The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

Deneyler Tel Aviv Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Fare gelen Pankreas Doku 1. İzolasyonu <ol><li> Yetişkin fareler için: <ol><li> 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözüldü ml DNaz: sindirim tamponu hazırlayın. Taze 15 ml konik tüpler fare başına tampon 5 ml hazırlamak ve kullanılana kadar buz üzerinde saklayın. </li><li> kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize. </li><li> pankreas kaldırmak için her fare teşrih (öğretim için Reference 18 bakınız); HBSS içeren bir kültür kabı içine koyun. 4 adet - Bir stereomikroskop altında bu aşamada gerçekleştirmek için, ve sindirim etkinliğinin artırılması 2 doku kesmek mümkündür. </li><li> (Adım 1.1.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları kadar buz üzerinde tüpler tutuntoplanmış. </li><li> Kalan fareler ile 1.1.4 - Tekrar 1.1.2 adımları. </li></ol></li><li> Embriyolar ve neonatal fareler için: <ol><li> 0.4 mg / ml kollajenaz P ve 0.1 ng / I HBSS içinde eritilmiş ml DNAz: sindirim tamponu hazırlayın. 15 ml konik tüp fare başına tampon 2 ml - doğum sonrası 7. günde (P7) ya da daha genç embriyo ve yavruların için, taze 1,5 hazırlamak. 15 ml konik bir tüp içinde, fare başına 4 ml tampon - P7 veya daha büyük yavrular için, 3 hazırlayın. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> kurumsal kılavuzuna göre fareler Euthanize. embriyolar için, annelerinin rahmine tüm embriyolar kaldırmak ve PBS içeren 10 mm&#39;lik kültür kaplarına koyun. her seferinde bir embriyo teşrih. </li><li> başını uzak araştırmacı dan bakacak, sırtında fare yatıyordu. Ince forseps kullanarak, fare diyafram 18 kadar karın boşluğuna maruz orta hatta karın cildi ve açık yukarı çekin. </li><li> Ince forseps kullanarak, karaciğer fr ayırmakarka karın duvarı om. Fare kuyruğu doğru sürekli bir hareket ile, (karaciğer, mide, dalak, bağırsaklar, böbrek ve pankreas dahil) iç organları dışarı kepçe ve HBSS içeren bir kültür tabağına yerleştirin. </li><li> Bir stereomikroskop altında, karaciğer ve pankreası maruz böbrekleri (Şekil 1) çıkartın. Ince forseps kullanarak, dalak, nihayet mide, duodenum gelen pankreas ayırmak ve. </li><li> (Adım 1.2.1 hazırlandı) sindirim tamponu ihtiva eden bir tüpe pankreas dokusu yerleştirin. p14 veya daha büyük yavrular için, sindirim verimliliği artırmak için 2 adet doku kesmek. Tüm fareler disseke ve pankreas dokuları toplanana kadar buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Kalan fareler ile 1.2.6 - Tekrar 1.2.2 adımları. </li></ol></li></ol> 2. Pankreas Sindirim <ol><li> agitat ile 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu (sindirim tamponu içinde) pankreas dokusu ihtiva eden tüpler inkübe700 rpm&#39;de ve iyon. 15 dakika sonra, elle onları 3 ters çevrilerek tüpleri sallamak - 4 kez ve geri ısıtma bloğu koyun. Ajitasyon yetenekleri olmayan bir ısıtma bloğu kullanıyorsanız, boruları her 5 ters - 10 dk: NOT. Doku düzgün sindirilir olduğundan emin olun. Değilse, inkübasyondan önce küçük parçalar halinde doku kesme ya da ajitasyon artar. </li><li> Doku sindirim durdurmak buz üzerinde tüpler yerleştirin ve her tüpe soğuk HBSS 10 ml ekleyin. 4 ° C&#39;de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire. </li><li> Yeniden süspansiyon: <ol><li> Yetişkin fare ve P14 veya daha büyük yavrular için, PBS 6 mL pelet yeniden askıya ve yeni bir 15 mL konik toplama polipropilen tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgecinden geçirin. maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ilave 6 ml orijinal tüp yıkayın ve toplama tüpüne hücre süzgecinden süzün. </li><li> Embriyolar ve yavrular genç tHan P14, 2 mL PBS ile pelet yeniden askıya ve 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir polistiren toplama tüpü (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden geçirin. Maksimal hücre iyileşme sağlamak için, PBS ek olarak 2 mL orijinal tüp yıkama, toplama tüpünün üzerine hücre süzgecinden geçirin. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de tüpler santrifüj ve 5 dakika boyunca 300 x g ve süpernatan aspire. Hücreler gevşek polistiren tüpüne bağlı olarak, dikkatli bir şekilde sıvı çıkarın. </li></ol> 3. Tek Hücreleri Etiketli Hazırlanması <ol><li> Tampon hazırlanması: FACS hücre izolasyonu için,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mM EDTA (kalsiyum klorür ve magnezyum klorür) olmadan PBS karıştırılarak tampon sıralama hazırlar. Akışkan sitometri analizi için,% 0.05 sodyum azid ile ayırma tamponu ilave ile analiz tamponu hazırlayın. Her iki tampon maddesi en fazla 2 ay boyunca 4-8 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> sıralama veya Ana hücrelerin yeniden askıyaliziz tamponu. P8 ve 1.5 mL eski bir ay arasında yavrularından embriyolar ve 1 mL P7 daha genç yavruların izole her pankreas, yeniden askıya ve 3 mL bir ay farelerden daha büyük. Yuvarlak dipli bir polistiren tüp (FACS tüpü) üstüne yerleştirilmiş bir 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri süzün. </li><li> kontrolleri boyanması için, önceki adımda (toplam örnek hacmi en fazla% 5) yapılan örneklerden 100 mcL alikotları için 50- çıkar ve yeni FACS tüpler içine yerleştirin; DAPI floresan proteinleri de dahil olmak üzere, kullanılan her bir fluorofor için bir tüp, ve aynı zamanda bir lekesiz kontrolü bulunmaktadır. Not: bir flüoresan proteini eksprese eden hücrelerle transgenik fareler kullanılarak, hücre sayısı sınırlı olduğunda, ya da bir boyama kontrol olarak transgenik olmayan bir doku içerir. Bir floresan proteini eksprese eden hücreler bundan başka boyama kullanıldı ise, 3.8 adım geçin. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire. </li><li> bloğunKing, (keçi IgG 1 uL ile takviye sıralama 100 uL veya analiz tamponu) bloke etme çözeltisi ile hücrelerin yeniden askıya alma ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> hücre yüzeyi işaretçileri leke için, numune başına 100 uL bir hacimde, istenen tüm florofor-konjuge antikor içeren bir karışımın hazırlanması. Ayırma veya analiz tamponu içinde 2x antikor dilüe (yani, çift gerekli konsantrasyon elde etmek için bir antikor seyreltilmiş 1; nihai seyreltme: 100: 200 istenirse, antikor 1 seyreltilmiş). Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek örnek hücreleri karışımın 100 uL ilave edin. Buz üzerinde 30-60 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> tek (boyama kontrolü) kullanılan antikorların içeren ek tüpler hazırlamak, analiz veya sıralama parametreleri (adımlarını 4.3 ve 5.2) ayarlamak için kullanılır. (Adım 3.6 açıklandığı gibi) sıralama veya analiz tamponu 2x antikor dilüsyonları hazırlayın. Yap si eklemeyi unutmayınkullanılan her florofor, hem de lekelenmemiş kontrol ngle boyama kontrol seyreltme. Engelleme solüsyonun olmadan, 200 uL nihai boyama hacmi elde etmek (adım 3.3 hazırlandı) hücrelere antikor karışımı, 100 uL ilave edin. Buz üzerinde ve karanlıkta 60 dakika - 30 inkübe edin. </li><li> analizi ile her tüp doldurma ya da 4 ml&#39;lik bir maksimum hacme kadar tampon sıralayarak yıkayın. (Adım 3.2 de tarif edildiği gibi), isteğe bağlı olarak, 35 mikron hücre süzgecinden hücreleri yeniden süzün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve dikkatli bir şekilde supernatant çıkarın. </li><li> analiz veya tampon sıralama örnekleri yeniden askıya. 2 mL eski 3 ay ve 3 3 ay ml daha eski farelerden alınan - 1, 1 mL bir ay daha genç yavruların, 500 uL embriyoların izole hücrelerin yeniden askıya. Boyama kontrol tampon maddesi 300 uL içinde yeniden süspanse edilebilir. </li><li> 200 ng ekle / DAPI mL ölü hücreleri tanımlamak için hücreler yeniden askıya için. Make a tüp co eklemeyi unutmayınsitometresinin ayarları için DAPI olmadan lekesiz hücreleri ntaining. hücre sıralama (aşama 4) ya da analiz (aşama 5) &#39;e geçin. </li></ol> 4. Hücre Ayırma <ol><li> hazırlıklar: <ol><li> RNase ile RNA ekstre önce, kaplama bir 1.5 ml toplama tüpü hücre sıralama için önleyicisi hemen sıralamadan önce. Bu amaçla steril bir 1.5 ml toplama tüpüne, 0.01 U / ml RNaz inhibitörü içeren tampon sıralama 1 ml. 5 dakika sonra, tüp vorteks ve sıvıyı ayırın. </li><li> Hücre kültürü önce hücre sıralama için, steril bir kültür ortamının 3 ml ilave edilir, steril bir 15 ml toplama tüpüne (Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM)% 20 FBS,% 1 L-glutamin ile takviye edilmiş, ve penisilin-streptomisin,% 1) . </li></ol></li><li> FACS sıralayıcı içine bir tüp yüklemeden önce, girdap kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun. </li><li> (Örn sıralama parametreleri belirlemek için boyama kontrolleri analiz ederek başlayın, </em&gt; Gerilim ve telafisi) ve sıralama kapıları (örneğin, toplam hücre popülasyonu, canlı DAPI-negatif hücreler ve hücre popülasyonları) sıralanacak. </li><li> sıralama parametreleri ve kapıları yukarı ayarlandıktan sonra, örnekler yüklemek ve toplama tüpleri içine sıralama hücreyi başlatın. NOT: Sıralama koşulları alet üzerinde son derece bağlıdır. Bu 100 um meme genişlik, 23.1 psi&#39;lik bir basınç ve 5 maksimum ayırma hızı kullanır. </li><li> RNA ekstraksiyonu veya sıralanmış hücrelerin kültürlenmesi geçin. Not: RNA ekstraksiyonu için, 5 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve standart bir ekstraksiyon protokolü ile devam etmeden önce, fazla sıvının çıkması. Hücreler, steril olmayan koşullarda kriteri eğer, hücrelerin kültürlenmesi için, kültür ortamı ile tüp doldurma ve kirlenmeyi en aza indirmek için kültür önceki 7 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj bunu iki kez yıkayın. </li></ol> Akış Sitometrisi ile 5. Hücre Analizi <ol><li> l öncesitometre girdabına her tüp oading kısaca hücrelerin yeniden askıya. Buz üzerinde kalan tüpler tutun. </li><li> Analiz parametrelerini (örneğin, gerilim ve telafisi) belirlemek amacıyla lekesiz ve tek boyanmış numunelerin analiz ederek başlayın. </li><li> analiz parametreleri ayarlandıktan sonra, boyama kontrolü de dahil olmak üzere her örnek yüklemek ve sonuçları kaydedin. analiz yazılımı flow sitometri kullanılarak elde edilen sonuçlar analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Villasenor, A., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+developing+pancreas+and+its+blood+vessels:+An+evolving+dialog.">Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , 1-8 (2012).</li><li>Landsman, L., Nijagal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:+Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Developmental biology. 4, 242-255 (1962).</li><li>Bhushan, A., Itoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf10+is+essential+for+maintaining+the+proliferative+capacity+of+epithelial+progenitor+cells+during+early+pancreatic+organogenesis.">Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis.</a> Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).</li><li>Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Hox6+function+is+required+for+mouse+pancreatic+endocrine+cell+differentiation.">Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation.</a> Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).</li><li>Sasson, A., Rachi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pericytes+are+required+for+beta-cell+maturity.">Islet pericytes are required for beta-cell maturity.</a> Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).</li><li>Stanley, S. A., Kelly, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+electromagnetic+control+of+the+hypothalamus+regulates+feeding+and+metabolism.">Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism.</a> Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).</li><li>Brissova, M., Aamodt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+microenvironment,+modulated+by+vascular+endothelial+growth+factor-A+signaling,+promotes+&#946;+cell+regeneration.">Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes &#946; cell regeneration.</a> Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane:+a+niche+for+insulin+gene+expression+and+Beta+cell+proliferation.">The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation.</a> Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).</li><li>Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+elements+act+to+restrain,+rather+than+support,+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).</li><li>&#214;zdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li><li>Russ, H. A., Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomic+Analysis+of+Pancreatic+Mesenchyme+Reveals+Novel+Factors+That+Enhance+Human+Embryonic+Stem+Cell+to+Pancreatic+Cell+Differentiation.">Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation.</a> Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).</li><li>Gout, J., Pommier, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Primary+Pancreatic+Acinar+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).</li><li>Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+homeodomain+transcription+factor+Bapx1+in+mouse+distal+stomach+development.">Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development.</a> Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).</li><li>Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bapx1:+an+evolutionary+conserved+homologue+of+the+Drosophila+bagpipe+homeobox+gene+is+expressed+in+splanchnic+mesoderm+and+the+embryonic+skeleton.">Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton.</a> Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).</li><li>Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splanchnic+mesodermal+plate+directs+spleen+and+pancreatic+laterality,+and+is+regulated+by+Bapx1/Nkx3.2.">The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2.</a> Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).</li><li>Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+In+Vitro.">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).</li><li>Morris, J. P., Greer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+differentiation+and+viability+during+mouse+pancreatic+cancer+initiation.">Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation.</a> PloS one. 9 (5), 95486 (2014).</li><li>Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+analysis+with+fluorescent+timer+reveals+unique+features+of+newly+generated+&#946;-cells.">Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated &#946;-cells.</a> Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+enhances+delivery+of+chemotherapy+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).</li><li>Raz, Y., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+vicious+cycle:+Fibroblasts+and+immune+cell+recruitment+in+cancer.">An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer.</a> Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, biz izole etmek ve pankreas mikroçevresinin hücreleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, embriyonik ve yetişkin pankreas dokusundan mezenkimal hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde yetişkin ve yeni doğan pankreas 5, 17 endotel hücreleri izole etmek için bu protokolü kullanılmıştır. Bununla birlikte, (alternatif protokoller 24 Kaynaklar 18, 23 tarif edilen ve edilmiştir) pankreas epitel hücreleri tekrar üretilebilir bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için uygun olmayabilir. Bu yöntem, floresan etiketli hücreler kullanılarak ya floresan proteinleri ifade eden ya da yüzey belirteçleri için boyanmış, FACS ile saflaştınldı ve akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA gen sentezleme modelini profil saflaştırılmış hücrelerinden elde edilebilir. Alternatif olarak, saflaştırılmış hücreler, daha sonra proteomik analizi için bir hücre çizgisi oluşturmak için kültürlenebilir. Bu yöntem, faktör D karakterizasyonu sağlayacaktıronun organogenesis, fizyoloji ve patofizyolojisi yöneten pankreas mikro-tarafından xpressed. Pankreatik mezenşimin öncüleri ve farklı hücreler 5, 9 çoğalmasını teşvik doku organogenez destekler. Bu hücreler, insan embriyonik kök hücre büyümesini desteklemek gösterilmiştir (hESC) pankreas atalarıdır 17, 25, 26 -türevlenmiş. Bu nedenle, embriyonik mezenşimal faktörleri kimliğini belirleyen HESC ve diyabet için potansiyel bir tedavi olarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) insülin üreten beta hücrelerinin üretilmesi için mevcut çabalar kolaylaştıracaktır. Fare genetik çalışmalar pankreas gelişiminin erken evrelerinde pankreas epitel genişleme teşvik etmek mezenşimin tarafından üretilen gibi FGF10 gibi büyüme faktörleri, tanımlanmasını izin3, 9. Embriyonik mezenşimin ifade ek faktörlerin belirlenmesi amacıyla, biz, lazer yakalanan mikrodiseksiyon kullanarak bu hücrelerin izole onların RNA ayıklanır ve gen ifadesi analizi 26 seslendirdi. Bununla birlikte, emek-yoğun bir olmanın yanı sıra, bu yöntem, önceden çevre mezenşim (yani, E12.5) içerisine epitel dallanma gelişim aşamalarına kullanımını kısıtlar morfolojik özellikleri, temel hücrelerin belirlenmesi dayanır. Daha sonra gelişim aşamalarında mezenkimal hücreler karakterize etmek için, biz burada 5, 17 açıklanan yöntemi kullanılmıştır. Biz yenidoğan pankreas mezenşimin 5 yüzey işaretleyici ifade analiz etmek için bu yöntem kullanılır. Buna ek olarak, mezenkimal hücreler, Nkx3.2 -Cre embriyonik ve neonatal pankreas dokusundan izole edilmiştir; R26-EYFP fareler görefluoresan bu fare hattı etiketleme ve hücre çizgileri 17 kurmak için kültürlendi. HESC türetilen pankreas progenitörlerin 17 desteklemek için yeteneği ile pankreas mezenşimin salgılanan faktörlerin tanımlanması için izin verilen bu hücrelerin proteomik analizi. Biz daha RNA ekstraksiyon ve gen ekspresyon analizi 17 yetişkin pankreas dokulardan mezenkimal hücreler arındırmak için bu hücre izolasyon yöntemi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu yöntem, pankreatik hücre gelişimini desteklemek için yeteneği, pankreas mezenşim ile ifade edilen genleri ve proteinleri tanımlamak için kullanılabilir. Pankreas mezenkimal hücreler daha pankreas tümörü oluşumunda rol oynadığı gösterilmiştir. PDAC fibroblastlar, bağışıklık hücreleri içeren bir fibroblast zengin desmoplastik stroma oluşumu ve ECM 27 ile karakterize edilir. Stroma çok gelişmesini teşvik etmek düşünce ikenkanser türleri, o PDAC ilerlemesini 15, 16, 28 sınırlamaya gösterilmiştir. Bu pankreas stroma bileşenleri tümörogenez inhibe eden faktörleri salgılar düşündürmektedir. Ayrıca, stroma hücre bileşimin hem de hücre fenotipinde bir değişiklik epitel hücreleri 15, 16, 28 üzerindeki etkisinin altında olabilir. Burada tarif edilen yöntem, bu nedenle, sağlıklı pankreas dokusu ile karşılaştırıldığında PDAC stroma oluşturan farklı hücre tipleri karakterize yardımcı olabilir. Bundan başka, farklı bir stromal hücre tiplerinin saflaştırma PDAC ilerlemesi sırasında gen ekspresyon profillerinin potansiyel karakterize etmek izin verir. Ancak, tümörogenez 27 sırasında pankreas ECM bileşimindeki değişikliklere, bu tür addit dahil olarak doku sindirim parametrelerinin ayarlamaları,uğratarak kollajenaz tip ya da kuluçka süresini arttırmak gerekli olabilir.

Enerji homeostasis ve memelilerde gıda sindirim düzgün pankreas fonksiyonuna bağlıdır. ekzokrin ve endokrin: yetişkin pankreas iki hücre bölümlerinde oluşmaktadır. Üreten ve salgılayan sindirim enzimleri ve gut, bu enzimleri taşıma kanalı hücreleri, toplam pankreas kütlesinin 1% 80&#39;den fazlasını kapsayacak asiner hücreleri de dahil olmak üzere dış salgı hücreleri. Insülin üreten beta hücrelerini ve glukagon üreten alfa hücreleri bulunur endokrin hücreleri, ekzokrin dokusunda gömülü ve kan şekeri düzeylerini 2 düzenleyen hormonlar salgılar vardır Langerhans adacıkları düzenlenmektedir. Pankreas hücreleri yüksek regüle, çok aşamalı süreç 3 aracılığıyla farklılaşmış kaderini kazanır. Kanıt nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler tarafından sağlanan dış ipuçları t pankreatik hücre farklılaşması ve çoğalması yol olduğunu göstermektedirEmbriyonun 3, 4, 5. Bir örnek erken pankreas öncüleri 6 özellikleri için aort gerekliliktir. Daha sonra bir gelişme olarak, endotel hücreleri, hem de pankreas salgı ve ekzokrin hücreleri gelişiminde önemli bir rol oynar ve beta hücre farklılaşması, 4, 6, 7 teşvik ettikleri gösterilmiştir. Mezenkimal hücreler esas büyüme faktörü FGF10 8, 9 salgılanması yoluyla, hayatta kalma ve ortak pankreas atalarıdır genişlemesini desteklemek gösterilmiştir. Biz ayrıca, bu hücreler, embriyonik pankreas 5 endokrin ve ekzokrin öncülerinin proliferasyonunu, hem de bir (asinar ve beta hücreleri dahil) farklılaşmış hücreleri destek göstermiştir. Son zamanlarda, mezenkimal hücreler, daha vardıendokrin hücreleri farklılaşmasını 10 düzenleyen gösterilmiştir. Yetişkinde, beta hücresi işlevi ve kütle bağışıklık nöronal, ve endotelyal hücreler gibi perisitlerin 11, 12, 13 dahil olmak üzere, mikro-hücre bağlıdır gösterildi. Yaralanma sırasında endotel hücreleri beta hücresi çoğalmasını 13 desteklemek için pankreas bağışıklık hücreleri iyileştirme gösterildi. Endotel hücreleri daha insülin ekspresyonu ve beta hücresi fonksiyonunu 14 desteklemek için hücre dışı matris (ECM) bileşenleri üretmek için gösterildi. Biz son zamanlarda beta hücre fonksiyonu 11 adacık perisitlerin gereksinimi gösterdi. Son olarak, pankreas stroma hücreleri, pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) 15, 16 ve ilerlemesini düzenleyen gösterildi. Bununla birlikte, kimlikPankreas geliştirme, fonksiyon ve tümörogenez rehberlik dışsal ipuçlarını işletmenin büyük ölçüde bilinmemektedir. pankreas mikro-hücreleri tarafından sağlanan ipuçları belirlenmesi, bu hücreler tarafından ifade edilen genleri ve proteinleri karakterize gerektirir. Bu ve / veya hücre hatları kurma gen ekspresyonunu ve proteomik analizlerini gerçekleştirmek için pankreastan bu hücrelerin izole edilmesi bağlıdır. Burada, floresan proteinleri ifade immunofluorescently-işaretli hücrelerin veya hücre ya sıralama doku, enzimatik sindirim ve floresans ile aktive edilmiş hücre (FACS) kullanılarak pankreas mikro mezenşimsel hücrelerde izole etmek için bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, başarılı bir şekilde, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas 5, 17, mezenkimal hücreler izole ve sarı floresan protein (YFP) -expressing analiz gerçekleştirilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:191px;">11213865001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D5025-15KU</td>
			<td>The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">EDTA</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">01-862-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Goat IgG serum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D8537</td>
			<td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:191px;">72 690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Round Bottom Polystyrene 5 ml tube&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352008</td>
			<td>FACS tube&#39;. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml tube with 35 &#956;m cell strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352235</td>
			<td>FACS tube&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:191px;">130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heating block with agitation&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">ThermoMixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:191px;">Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Steromicroscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:191px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:191px;">FACSAria IIu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:191px;">Gallios&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Pankreas mezenşimin gelişimi ve yetişkinlik döneminde gereklidir. Burada anlatılan yöntemi embriyonik, yenidoğan ve yetişkin pankreastan mezenkimal hücrelerin izolasyonu sağlar. Mezenkimal hücreler, ancak başka bir hücre tipi, Nkx3.2 -Cre pankreaslarında sarı floresan protein (YFP) ifade; R26R -YFP fareleri 5, 11, 17, 19. Gelişimi sırasında, (aynı zamanda BapX1 olarak da bilinir) Nkx3.2 embriyonik pankreas, mide ve bağırsak mezenşimin, hem de iskelet somitlerinden 19, 20, 21 bir alt kümesi ile ifade edilir. Bu gen, E9.5 5&#39;ten Nkx3.2 -Cre kontrolü altında gen ekspresyonunu sağlayan, E11.5 kadar E9.5 pankreatik mezenşimin ifade edildi </sup&gt; 19, 20. Bu etiketleme göre, hücreler, akış sitometrik kullanarak toplu pankreas dokusundan saflaştırılabilir. Şekil 2, burada açıklandığı gibi izole edilmiş, oluşum safhasındaki neonatal ve yetişkin pankreas dokularından tek hücreler bir akış sitometri analizini göstermektedir. Transgenik olmayan pankreas dokuları floresan hücreleri içermiyordu Oysa, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP tüm analiz yaştan pankreas dokusu ayrı bir YFP etiketli hücre popülasyonu (; kapıları ile işaretlenmiş Şekil 2) içerir. Burada tarif edilen yöntem izlenerek, floresan proteinleri ifade eden hücreler, saflaştırılmış ya da ya da fazla immün olmaksızın akış sitometrisi ile analiz olabilir. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, örneğin, floresan etiketleme göre sıralama sonra, mezenkimal hücreler, (en az beş geçişleri için) hücre hattı oluşturmak için kültürlenebilir. Not t<html> O mezenkimal hücreler tipik kültürlü hücrelerin morfolojisi fibrocytic. Buna ek olarak, bu sistem kriteri hücrelerin gen ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. Bu amaçla, RNA, cDNA sentezlemek için kriteri mezenkimal hücrelerden ekstre edildi, ve gen ekspresyon düzeyleri, QPCR kullanılarak analiz edilmiştir. Böyle bir analiz sıralı hücrelerin pan-mezenkimal işaretleyici vimentin (Şekil 3B) ifade ortaya koymuştur. Son olarak, pankreas hücrelerinin yüzey markör ifade akış sitometrisi ile analiz edilebilir. Örneğin, Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan izole edilen hücreler; R26R -YFP burada açıklanan ve fibroblastların 22 ile ifade olduğu bildirilmiştir CD9 glikoproteini hücre yüzeyi, ile boyanmış yöntemi kullanılarak yetişkin fareler. Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi, tüm Nkx3.2 -Cre hücreler floresan etiketli; R26R -YFP pankreas BS9 ifade eder. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Embriyonik ve yenidoğan pankreas dokusu. Bir E15.5 embriyo (A) ve P4 pup (B), mide, dalak, bağırsak ve pankreas da dahil olmak üzere izole bütün mide-bağırsak sistemi,. pankreas dokusu mavi çizgi ile çizilmiş olan. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> Şekil 2: Mezenkimal hücreler floresan Nkx3.2 -Cre etiketlenmiştir; R26R -YFP pankreas dokusudur. Transgenik olmayan (paneller sol) ve Nkx3.2 -Cre izole pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP çeşitli yaşlarda transgenik (sağ paneller) fareler: embriyonik (A), neonatal (B), ve reklamULT (C). Hücreler, yan dağılım (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. ( &quot;D&quot; işaretli) Kapı transjenik olmayan kontrol transjenik farelerde bir YFP + hücre popülasyonunun varlığı değil göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> Şekil 3: İzole pankreas hücrelerinin Analizleri. Nkx3.2 -Cre pankreas dokusundan kriteri (A) hücreleri; R26R -YFP (Şekil 2B&#39;de tarif edildiği gibi), neonatal farelerde hücre hattı oluşturmak için kültürlendi. (; Sağ ve sol paneller yeşil) ve faz kontrast kültürlü hücreler floresan görüntülendi (gri; sağ panel). (B) Vimentin1 (Vim1) gösteren Bar şemasıNkx3.2 -Cre pankreas dokusundan YFP + -sorted hücreler tarafından ifade seviyeleri; Sıralanmamış pankreas dokusu (siyah) ile karşılaştırıldığında, R26R -YFP yetişkin fare (yeşil Şekil 1C&#39;de tarif edildiği gibi). RNA ekstre edildi ve gen ekspresyonu qPCR ile analiz edilmiştir; ifadesi siklofiline normalize edildi. K = 4 *** p &lt;0.001. Veriler ± SD ortalamasını temsil etmektedir. (C) Nkx3.2 -Cre dağılmış pankreas hücrelerinin akış sitometri analizi; R26R -YFP yetişkin farenin bağışıklık lekeli allofikosiyanin (APC), anti-CD9 antikoru ile konjüge edilmiş ve APC (y-ekseni) ve sarı floresan (x-ekseni) için analiz edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar.

Yalıtımlı ve Akış Sitometrisi ile Pankreas mezenkim ve Hücreler Analizi

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Görüntüleme.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  Burada, mezenkimal hücrelerin izolasyonu odaklanan embriyo, neonatal ve yetişkin fare doku pankreas mikro-hücrelerin izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, pankreas gelişimi, fonksiyon ve kanser oluşumunda düzenleyen dış sinyaller aydınlatmak için hücre gen ekspresyonu ve protein salgılanmasının profil sağlar. 

Video: Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Gelişim Biyolojisi

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu myelodisplastik sendromu kökeni değerlendirmek için kullanımı

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a method whereby live-cell flow cytometry is extended upon to analyze the multiple functions of P2X7 receptor activation in real-time. Using a time module installed on a flow cytometer, live-cell functionality can be assessed and plotted over a given time period to explore the kinetics of calcium influx, transmembrane pore formation, and phagocytosis. This simple method is advantageous as all three canonical functions of the P2X7 receptor can be assessed using one machine, and the gathered data plotted over time provides information on the entire live-cell population rather than single-cell recordings often obtained using technically challenging patch-clamp methods. Calcium influx experiments use a calcium indicator dye, while P2X7 pore formation assays rely on ethidium bromide being allowed to pass through the transmembrane pore formed upon high agonist concentrations. Yellow-green (YG) latex beads are utilized to measure phagocytosis. Specific agonists and antagonists are applied to investigate the effects of P2X7 receptor activity. Individually, these methods can be modified to provide quantitative data on any number of calcium channels and purinergic and scavenger receptors. Taken together, they highlight how the use of real-time live-cell flow cytometry is a rapid, cost-effective, reproducible, and quantifiable method to investigate P2X7 receptor function.

Providing single-cell sensitivity, real-time flow cytometry is uniquely suited to quantify multimodal receptor functions of live cultures. Using adult neural progenitor cells, the P2X7 receptor function was assessed via calcium influx detected by calcium indicator dye, transmembrane pore formation by ethidium bromide uptake, and phagocytosis using fluorescent latex beads.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...