Biz tripanozom biyoloji genel tavsiye için George Haçı kabul etmek istiyorum. Bu çalışma aynı zamanda DS, MRM bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (DGE-1.325.261) ve FNP bir NIH / NIAID (hibe # AI085973) Bir Bill ve Melinda Gates Vakfı GCE hibe ile desteklenmiştir. Biz-SCEI geni ve tanıma bölgesi içeren gerginlik kullanımı için Galadriel Hovel-Miner teşekkür ederim.

NOT: süreci boyunca, o buz üzerinde hücreleri tutmak için gereklidir. Soğuk ortam ayrıca boyunca kullanılmalıdır. 1. Numune Hasat <ol><li> 1.000.000 / ml - 0.5 bir yoğunluğa Lister 427 suşu kan dolaşımı tripanozomlann büyütün. Bu parazit az sayıda kültürleri başlamak en iyisidir. 1.500 x g&#39;de 10 dakika boyunca 50 x 10 6 hücre / örnek aşağı doğru döndürün. Daha sonra pozitif ve negatif antikor denetimlerini kullanın için kültüründe 1 x 10 6 hücre bırakın emin olun. NOT: Bu protokol ayrıca, hayvan kanı (detaylar için tartışmaya bakınız) izole tripanozomlann kullanılabilir. </li><li> Pipet veya yüzer maddenin en dökün (yaklaşık 750 ul bırakın). 1.5 ml mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarın. </li><li> bir mikrosantrifüj içinde 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de hücreler Spin ve supernatant çıkarın. </li></ol> 2. Manyetik Etiketleme <ol><li> Tekrar süspansiyon hücreleri 150 ul kültür ortamında (HMI-9 wiUygun seyreltme örneğin inci serumu) + primer anti-VSG antikoru. Not: Anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1:50 seyreltmede kullanılmıştır. Bir florofor ile işaretlenmiş bir birincil anti-VSG antikor kullanılması önemlidir. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada 8 - hız 6 bir girdap adaptör 60 kullanılarak vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ile yıkayın. </li><li> 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de spin ve süpernatant aspire. serum ile 1 ml HMI-9 ile yıkayın ve yukarıdaki gibi döndürün. süpernatant aspire. serumu HMI-9, 100 ul içinde süspanse pelet. </li><li> (MSC) mikroboncuklar ayırma Manyetik aktive hücre 110 ul ekle. birincil anti-VSG antikor uygun olarak, anti-fare anti-tavşan veya anti-biyotin boncuk kullanın. İyice karıştırın. 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. </li><li> Hücreler vorteks olsa da, bir ayırma mıknatıs üzerinde bir manyetik aktive ayırma kolonu / örnek oluşturdu. Bir yeniden var emin olunsütununda ceptacle (biz bir 15 ml santrifüj tüpü kullanın) flow-through toplamak için. Soğuk bir odada aparatı ayarlayın. </li><li> Başbakan sütuna serum ile HMI-9 2 ml ekleyin. akış her bir örnek toplamak için sütunu altında bir 15 ml santrifüj tüp yeri emişli sonra. </li><li> Adım 2.4 10 dakika inkübasyondan sonra, 800-1000 civarında ul soğuk HMI-9 serumu ile ekleyin. 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de dönel çıkartıldı ve süpernatan bağlanmamış antikorların çıkarılması için. Serum ve tekrar süpernatant 100 ul bırakarak ile HMI-9 1 ml yıkayın. </li><li> şiddetle ve görsel santrifüj tüpü Flick pelet tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için tüp inceleyin. Hücreler de yeniden süspanse emin olmak için yukarı ve aşağı serum ve pipet ile HMI-9 1 ml ekleyin. </li></ol> 3. Manyetik Ayırma <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi sütunlar hazırlanmış olduğundan emin olun. sütun hücreler uygulanır. Hücreler baskın olmayan VS ifade ile flow-through toplayınsütun üzerinden akmaya 7 dakika - G. 1 orta ml + tripanozomlar genellikle 6 alır. </li><li> Yıkama 1 ml HMI-9 serum ile 2x ve adım 3.1 olarak akış yoluyla aynı tüp içinde toplamak. </li><li> Bölme akış (3 mi), iki 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine. Not: Bu, daha sonra bir araya getirilebilir ya da yarı vb RNA izole etmek için de kullanılabilir </li><li> mıknatıstan sütun çıkarın. sütununa serum ile HMI-9 3 ml ilave edilir ve başlangıç ​​baskın VSG ifade eden hücreleri elde etmek için bir 15 ml santrifüj tüpüne sütun dalma. daha sonra analiz için akıtılan malzemenin 300 ul çıkarın. buz üzerinde bu hücreleri tutun. </li><li> pozitif ve bir negatif kontrol olarak kullanılmak üzere, 37 ° C &#39;de büyümekte, kontrol hücrelerinin başlangıç ​​kültüründen yaklaşık 1.000.000 hücre sunar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine bunları pipet (bu sıklıkla geçiş beklenmemektedir). Not: pozitif kontrol hücreleri adım 4.1 fluoroforla işaretlenmiş antikor ile boyanmış olacaktır. Negatif kontrol hücreleri remaProtokolün geri kalanı boyunca lekesiz olarak. </li><li> Sıkma akış örnekler ve 5,200 x g&#39;de, 4 dakika boyunca 4 ° C &#39;de pozitif antikor kontrol örneği ve supernatant çıkarın. Not: elüt hücrelerinin diğer 300 ul alikosu, anti-VSG boyama için pozitif kontrol olarak kullanılabilir. </li></ol> 4. Boyama Bulaşanlar ve switcherlar Belirlemek İçin <ol><li> Süspanse akış örnekler ve 100 ul HMI-9, uygun seyreltide Serum primer, fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG antikoru ile pozitif kontrol hücreleri. Not: etiketli anti-VSG antikoru evde yapılan ve 1 seyreltme ile kullanılır: 1000. fluoroforla işaretlenmiş anti-VSG step.There adım 3.5 aşağıdaki iki mikrosantrifüj tüpleri içinde akış numune 3 mi olmalıdır MACS ayırma etiketlenmemiş antikor olarak aynı kaynaktan olabilir. </li><li> yeniden sus ise iki mikrosantrifüj tüpler pelet birleştirmek, akım sitometri-through akımı ile tüm analiz etmek100 ul HMI-9 serum + anti-VSG antikoru ile örnekleri bekleyen. İyice karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de soğuk bir odada Vorteks hücreleri. 1.000 ul soğuk HMI-9 serum ile - 800 ekleyin. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de ve çıkarma bağlanmamış antikorların çıkarılması için. </li><li> serumu HMI-9 için 1 ml hücre yıkayın. 4 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj örnekleri süpernatan 5,200 xg&#39;de çıkarın. Bu son dönüş sırasında, adım 3.4 ve negatif kontrol örneğinden yıkandı-örnekleri aşağı doğru döndürün. </li><li> 148.5 ul HMI-9 serumu, 25 ul mutlak sayım boncuk ve 1.5 ul Propidium iyodür solüsyonu (175 ul toplam) boyama: Tüm akış ve elüt örnekleri yeniden süspanse edin. 175 ul pozitif ve negatif antikor kontrol örnekleri tekrar süspansiyon HMI-9 serumu ile. Mutlak sayım boncuk / kullanılan özel lot için 25 ul sayısını kaydetmek için emin olun. </li><li> bir akış sitometresinde aracılığıyla tüm örnekleri çalıştırmak ve veri toplamak. PI olarak leke ölü hücreler <sup&gt; +. Kirletici maddeler PI olarak leke - VSG +. VSG - - Seçiciler PI olarak leke 8. </li><li> veri flow sitometri kullanılarak anahtarlama frekansları hesaplayın. NOT: anahtarlama frekansları nasıl hesaplanacağı ile ilgili talimatlar için, ek dosyasına başvurun <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Sitometrisi Calculations.docx</a> ve Tablo 1&#39;de. </li></ol>

<ol>
	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Deneysel tekniği ile ilgili olarak, protokolün en önemli bileşeni soğuk tüm örnekleri tutuyor. Tripanozomlarına çok hızlı yüzeyleri 9 bağlanan antikor içselleştirmeye ancak bu işlem motilite bağlıdır ve hücreler, 4 ° C &#39;de tutulur sürece tahlil etkilemez. Tüm numuneler daima buz üzerinde tutulmalıdır ve pipet 25 ° C laboratuar ortamında maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Soğuk HMI-9 serum ile deneyin başlangıcında mevcut olmalıdır ve boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. sütun üzerinden 1 ml örneği çalıştırmak için 7 dakika - bu 5 alır gibi sütun üzerinde çalıştırarak tripanozomlann izolasyonu, soğuk bir odada yapılmalıdır. Mevcut manyetik ayırma birimleri daha fazla örnek varsa aktif ayrılır olmayan örnekleri, buz üzerinde tutulur gibi manyetik izolasyon sürece, sırayla yapılabilir. Örnekler, çok iyi karışmış af olması da önemlidirmıknatıs üzerinde mikro-ve önceki izolasyonu ile inkübasyon aşağıdaki son yıkama ter. Bu santrifüj tüpüne veya hafif vorteks agresif titreşmesinde yapılabilir. hücrelerin yok pelet veya kümeleri önce ışık mikroskobu düzeyinde bakarak kontrol edilebilir ayırma kolonuna numunenin, eklenmesi görünür olmalıdır. kümeleri varsa, baskın VSG ifade eden hücrelerin akış örnekteki kirlenme düzeyi genellikle arzu çok daha yüksektir. protokol sonunda numunede switcherlar sayısı hesaplama yaparken, tüm flow-through akım sitometri analizi için kullanılıp kullanılmadığı dikkate almak önemlidir, ya da yarım kullanılıp kullanılmadığı. sadece yarısı kullanıldı, hesaplanan anahtarlama sayısı 2 ile çarpılmalıdır. Yıkama adımları sırasında süpernatant çıkarırken, her son damlasına kapalı pipetle için gerekli değildir ve tipik olarak 15-25 ul vardırHücrelerin pelet çevreleyen bıraktı. Orada çok az olan hücreleri açık olduğundan, bu noktada peletler nadir akış örneklerde görülmektedir, bu, boyama ve yıkama işleminin nihai safhalarında, özellikle önemlidir. Nihai önleyici VSG leke tipik olarak saflaştırılmış, florofor-etiketli anti-VSG antikoru ile birlikte, önceden manyetik izolasyon birinci anti VSG leke saflaştırılmış antikor veya serum ile yapılabilir. Ayrıca, anti-VSG antikorları eksprese eden hibridomlar elde biyoreaktör süpernatant kullandık. Ne olursa olsun, başlangıç ​​lekesi için kullanılan malzeme yapmak veya baskın başlangıç ​​VSG eksprese etmeyen hücre iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için titre edilmelidir. Baskın VSG ifade eden hücreler ile kirlenmiş akış-through hücre nüfus için tipiktir. Bu kirlenme düzeyde olmalıdır iken nüfus ifade eden hücrelerin tamamen yoksun olabilmesi için, bizim deneyim o nadirbaskın VSG ing. Izolasyon prosedürü ile gitti hücreler prosedür aracılığıyla olmamıştır o kadar anti-VSG antikoru gibi parlak leke yok dikkat etmek de önemlidir. Biz iki şey bu farkın hesabını ihtimalini varsaydığımızda. İlk tripanozomlarına eğirme VSG dökülme yol açar, ve izolasyon prosedürü dahil olan birçok spin vardır. Bu son anti-VSG leke sinyalin şiddetini azaltmak için beklenir. İkinci protokol, ilk aşaması, bir birincil anti-VSG antikorla boyama içermesidir. bu birinci aşamada kullanılan, antikor tarafından tanınan epitopları ile aynıdır ya da son leke antikor tarafından tanınan epitopları tıkanması durumunda, tek bir sinyal yoğunluğu yalnızca bir antikor kullanılması durumunda daha düşük olması beklenir. nedenle pozitif boyalı hücreye sinyal kabaca iki öyle ki son aşamada kullanılan antikor, titre önemlidirBir olumsuz lekeli hücre için daha yüksek büyüklükte emir. Bu şekilde, bir pozitif şekilde lekeleme yapan hücre sinyalinin şiddeti izolasyon prosedürü geçiren hücrelerde azalmış bile, bu olumlu hücreler hala akış sitometri arsa üzerinde olumsuz hücrelerden ayrılır. otomatik dengeleme kullanılıyorsa, tek bir leke kontrol örnekleri hazırlanmalıdır. Biz yarattı Antikorlar Memorial Sloan Kanser Center monocolonal antikor tesisinden satın alınabilir. Biz etiketsiz monoklonal antikor IgG kullanarak en iyi başarı elde ettiler. Biz poliklonal VSG antikorları ile protokol gerçekleştirdiklerini, ancak poliklonal antikorlar bazen o kadar monoklonal antikorlar tercih edilmektedir diğer VSGs tanıyabilir. VSG kimliği VSG 3&#39;UTR ve eklenmiş lider korunmuş dizilerinin amplifikasyonu elde edilen dizi VSG cDNA tarafından belirlenebilir. Belirli bir antikor, daha önce açık izole ilgili özgüllük bakımından test edilebilirSadece açıklandığı gibi VSG kimliğini hücreleri tespit edilmiştir. Burada sunulan protokol bir takım avantajlara sahiptir. Daha sonra analiz için anahtarlayıcıları izole etmek ve belirli bir popülasyonda anahtarlama sayısını ölçmek için de kullanılabilir. Aynı zamanda, uzun bir antikor bu varyant için uygun olduğu gibi, ilgi konusu özel bir varyantını izole etmek için kullanılabilir. Kırmızı kan hücreleri, üreticinin protokolüne uygun olarak, anti-Ter119 kaplı manyetik boncuklar kullanılarak giderilmiştir koşuluyla, aynı zamanda hayvanların izole tripanozomlarına kullanarak bu protokol gerçekleştirmek mümkündür. Biz gerekli tripanozomlann sayısının alt sınırı test değil, ama biz başarıyla 2.5 kullanarak protokol gerçekleştirdiklerini - kan 250 ul gelen 10 milyon tripanozomlann. Son olarak, iletişim kuralı, belirli bir popülasyonda anahtarlama frekansı elde etmek için dalgalanma analizi ile bağlantılı olarak kullanılabilir. izolasyon prosedürü oldukça fAST, 3 alarak - baştan 4 saat numune sayısına bağlı olarak tamamlamak ve böylece ilaç direnci markerleri içeren fareler veya özel soylarının önceden bağışıklığın gerek önceki yöntemlere göre daha verimli olduğu için. yöntem, başlangıç ​​VSG karşı oluşan antikorlar, ancak gerekli olması ile sınırlıdır. Bu tür reaktif olmadan, böyle VSG-seq olarak alternatif bir yöntem VSGs belirli bir nüfus 10 olarak ifade edildiği ölçmek için daha uygun bir seçim olabilir.

Protozoon parazit, Trypanosoma brucei, Sahra-altı Afrika boyunca (Trypanosoma brucei brucei aracılığıyla) ve hayvanlar (Trypanosoma brucei gambience ve Trypanosoma brucei rhodesiense aracılığıyla) insanları etkileyen bir hastalık etkenidir. Bu çeçe sineği vektörünün tükürük yoluyla memeli konakçıda iletilir. İnsan ve Hayvan Afrika tripanosomyası Hem endemik bölgelerde ciddi bir ekonomik yük getiren ve birkaç ilaç mevcuttur ya da iki hastalığın tedavisi için geliştirilmektedir. Bağışıklık kaçırma mekanizmalarının anlaşılması trypanosomiasis için ilaçların geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Parazit kapsayan yoğun Variant Yüzey Glikoprotein (VSG) kat antijenik varyasyon birincil aracı biri olan T. brucei, memeli antikor tepkisini kaçınır. ~ 15 Expres VSG geninin yaklaşık olarak 2.000 varyantları tripanosom genomuna vardır, ama sadece bir birinden belirli bir zamanda transkripsiyonusion siteleri. Ifade VSG &#39;geçiş&#39; aktif ifadesi sitesine bir VSG genini kopyalayarak, veya (1 gözden) daha önce sessiz ifade sitenin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla gerçekleşebilir. Çok iş T. anlamak antijenik varyasyon ayrılmış olmasına rağmen brucei, anahtarlama frekansı etkileyen faktörler hala tam olarak anlaşılamamıştır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar anahtarlama in vitro davranışsal oluşurken, anahtarlama frekansları yaklaşık 10 6 hücre 2 içinde 1 mertebesinde, çok düşük olduğu gerçeği ile engellenmiştir. Bu anahtarlama ilk etapta tespit etmek zor olduğundan, belirli bir faktör artar veya anahtarlama frekansını azaltır olmadığını ölçmek zor hale getirir. 2009 öncesinde, belirli bir nüfusta anahtarlayıcıları izole etmek için yöntemler uzun ve emek yoğun. Bunlar arasında baskın VSG karşı aşılanmış farelerde ile tripanozomlarına pasaj ve daha sonra hücreler toplandıBir gün sonra 3 veya immünofloresan 4,5 ile hücrelerin yüzlerce sayma. Ilaç direnci anahtarlayıcıları 6 izole etmek için başka bir strateji seçimi dayanmaktadır. In vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomlar tipik bir büyük varyant ve alternatif varyantları ifade switcherlar çok daha küçük bir nüfusa ifade büyük bir nüfus oluşuyor, çünkü biz baskın, başlangıç VSG olarak bu yazıda boyunca büyük varyantı bakın. Bunu yaparken, biz hiçbir şekilde bu önemli varyant popülasyonda diğer varyantları daha fazla uygunluk olduğunu ima etmek istiyoruz. 4 saat - Burada güvenilir 3 belirli bir nüfusta bir dominant olmayan VSG ifade tripanozomlann sayısını ölçebilen bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir belirli bir genetik manipülasyon ya da ilaç tedavisi popülasyonda açık hücrelerin sayısını artırır olmadığını belirlemek istediğinde için özellikle yararlıdır. Bunun yerine do ifade hücrelerinin nüfusu riddingminant ilaç ile VSG başlayan ya da immünolojik vasıtasıyla, bu hücreler önce, bir manyetik sütun üzerinde izole hâkim VSG karşı antikora bağlanmış manyetik boncuk ile kaplanması ve ortadan kaldırılmıştır. anahtarlamalı nüfus daha sonra akış yoluyla toplanan ve kirletici tanımlamak için bir fluorofor etiketli anti-VSG antikoru ile tekrar lekeli. Niceleme hücrelere tanelerin oranı belirlenir ve nüfus 7 anahtarlama sayısını ölçmek için kullanılabilir, böylece her bir örnek için, mutlak sayaç boncuk belirli sayıda ekleyerek elde edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">unlabeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fluorophore labeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HMI-9 media</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">HMI-9 is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:143px;">BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CountBright absolute counting beads</td>
			<td style="width:143px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LD columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnet</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnetic separator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">vortex adapter-60</td>
			<td style="width:143px;">ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM10014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:143px;">Coulter</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">flow cytometer analysis software</td>
			<td style="width:143px;">FloJo</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Burada anlatılan yöntemi nüfusu 8 switcherlar sayısını artırdı VSG ifade site içinde bu çift iplikli tatili göstermek için kullanılmıştır. Burada, aynı ifade yerinde bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan olan tripanozomlann bir nüfusa temsilcisi sonuçlarını gösterir. Biz bir çift iplikli bir mola oluşturmak için uyarılan edilmemiş olması olanlara bu tripanozomlann karşılaştırın. 1 akış-geçen manyetik aktive hücre sıralama kolondan toplanan un-uyarılmış ve isteyerek hücrelerden araziler sitometri temsili akışını göstermektedir. Bu özel deney için baskın başlangıç ​​VSG VSG2 oldu. Şekil 1A sol panelleri ileri göstermek ve giriş kapıları, canlı hücrelerin karakteristik bir ileri ve yan dağılım imza göstermek mutlak sayım boncuk ve hücrelerin etrafında çizilmiş sağlar yan dağılım. Not kapıları olabilir kiölü hücreler PI boyama ile elimine edilebilir, çünkü daha fazla hücre içerecek şekilde çizilebilir; Bununla birlikte, kapak, tüm numuneler için aynı tutulmalıdır. Şekil 1A sağ panelleri sol panellerde &#39;Canlı&#39; kapısı giren sadece bu hücreleri göstermektedir. PI (Q1 ve Q2) için pozitif leke Hücreler ölü hücrelerdir. 3. çeyrekte PI pozitif baskın VSG ve olumsuz leke Hücreler kirletici vardır. hem PI ve Q4 baskın VSG için olumsuz leke Hücreler açtınız canlı hücrelerdir. Bir Q3 kirleticilerin yüzde çift iplikli sonu kaynaklı olmuştur bu hücreler için daha düşük olduğunu gözlemleyebiliriz. Ancak, Q3 yüzdeler belirli bir nüfusta daha fazla switcherlar olup olmadığını anlaması için kullanılamaz. Sadece tek bir anahtarlama frekansı hesaplayabilir toplanan tanelerin sayısı Q4 hücrelerin sayısının oranı ile karşılaştırmaktır. Tablo 1 flo elde numaralarını gösterirw sitometri araziler ve yöntem bu popülasyonlarda yüzde anahtarlayıcıları hesaplamak için. Bu hesaplamalar Şekil 1B görüntülenen gözlenen sviçleme frekansları elde etmek için 3 biyolojik örnekler üzerinde yapıldı. Dominant olmayan VSG açtınız 6 x 10 -3 hücrelerinde - 1 bir kırılma sonuçlarını indükleyici ederken, 9.53 x 10 -5 ortalama burada hesaplanan in vitro stokastik geçiş seviyesi oldukça düşüktür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> Şekil 1. İzolasyon ve Anahtarlamalı Trypanosome Populasyonlarının miktarının belirlenmesi. (A), bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif kolonu üzerinde olmayan anahtarlama seçimi şu akış fraksiyonunda tripanozomlarına fraksiyonlarını gösteren akış sitometri bulunmaktadır. indüklenmiş bir I-SceI çift iplikli kesmeli bir hücre popülasyonu indüklenmiş bir bre olmayan hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığındaak. (B) ya da I-SCEI çift sarmallı bir mola ile uyarılan edilmemiş hücreler için anahtarlama frekanslarını hesaplanmıştır. arsa üzerinde sayı iki kuyruklu, eşsiz T testinin sonuçlarını temsil eder. Hata çubukları SD temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Company Dosya 1. Akım Sitometri Hesaplamalar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> Tablo Anahtarlama Frekansları 1. hesaplanması. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K Görüntüleme.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Video: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

Telomer G-çıkıntı Yapısı incelenmesi Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

İki-fluorochrome tarafından yedi bağışıklık hücre alt kümeleri ayrımcılık Akış Sitometresi

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...