally compared to lutein. The L-OD to Z-OD ratio changes with foveal eccentricity, with twice more lutein than zeaxanthin at 2 degrees off center. Our technique successfully provides a quick in vivo method for the measurement of macular pigment optical density at various foveal eccentricities. The results agree with prior published in vivo and in vitro xanthophyll carotenoid density distribution measurements.

We present a protocol to determine the levels of overall macular pigment, lutein, and zeaxanthin optical density in the central and parafoveal regions of the retina. The protocol includes a novel adjustable track system used to measure macular pigment optical density in the foveal eccentricity.

Makula Pigment Reflektometresi Kullanılarak Perifovea'daki Karotenoidlerin Ölçülmesi

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...

Using an Automated Hirschberg Test App to Evaluate Ocular Alignment

A smartphone app has been developed to perform the automated photographic Hirschberg test for objective measurement of ocular misalignment. By computing the difference in corneal reflection generated by the phone camera flash relative to the iris center based on high resolution images, the app can measure misalignment with a much higher precision than the naked eye performing the Hirschberg test. It has been validated in a previous clinical evaluation study by comparing to the clinical gold standard-prism and alternate cover test. The goal of this article is to describe the testing techniques regarding how to use the app to measure ocular alignment for different fixation distances, without or with cover to break fusion, as well as angle kappa, so that users can use the app to perform equivalent tests typically done in clinic using prisms.

We present a protocol of using a smartphone app to perform Hirschberg test for measuring manifest and intermittent ocular misalignment (strabismus) under near and far fixation conditions.

Oküler Hizalama değerlendirmek için Otomatik Hirschberg Test Uygulaması kullanma

A smartphone app has been developed to perform the automated photographic Hirschberg test for objective measurement of ocular misalignment. By computing ...