Bu çalışma NIH (R01HL128714 CF) ve (KS F31DK10236101) ve Amerikan Kalp Derneği (CF ve AG) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokolleri ve deneysel prosedürler Tıp Miami Miller School Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hazırlık <ol><li> Ön ısıtma karaciğer perfüzyon medya ve karaciğer 37 ° C&#39;de su banyosunda medyayı sindirmek. </li><li> bir perfüzyon pompası (30 ml / dak) ayarlayın. Dikkatle karaciğer perfüzyon medya ile pompanın boru sistemini önceden doldurmak. sistemdeki herhangi bir hava kabarcıklarını önlemek ve stereotaktik mikroskop hazırlar. </li><li> Üreticinin protokolüne göre kollajen tipi kullanılarak Coat hücre kültürü tabakları. </li></ol> 2. Karaciğer Kurtarma <ol><li> Oksijen / izofluran inhalasyon (izofluran% 4/2 L / dk oksijen) kullanarak donör fare anestezisi. <ol><li> % 2-2.5 izofluran düşürülmesiyle veya ketamin enjekte edilerek anestezi bakımı (100 mg / kg vücut ağırlığı intraperitonal olarak) ve ksilazin (vücut ağırlığı için 10 mg / kg intraperitoneally). Sürekli izofluran anestezi ketamin kan basıncını düşürür ve hepatotoksisite neden olabilir çünkü tercih edilir. </li></ol></li><li> emici ped üzerine anestezi fare yerleştirin. yapışkan bant ile farenin ekstremitelerde düzeltin. </li><li> Tıraş ve fare karın dezenfekte ve keskin / künt uçlu cerrahi makas kullanarak karaciğer kafatası sınırına pubis ventral laparotomi gerçekleştirin. her iki tarafa da karın duvarı, diyaframın kaudal İnsizyon. </li><li> dikkatle sağ tarafa bağırsak hareket ettirerek inferior vena kava (IVC) Açığa. Dikkatle steril pamuk uçlu çubukları ve açılı ucu forseps kullanarak IVC çevresinde yağ dokusu disseke. </li><li> suprahepatik diyafram insizyon ve keskin / sivri uçları ile ince cerrahi makas kullanılarak iki yanal kesiler ile göğüs boşluğu açın. göğüs İVC cerrahi ipek (5/0) ile Arter. </li><li> Dikkatle iğneyi çıkarın, bir korumalı iv kateter kullanarak infrarenal IVC cannulateperfüzyon pompası bağlamak ve karaciğer perfüze başlar. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, karaciğer derhal ağartma ve kabarma başlamalıdır. </li><li> ince cerrahi makas kullanılarak kan ve perfüzyon medyanın uygun drenaj izin damar portal transect. </li><li> Karaciğer perfüzyon ortamının yaklaşık 30 mL &#39;si ile karaciğer serpmek ve CD (30 mL) sindirmek karaciğer geçin. perfüzyon pompası kapatın ve perfüzyon tamamlandıktan sonra kanül kaldırın. </li><li> Yavaşça karaciğer merkez bölgesini ortaya çıkarmak ve karaciğer lobu birbirine bağlayan bağlantı doku bulun. merkezi bağlantı lifleri tut ve dikkatli bir şekilde yerinde karaciğer tutan tüm dokuları incelemek ve yavaşça karaciğer çıkarın. </li><li> Hemen ortamı sindirimi karaciğer 15 mL içeren 50 ml polipropilen konik tüpe karaciğer aktarın. NOT: Bu adım için belirli bir zaman çizgisi vardır. perfüzyon sonra, karaciğer steril bir hücre kültürü kaputu taşıma için özet medyada kalır. Tüm subsequent adımları steril bir ortamda yapılmalıdır. </li></ol> 3. Hücrelerin İzolasyonu ve Tedavi <ol><li> Bir hücre kültürü kaputu içinde, steril bir doku kültürü çanak içine 50 ml polipropilen konik tüp içeren sindirim ortamından karaciğer aktarın. </li><li> Steril forseps kullanarak, yavaşça karaciğerin dört lob gözyaşı. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, sindirim orta nedeniyle karaciğer hepatositleri izole etmek bulanık hale gelmelidir. </li><li> 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak, sindirilmemiş doku partiküllerini ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml polipropilen konik tüpe 70 mikron naylon hücre süzgecinden bulanık sindirim orta filtre. </li><li> Tekrar 3.2 ve steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3.3 yineleyin. Bu karaciğer herhangi bir kalıntı hepatositler kaldırarak yardımcı olur. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 50 x g&#39;de santrifüjleyin. 25 ml soğuk 1x hücreleri yeniden askıya hafifçe aşırı hücre artıkları içeren süpernatant aspire veWilliams &#39;Orta E. </li><li> 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak temiz bir süspansiyon elde etmek için 50 ml polipropilen konik tüpe yeni 70 um naylon hücre süzgecinden yeniden süspansiyon filtre. </li><li> Tekrarlayın 3.5 ve daha net bir hücre süspansiyonu elde etmek için soğuk Williams &#39;Orta E 1x kullanarak üç ek yıkar 3.6 adımları. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, aspirat süpernatant aşırı hücre enkaz kaldırmak için. Yeniden askıya ve 50 ml polipropilen konik tüp içine yeni bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 25 ml ılık Williams&#39;ın &#39;Medya E 1x filtre hücreleri. </li><li> hemasitometre kullanarak 25 ml hücre süspansiyonu içinde hücreleri saymak. yetişkin karaciğer başına 20 milyon hücre - ortalama 15 bekliyoruz. tripan mavisi boyama kullanarak hücre canlılığı belirleyin. </li><li> Bir kollajen kaplı 6-iyi ce birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 2 ml &#39;Williams Medya E 1x Levha hücrelerill kültür küme (kuyu başına 9 x 10 5 hücre). </li><li> 4 saat sonra, birincil hepatosit bakım takviyeleri içeren Williams&#39;ın &#39;Medya E 1x medyayı değiştirin. </li><li> 24 saat sonra, serum Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) ortamı ile 1 x 6 saat boyunca hücreleri açlıktan öldürmek. </li><li> araç, FGF23 (25 ng / ml), LPS gibi hücrelerin PBS ile tedavi (100 ug / ml) ya da serum barındırmayan ortam içinde IL-6 (50ng / ml) ve 24 saat boyunca inkübe edilir. </li></ol> RNA izolasyonu 4. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir spin kolon kiti kullanılarak RNA&#39;nın hazırlanması. </li></ol> Ters Transkripsiyon tarafından izole RNA 5. Yaratma cDNA <ol><li> PCR tüpüne izole RNA numunesinin 200 ng ekleyin. </li><li> Aşama 5.1 endonükleaz içermeyen H2O PCR tüpü 14 uL ekleyin. </li><li> Aşama 5.1 PCR tüpü ters transkriptazın 4 ul ekle. </li><li> Karışım homojen hale getirmek için yavaşça içeriğini yeniden askıya; yavaşça santrifüj. </li&gt; <li> bir termalcycler içine karışımı içeren PCR tüp yerleştirin. Çalışma ters transkripsiyon için PCR: daha sonra 25 ° C&#39;de (5 dakika), 42 ° C (30 dk) 1 döngü, 85 ° C (5 dakika) ve 4 ° C&#39;de tutun. Son ürün, arzu edilen cDNA&#39;nın olacaktır. </li></ol> 6. Kantitatif Real-time PCR ile Hücrelerin Analizi (qPCR) <ol><li> 96 oyuklu plaka hazırlanması. <ol><li> 1 uL cDNA, .25 uM ileri primer, .25 uM ters primer, 5 uL SYBR Green, 10 ul toplam hacim 3.5 uL PCR sınıf su: buz üzerinde qPCR reaksiyon tüm bileşenlerini yerleştirin. SYBR Green kullanarak, üç nüsha halinde tüm örnekleri çalıştırmak için ana karışımı hazırlayın. </li><li> master miks tamamlandıktan sonra, girdap homojen hale getirmek için. 96 Wll plakanın her oyuğuna kısım 9 uL qPCR ana karışımı. Sonra, dikkatle her kuyuya cDNA 1 mcL ekleyin. Toplam reaksiyon hacmi 10 uL olacaktır. </li><li> Yükleme tamamlandıktan sonra, optik olarak 96 kuyucuklu bir plaka sızdırmazYapışkan film ve kısa bir süre için santrifüj 96 oyuklu plaka (1 dakika için 50 x g). </li></ol></li><li> Bir Real Time PCR cihazında Run örnekler. Real Time PCR aracı haline mühürlü 96-plaka ve enstrüman üreticisi tavsiyelerine göre çalışacak örnekleri yerleştirin. Standart ve hızlı döngü örnekleri aşağıda yer almaktadır. <ol><li> 60 saniye boyunca, 15 sn için, daha sonra 120 saniye boyunca 94 ° C &#39;de, 60 ° C, 94 ° C 40 döngü, ilk denatürasyon, sonra, isteğe bağlı olarak 4 ° C&#39;de tutun: Standart bisiklet parametreleri, aşağıdaki kullanın. </li><li> Hızlı döngü için parametreler: 5 s, 15 s için 58 ° C, 10 saniye daha sonra 72 ° C&#39;de, daha sonra 30 saniye boyunca 95 ° C 40 döngü 94 ° C sıcaklıkta başlangıç ​​denatürasyon: Aşağıdaki kullanın. </li></ol></li><li> Verileri analiz konusunda rehberlik için cihaz kılavuzuna bakın. </li></ol> ELISA ile hücre üst 7. analizi NOT: Üreticinin protokolüne göre tüm adımları gerçekleştirilir. </p&gt; <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> Ayrı tüpler içine seyrelticinin 398 uL koyun. 398 uL seyreltici tüpüne hücre süpernatanı numunesi Pipet 2 uL. Bu 200 seyreltme kat sağlayacaktır. </li><li> Her bir numune için yineleyin 7.1.1 test edilecek. </li></ol></li><li> prosedür <ol><li> Pipet 100 200 kat seyreltilmiş bir numunenin uL ve 96 oyuklu bir plaka gözlerine standart. </li><li> 150 rpm&#39;de bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 45 dakika boyunca 25 ° C&#39;de 96 oyuklu plaka inkübe edin. </li><li> gözenekleri 1x yıkama tampon çözeltisi ile 5 kez yıkayın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, emici kağıt ile kalan tüm yıkama solüsyonu çıkarın. </li><li> Her kuyuya HRP konjügatı reaktif 500 ul ekle. </li><li> 7.2.3 - Tekrar 7.2.2 adımları. </li><li> tetrametilbenzidin Pipet 100 uL (TMB), 96 oyuklu plakanın her oyuğuna reajanı. </li><li> Yavaşça mikroplaka üzerinde 20 dakika boyunca 25 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka karıştırın150 rpm&#39;de sarsıcı. doğrudan her kuyuya durdurma çözeltisi 100 mcL ekleyerek reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırın. durdurma çözeltisi ilave edildikten sonra rengi sarı dönmelidir. Bu durak çözüm doğru karışık olduğunu bildirir. </li><li> bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak, ilk 5 dakika içinde 450 nm&#39;de optik yoğunluğu belirlemek. </li></ol></li><li> Sonuçların hesaplanması <ol><li> Her bir örnek, her bir standart için ortalama absorbans değerleri (450) bir tablo hesaplayın. </li><li> Ng standart konsantrasyonuna karşı her bir standart bir 450 ortalaması işaretlenmesiyle bir standart eğri birleştirin / doğrusal grafikte mi. X-ekseni konsantrasyon ve 450 değerleri temsil etmek için y eksenini temsil izin verin. </li><li> Her bir seyreltilmiş örnek 450 ortalama kullanarak, standart eğriden ng / mL, istenen protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> seyreltme facto numune konsantrasyonunu çarpınr. Bu hücre yüzer örnek istenen proteinin gerçek konsantrasyonunu belirlemek için izin verir. </li><li> Bir çizgi grafikte içine örneklerinden inşa tablo çizilir. OD 450 değerleri standart eğrinin dışında kalan, numuneler uygun şekilde seyreltilmiş edilmeli ve yeniden test edilmiştir. </li><li> 500.000 hücrelere sonuçları normalleştirmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+chronic+kidney+disease:+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease.">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li><li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease.">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li><li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy.">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li><li>Guti&#233;rrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis.">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li><li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD.">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li><li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Guti&#233;rrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation,+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults.">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease.">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li><li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver.">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li><li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interleukin-1,+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes.">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li><li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing.">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li><li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure.">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells.">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response.">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS/TLR4+signal+transduction+pathway.">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li><li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+pathway+in+the+liver:+From+physiopathology+to+therapy.">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li><li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy.">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li><li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17,+Long-Term+Culture+and+Coculture+of+Primary+Rat+and+Human+Hepatocytes.">Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes.</a> Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Farelerden alınan birincil hepatositler yalıtma inflamatuar yanıtları ex vivo çalışma için hızlı, ucuz ve güvenilir bir araçtır. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, sonuçlar kolaylıkla üretilir ve zamanında ve maliyet-etkin bir şekilde çoğaltılabilir. Aşağıdaki hususlar, dikkatli bir şekilde, başarılı bir izolasyon sağlamak amacıyla değerlendirilmelidir. Cerrahi kesi ve IVC kanülasyon genel anestezi altında ve ötenazi sonra yapılmalıdır. Genç, tecrübesiz araştırmacı fare karın anatomik özelliklerini tanımanıza ve doğru kanülasyon gerçekleştirmek için başlangıçta daha fazla zamana ihtiyaç olacaktır. Donör hayvan canlı tutulması perfüzyon ölçüde izole hücrelerin canlılığını artıracak, başlayana kadar. önemli ölçüde izole edilmiş hepatositlerin verimini artıracak beri üstü hepatik IVC ligasyonu yapılmalıdır. Seçenek olarak ise, mikro-cerrahi kelepçe IVC yerleştirilebilir.Ancak, torakotomi aşağıdaki hayvan birkaç dakika içinde ölen hale gelecektir. Bu nedenle takip eden tüm adımlar karaciğer perfüzyon başlangıcına kadar yeterli bir kan akışını muhafaza etmesini sağlamak için derhal yapılmalıdır. kanülasyon için, bir geri çekilebilir intravenöz kateter kullanımı tavsiye edilir. IVC kanüle sonra, kateter iğne dikkatlice damar perforasyon riskini en aza indirir, hangi geri çekilebilir. son kritik adım kateter perfüzyon sisteminin bağlantısıdır. kateter iğne çıkardıktan sonra, kan perfüzyon pompasına bağlamadan önce kateterin ucundan tahliye etmelidir. Bu adım, miktar önemli bir azalma olarak izole hücrelerin kalitesine neden olabilir hava emboli tehlikesi en aza indirir. perfüzyon başlatılan sonra, karaciğer hemen ve homojen bir soluk sarı kırmızıdan rengini değiştirmek gerekir. Parçalar, kalan kırmızı insuffic gösterecektirsağ- lasa perfüzyon veya hava emboli varlığı. İzole hücrelerin yıkanması ve filtreleme sürekli yapılmalıdır. Bu fazla hücre kalıntılarının randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayacaktır. Sağlıklı izole hepatositler kaplama olmanın ilk 4 saat içinde uyacaktır. Bu nedenle, kaplama ortamı, bu zaman noktasında bakım ortamına değiştirilebilir. Gece boyunca inkübasyondan sonra, hücreler belirgin bir çekirdeğe sahip olan, daha altıgen şeklinde görünür. Hepatositler da iki nükleer (Şekil 1A) olabilir. Granülasyon veya hücresel blebbing kötü izolasyonu için bir göstergedir. hepatositler sürekli doğru yapışmayan veya hücre canlılığı, düşük kalırsa, perfüzyon için kullanılan sindirim ortam miktarı değiştirilmelidir. Bu aşırı bilmek veya karaciğer dokusu underdigestion gerekir. hücrelerin daha yüksek bir verimle gerekli ise, portal ven aracılığıyla ileriye perfüzyon gerçekleştirilebilir. Klaunig ve ark. Bu tekniğin, toplam hücre verimini artırmak olduğunu göstermiştir. Alternatively, IVC aşağıdaki portal ven kanülasyon aralıklı kopça uygulanabilir. Bu periyodik izole hücrelerin toplam sayısını artırabilir sözde da perfüzyon sırasında baskıyı artacak ve. Perfüzyon süresi yanı sıra perfüzyon oranı 14 ayarlanması gerekebilir. Biz, ancak alternatif perfüzyon protokolleri uygulandı değil. Bir ilk başarılı izole edildikten sonra, (albümin gibi), bir hepatosit spesifik immün izolasyonu (Şekil 1B) saflığını sağlamak için gerçekleştirilmelidir. izolasyondan sonra 24 saat, hepatositler, serum 4 ila 8 saat boyunca aç ve tedavi için kullanılır. Akut faz tepkisinin incelenmesi, hücreler Toll-benzeri reseptör 4 ve NF-KB 15 ile inflamasyonunu indüklemek amacıyla bilinen LPS ile muamele edilebilir. IL-6 pro-enflamatuvar sitokinler, interlökin reseptörleri 16 aracılık etmektedir.Ayrıca, kısa bir süre önce FGF23 FGFR4 ve PLCγ / kalsinörin / NFAT yolunu aktive ve karaciğer 7, 17 bir iltihabi tepki doğurmaz olduğunu göstermiştir. Yeterli transkripsiyon ve hedef genlerin translasyonunu temin etmek için, hücreler, 24 saat boyunca tedavi edilmelidir. yüzen hücrelerin ELISA ile birlikte kantitatif gerçek zamanlı PCR ile mRNA ve gen ifadesinin ardışık analiz Ayırma kolayca tekrar edilebilir sağlam bilgi sağlar. Bu yeni pro-inflamatuar mediatörlerin, onun hepatik reseptörleri ve bunların ardışık aşağı sinyal mekanizmalarının soruşturma sağlar. Böyle HepG2 ve Hep3B hücreleri gibi genel kanser hücre hatları ile karşılaştırıldığında, özellikle transgenik hayvanlarda izole birincil hücreler, üstün sonuçlar verecektir. Kolaylığından dolayı, bu yaklaşım aynı zamanda yeni ilaçların etkisini araştırmak için gösterimleri için de kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık farmakolojik veya pato-physiolo okuyanjik mekanizma temel olarak bir in vivo ortamda daha fazla doğrulayıcı deneyler gerektirecektir. İzole hepatositler birkaç gün içinde dediferansiye eğilimi beri uzun vadeli çalışmalar gerçekleştirilmiştir değil. Diğer 18 tarafından bildirilen Bununla birlikte, bu özel hücre kültürü teknikleri ile aşılabilir. Bunlar, kolajen çift jel konfigürasyonu, hepatosit sferoidler, endotel hücreleri ile birlikte-kültür ve 3T3-J2 fibroblastlar ile micropatterned eş kültürleri içerir. Birlikte ele alındığında, birincil fare yetişkin hepatositlerin izolasyon metabolomik, inflamasyon, bağışıklık ve ilaç ve toksinlere karaciğer tepki ilgilenen bilim adamları için sağlam bir araç sağlar. Bu basit fizibilite, orta maliyetleri ve hızlı tekrarlanabilirlik ile karakterizedir.

Kronik böbrek hastalığı (CKD), akut ve kronik iltihap 1 bir durum olarak tanımlanabilir. KBH olan hastalarda, phosphaturic hormon fibroblast büyüme faktörü 23 (FGF23) serum düzeyleri giderek serum fosfat homeostazisini 2 korumak için yükselir. Artmış serum FGF23 düzeyleri bağımsız hemodiyaliz tedavisi 3, 4 başlıyor hastalarda kardiyovasküler morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Bundan başka, pek çok klinik çalışmalar, yüksek FGF23 seviyeleri ve C-reaktif protein (CRP), Interlökin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü a (TNFa), 5, 6 serum seviyeleri arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Ayrıca, deneysel bir çalışmada, son zamanlarda FGF23 doğrudan hepatositler hedef ve artan CRP ve IL-6 p bir inflamatuar yanıta neden olduğunu göstermiştirkaraciğer 7 roduction. Bu nedenle, FGF23 CKD sistemik inflamasyona katkıda bulunan dolaşan bir faktör olarak hareket olabilir. 70 yılların başında, birincil hepatositler izole edildi ve ilk kez 8 okudu. O zamandan beri primer kulturlenmiş hepatik hücreler yoğun, 10 metabolik işlem, hormonal fonksiyon, ilaç metabolizması ve toksisitesinin yanı sıra bağışıklık yanıtlarını ve enflamatuar yanıtları 9 incelemek için kullanılmıştır. Önceki protokoller esas insan karaciğer dokusunda 11, 12 birincil hepatositlerin enzimatik izolasyonuna tarif etmişlerdir. mükemmel bir model olsa da, bu karmaşık karaciğer sinyal mekanizmalarını yanı sıra uyaranların farklı türde üzerine fonksiyonel sonuçlarını nasıl etkilediğini genetik manipülasyon çalışma olanağı dışarıda bırakır. Aşağıda, fare primer hepatositlerinde izolasyonunu tarif. Özellikle, böyle bir lipopolisakarit (LPS), IL-6 ve FGF23 hepatik akut faz tepkisinin birçok aracıların, etkisi, kolay, hızlı ve yeniden üretilebilir bir şekilde 13 analiz edilebilir. Burada, erişkin farelerden hepatositlerin enzimatik izolasyonu için protokol mevcut, ve LPS ve IL-6, hem de böyle bir FGF23 gibi yeni enflamasyon ile ilgili aracıların enflamasyon kurulan indükleyicileri, doğrudan ifadesini ve ifrazatını uyardığını göstermektedir bu tür kültürlenmiş hepatositlerde CRP ve IL-6 gibi enflamatuar sitokinleri,.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Consumables</td>
			<td style="width:283px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Strainer 70 &#956;m Nylon cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 6-inch Cotton Tipped Applicators&#160;</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>SP115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minipuls 3 Perfusion Pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer Kits, Propper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48300-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissers - Sharp/Blunt</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Iris Scissors-ToughCut Straight</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Dumont SS-45 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11203-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Student Tissue Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>991121-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid solution, 2.0 N</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; A8976-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>&#160;&#160; 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 50989-161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine 100 mg/mL</td>
			<td>AnaSed Injection</td>
			<td>139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Willams&#39; Medium E (1x)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liver Perfusion Medium (1x)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>17701-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liver Digest Medium (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17703034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>CM4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-717</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of an inflammatory response in primary hepatocyte cultures from mice

Karaciğer sistemik inflamasyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Özellikle kronik böbrek hastalığı, karaciğer Üremik ortamda, oksidatif stres, endotoksemi ve akut faz reaktanları çok sayıda üreterek proinflamatuar sitokinler dolaşımdaki azalmış temizlenmesi cevaben tepki verir. inflamasyon ve hepatositlerin yatan rolü deneysel araçları incelemek için kronik böbrek hastalığı gibi özellikle karmaşık bir ortamda düzenlenmesi ve karaciğer sitokinlerin katkısı sistemik akut faz yanıtı ve uzun bir pro-enflamatuar senaryo, anlamak için çok önemlidir. In vivo enflamasyon karmaşık mekanizmalar okuyan zorlu kaldığından, kaynak-yoğun genellikle ve transgenik hayvanların kullanımını gerektirir, birincil izole hepatositler hepatik akut faz yanıtı içine mekanistik anlayışlar kazanmak için sağlam bir araç sağlar. Bu in vitro tekniği ılımlı maliyetleri özellikleri olduğundan, yüksek yenidenüretilebilirlik ve ortak teknik bilgi, birincil izole hepatositler de kolayca bir tarama yaklaşımı olarak kullanılabilir. Burada, birincil fare hepatositleri izole etmek için bir enzimatik temelli bir yöntem tarif ve biz ELISA ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak bu hücrelerin bir inflamatuar yanıtın değerlendirilmesi açıklar.

histoloji Birincil izole edilen ve kültürlenen hücrelerin Örnek ışık mikroskobu görüntüleri Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. İmünositokimyasal analizi izole hepatositler yüksek albümini (kırmızı) hem de fibroblast büyüme faktörü reseptörü 4 (FGFR4) (yeşil) eksprese olduğunu göstermektedir. Çekirdekler 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanır. (Şekil 1B). Kantitatif gerçek zamanlı PCR Birincil İzole hepatositler FGF23 ile işlemden geçirildi (25 ng / ml) LPS veya IL-6, 24 saat ve CRP ve IL-6 mRNA düzeyleri (50 ng / ml) kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir (ug / ml 100 ug) . FGF23, LPS ve IL-6 CRP ve IL-6 ekspresyonunu artırmıştır. (Şekil 2A) İzole edilen primer hepatosit gelen hücre kültürü yüzerler CRP seviyeleri için ELISA ile analiz edilmiştir. PBS ile tedavi edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında bizim kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi, LPS ile paralel olarak, IL-6 hem de FGF23 tedaviler önemli hücre süpernatanları CRP seviyeleri yükselmiştir. (Şekil 2B) <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55319/55319fig1.jpg" /> Şekil 1: izole edilmiş fare primer hepatositlerinde (A) faz kontrast mikroskop görüntüsü. 24 saat sonra kaplama, hücreler, bir altıgen benzeri bir şekle sergiler ve genellikle iki çekirdekli görünür. (= 100 mikron Ölçek çubuğu); (B) İmmünoflöresan mikroskopik analiz izole hücrelerin çoğunluğu albumin (kırmızı), bir hepatosit özel işaretleyici ifade olduğunu ortaya koymaktadır. Hücreler de son derece FGFR4 (yeşil) ifade eder. DAPI çekirdekleri boyar. Orijinal büyütme 40X. (Ölçek çubuğu = 50 um). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55319/55319fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55319/55319fig2.jpg" /> Şekil 2: İzole Fare birincil hepatositler kantitatif real-time PCR Analizi CRP ve IL-6 İfade belirleme. PBS ile tedavi edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında (A) LPS, IL-6 ve FGF23 tedavileri CRP mRNA düzeyi artar. (Değerler ± SEM kat değişiklik olarak ifade edilmiştir; p &lt;0.01, n = 3 bağımsız izolasyonlar). PBS tedavilerine kıyasla LPS ile işlemden geçirildi (B) hücreler, IL-6 veya FGF23 aynı zamanda IL-6 mRNA düzeylerinde önemli bir artış göstermektedir. (değerler ± SEM kat değişiklik olarak ifade edilmiştir; p &lt;0.001, n = 3 bağımsız izolasyon) CRP protein seviyeleri (C) nicellendirmesindeenzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) izole edilmiş fare primer hepatositlerinde elde edilen süpernatanlar. PBS tedavi ile karşılaştırıldığında, LPS, IL-6 ve CRP FGF23 protein seviyeleri yükselir. Değerler 500.000 hücre başına mg / dl CRP konsantrasyonları temsil etmektedir. (P &lt;0.05, n = 3 bağımsız izolasyonlar). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55319/55319fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice at JoVE.com

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine.  Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar. 

Video: Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Felç ve görsel sistem yaralanma tarafından Nöromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 T hücreleri belirli farelerde indüksiyon

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...