This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. Membran Sac Hazırlama ve Fiksasyon <ol><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 ile etiketlenmiş zar levhaları hazırlanması <ol><li> DNA plazmid kodlayan iRFP-PAmCherry1-PH PLC, standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak 23 δ1 hazırlayın. </li><li> Kültür INS-1 # 1.5 ile hücreler 18 mm yuvarlak lamelleri standart INS-1 hücre kültürü protokolleri 38,39, aşağıdaki% 50-70 konflüansa 30 | ig / ml fibronektin ile önceden kaplanmış. 50 ila 70% konfluansa ulaştığında sonra hücreler bir gün transfekte. </li><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC ile transfekt hücreleri, üretici protokollerine göre lipozom transfeksiyon ayıracı kullanılarak δ1. Transfeksiyondan sonra, hücreler 48 saat için büyümeye olanak sağlar. </li><li> Deney gününde, ~ 0.5 ile kat lamelleri (tek tarafında) - 500 ug / mL poli-D-lizin, 1 ml, 1-2 saat süre ile (PDL dH 2 O seyreltilmiş). Sonra bir kağıt mendil koyarak PDL tahliyelamel kenarı. daha sonra kullanılmak üzere bir önceden soğutulmuş (4 ° C) metal levha üzerine lamelleri yerleştirin. </li><li> 1 mM EGTA ihtiva eden 1 ml buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) -, 0,5 lamelleri artan ön-transfekte edilen INS-1 hücreleri yıkayın. yıkandıkları üç kez tekrarlayın ve PBS boşaltın. </li><li> cımbız ile önceden soğutulmuş metal levha üzerine PDL kaplı lamelleri kültüre hücreleri (hücre tarafı aşağı bakacak şekilde) ile lamelleri yerleştirin. Hücreler PDL kaplı lamelleri (Şekil 2) takmak için izin 10 dakika - 7 buzdolabında (4 ° C) plaka bırakın. Not: kuluçka süresi 7 aralığında olmalıdır - PDL kaplı yüzeye hücrelerin daha bağlanması için 10 dakika. buzdolabı ortamı kuru ve inkübasyon çok uzun olmamalıdır. </li><li> buzdolabından metal plaka çıkarın. Yavaşça cımbız kullanarak ön-transfekte hücreleri içeren lamel soyulabilir. Bu hücre zarı tabakanın ince bir tabaka oluştururlamel PDL kaplı. Yavaşça ~ 0.5 membran yaprak yıkama - 1 mi buz gibi soğuk PBS ve sonra ~ 0,5 tamir - 1 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) + 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 glutaraldehid (GA). Dikkat: formaldehit ve glütaraldehit zehirlidir. cilt ve göz koruması ile bir davlumbaz onları idare. </li><li> Tespit edildikten sonra, resim zar levhaları hemen (bölüm 3) ya da ~ 0.5 depolamak - 4 ° C&#39;de 1 ml PBS. Not: Membran tabaka çözdükten sonra sitoplazmada PI (4,5) P2 PH probları bağlama herhangi bir denge olacaktır. bağlı PH sondaları kademeli olarak membran tabakasından ayırmak ve (o hafta gün sürebilir rağmen) çözeltisi içine yayılır. Bu nedenle, doğru numune hazırlandıktan sonra görüntüye sabit örnekleri tavsiye edilir. </li></ol></li><li> PI (4,5) P2 özel antikor etiketleme için membran sayfaları hazırlamak <ol><li> Kültür INS-1 # 1.5 ile ilgili hücreler, 30 &#39;ile önceden kaplanmış 18 mm yuvarlak lamelleri# 181; g / ml fibronektin 50 ila% -70% izdiham. Aşama 1.1.3 tarif edildiği gibi DNA ile transfekt hücre Ertesi gün plazmit. </li><li> Yukarıda açıklandığı gibi 1.1.7 için 1.1.4 den adımları tekrarlayın. NOT: 4 ° C&#39;de aşağıdaki prosedürleri uygulayın. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk PBS, 50 mM NH4CI ihtiva eden - ~ 0.5 olan sabit PM levhaları üç kez ihtiva lamelleri yıkayın. ~ 0.5 olan yaprak söndürün - 7 dakika boyunca PBS içinde 1 ml% 0.1 sodyum borohidrid ve yıkayın ~ 0,5-1 ml PBS (50 mM NH4CI olmadan). </li><li> Bloke etme çözeltisi, 1 ml, 45 dakika (% 5 (hacim / hacim) normal keçi serumu,% 5 (h / h) sığır serum albümini ve 50 mM NH4CI ihtiva eden PBS çözeltisi) -, 0,5 örnekleri bloke. 1 saat için çözüm engelleme: (300 seyreltme 1) 1 ml primer PI 2 antikoru (4,5) P - Sonra, ~ 0.5 ile kuluçkaya yatmaktadır. 1 ml PBS, 50 mM NH4CI ihtiva eden - ~ 0.5 ile üç kez (10 dakika, her zaman) yıkayın. </li><li> 1 mi sekonder F (ab &#39;) 2 keçi anti-fare - ~ 0.5 olan örnekleri inkübe1 saat süre ile blokaj tamponu: florofor (300 1) ile konjuge antikor. 1 ml PBS - ~ 0.5 ile üç kere yıkanır. </li><li> post-düzeltme örnekleri% 4 PFA +% 0.2, GA, 15 dakika boyunca, daha sonra, PBS (7 dakika, her zaman) olan numuneler, üç kez yıkayın. Görüntüleme için, Bölüm 3 geçin veya daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C ± 0.5 ~ 1 ml PBS içinde depolar. Not: 4 ° C&#39;de numune hazırlayın. PM fosfoinositidlerde fizyolojik dağılımını korumak için% 4 PFA +% 0.2 GA fiksatif kullanın. Yalnız% 4 PFA ile RT hazırlanması veya tespit önemli eserler (Şekil 4) neden olabilir. </li></ol></li></ol> MEOS3.1-PH PLC δ1 ile Canlı hücre Görüntüleme için 2. Hücre Kültürü Hazırlanması <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 23 mEOS3.1-PH PLC δ1 kodlayan DNA plazmid hazırlayın. </li><li> # 1,5 18 mm Kültür INS-1 hücreleri yuvarlak lamelleri 30 mg / ml fibronektin onlar ulaşana kadar% 50 -70% confl ile önceden kaplanmışStandart INS-1 hücre kültürü protokolleri 38,39 aşağıdaki uency. </li><li> Ertesi gün, DNA, plazmid üreticinin protokolü takip lipozom transfeksiyon ayıracı kullanılarak δ1 mEOS3.1-PH PLC INS-1 hücreleri transfekte. görüntüleme önce 48 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Membran Sheets ve Canlı Hücre 3. PALM Image Acquisition <ol><li> Membran levhalar PALM görüntü elde etme NOT: Burada, bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskop tabanlı SMLM sistemi (100X yağı, APO, NA = 1.49, WD 0.12 mm) 23 tüm görüntü elde etmek için kullanılır. <ol><li> Görüntüleme önce, 10 ml PBS + 50 mM MgCl2 floresan boncuk çözeltisi 1 ul seyreltilir. 10 dakika boyunca (adımlarda 1.1.8 / 1.2.6 itibaren) görüntüleme odası içeren hücre örneklerinin içine çözüm seyreltilmiş 200 ul ekleyin. Daha sonra, PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> PALM görüntüleme sistemi başlatın. ilişkili görüntüleme yazılımı olarak, &amp; &quot;iRFP kanalını seçin# 34; düğmesi (642 nm lazer uyarma, 700/75 nm emisyon). iRFP kanal pH probları eksprese eden hücre membranı Bul. NOT: Membran levha yakın bir floresan boncuk olmalıdır. Bu, daha sonra kayma düzeltme için gereklidir. </li><li> Gelecekteki görüntü rekonstrüksiyon için bir referans olarak iRFP kanalında hücre zarının geleneksel TIRF görüntü toplamak için &quot;Yakalama&quot; düğmesini kullanın. Görüntüleme ayarı TIRF açısı 2140 yazarak normal TIRF açısı (yani, kritik açı ulaştıktan sonra, başka bir 1.5 derece dönüş) ayarlayın. Aksi belirtilmediği sürece tüm adımlar için ayarı bu açıyı kullanın. NOT: Burada anlatılan TIRF sisteminde, 3,500 2,200 TIRF kritik açı ve 2140 TIRF kritik açı sonra 1.5 derece daha normal TIRF açısı olduğunu, yukarı dikey açısıdır. 3.2.3 aşağıda belirtilen dar TIRF açısı TIRF kritik açı ulaştıktan sonra başka bir 2 derece olan 2120 olduğunu. </li><li> th tıklayarak PAmCherry1 kanalına geçine RFP kanal düğmesi (561 nm uyarma, 600/50 nm emisyon filtresi). Arka plan membran floresan ağartmak için 10-20 saniye boyunca 561 nm lazer tam güç aydınlatmaya sahip sağa &quot;AOTF&quot; pad tüm yol kaydırma çubuğunu ayarlayın. </li><li> &quot;Format&quot; sekmesine ve &quot;ND dizisi edinme&quot; sekmesinde hızlı alım protokolünde optimum kamera ayarı (2x2 binning) Set (tipik olarak 20 Hz 10,000-40,000 görüntü). </li><li> &quot;Şimdi Çalıştır&quot; butonuna tıklayarak - düşük seviyede (% 1% 0.1) de eş zamanlı 405 nm lazer aktivasyonu ile PAmCherry1 görüntüleri (tam güçte 561 nm lazer, 50 milisaniye / çerçeve) edinimini başlatın. Her karede o uzamsal izole bireysel noktaları kolayca tanımlanabilir böylece 405 nm lazer yoğunluğunu ayarlayın. NOT: aktive edilebilir PAmCherry1 moleküllerinin sayısının alımı sırasında yavaş yavaş azalır. 405 nm lazer yoğunluğu tedricen her ayrı molekül sinyallerinin uygun yoğunluğunu tutmak için artırılmalıdırçerçeve. </li><li> Hiçbir PAmCherry1 tek molekül sinyali devreye kadar görüntü almak devam edin. </li></ol></li><li> canlı hücrelerde PALM görüntüleme <ol><li> Aşama 3.1.1 tarif edildiği gibi görüntüleme önce, 10 dakika süre ile görüntüleme odasına flüoresan boncuklar seyreltin. Sonra ilişkili görüntüleme yazılımı açarak PALM görüntüleme başlayın. NOT: canlı hücre görüntüleme için manyetik hızlı çıkarma görüntüleme odası kullanın. 135 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.6 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 3 mM glukoz ve 20 mM: hücre dışı tamponu (hücre-dışı çözelti sürekli perfüzyon altında bir ısı kontrol 35 ° C&#39;de görüntüleme alanının merkezine sahip HEPES, pH = 7.3). </li><li> GFP kanal düğmesine (525/50 nm emisyon) seçin. 488 nm lazer uyarma altında mEOS3 yeşil floresan dayalı flüoresan millerini ifade hücre zarı tanımlayın. Yakın zamanda bu şekilde görüntüleme sırasında yer almaktadır floresan boncuk çevrimdışı Sondaj için daha sonra gerekli olduğundan emin olunft düzeltme. </li><li> Bir referans görüntü olarak mEOS3 (yeşil) kanal hücre zarının bir TIRF görüntü toplamak için &quot;Yakalama&quot; butonuna tıklayın. canlı hücre görüntüleme ayarı TIRF açısı 2120 yazarak (kritik açı ulaştıktan sonra, başka bir 2 derece dönüş) sığ kaybolan dalga uyarma aydınlatma kullanın. Not: Bu, plazma zarına sitosol bitişik bağlanmamış mEos3-PH floresan en aza indirir. </li><li> &quot;RFP kanalı&quot; düğmesi (561 nm uyarma, 600/50 nm emisyon) geçin. (3.1.4 bakınız) &quot;AOTF pad&quot; in kaydırma çubuğu ile 10 ~ 20 saniye boyunca membran yaprak arka plan floresan beyazlatmak tam güç 561 nm lazer kullanın. </li><li> eşzamanlı 405 nm lazer aktivasyonu ile ( &quot;kamera&quot; sekme ayar 10 milisaniye / karede set 561 nm tam güç) kırmızı kanalda &quot;Şimdi Çalıştır&quot; butonuna tıklayarak görüntü alımı başlatabilirsiniz. mekansal ayrılmış noktaları aktive etmek için 405 nm lazer yoğunluğunu ayarlayınher çerçeve içinde. NOT: molekül sayısı yavaş yavaş azalır mEOS3.1-PH PLC un dönüştürülmüş δ1 edinme ilerledikçe olarak. Yavaş yavaş tek bir molekülün sinyalini optimize etmek için 405 nm lazer gücünü artırmak. Görüntüleme edinme uzunluğu deneysel amacına bağlıdır. Normal koşullar altında, 5 dakika boyunca sürekli olarak görüntüler elde. Daha uzun bir satın alma gerekiyorsa, bunun yerine tek bir büyük görüntü yığının birden fazla görüntü yığınları toplamak. Her görüntü yığını dosya boyutu 4 GB geçmemelidir veya daha sonra yazılım analizi etkileyecektir. </li></ol></li></ol> 4. SMLM Görüntü İşleme ve Yeniden <ol><li> Bir görüntü analizi istasyonuna görüntü dosyaları (.tif görüntü yığınları) aktarın. Daha sonra &quot;yeni bir dosya&quot; &quot;açık&quot;, daha önce 37 açıklandığı gibi Matlab görüntü oluşturma programı (özel yazılmış) başlatın ve ana menüde &quot;Dosya&quot; sekmesini tıklayarak Görüntü yığını yükleyin. </li><li> Belirlemek ve locaher çerçeve tek tek moleküler olayları lize. &quot;Dalgacık&quot; bir eşik sayısı (1-10) ile yoğunluk eşik filtreleme ayarlayın. görsel yeniden önce nokta tespiti için en uygun parametre ayarlarını doğrulayın. Ardından &quot;PALM&quot; sekmesine gidin ve görüntü yeniden başlatmak için &quot;bir adım süreci&quot; tıklayın. NOT: nokta tespiti için Yoğunluk eşiği keyfi ve kişisel deneyime bağlıdır. Birkaç çalışmalar ne çok sayıda niteliksiz (dim) puan alır ne de çok sayıda nitelikli (parlak) noktaları filtreler olduğunu optimal algılama eşiğini üretmek için gerekli olabilir. veri analizi optimize etmek için diğer parametreleri ayarlayın. Burada, mahalle mesafesi (kombine bir mesafede komşu karelerde floresan puan) 65 nm (1/2 piksel genişlik) olarak ayarlanmış ve tek bir molekül takılmıştır. Gap çerçeveleri (kombine ve tek bir molekül olayı olarak monte edilen bu çerçeveleri ve mahalle mesafesinde meydana gelen bireysel molekül olaylar) &#39;dirPAmCherry1 görüntüleme 40 26 kare (1.3 sn) olarak ayarlayın. SMLM içinde 40 sayım aşırı önlemek için tek bir molekül prob ve alma hızı özelliklerine göre bu parametreyi ayarlayın. rekonstrüksiyon sırasında floresan boncuklar ile sürüklenme düzeltme uygulayın. <ol><li> IRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 etiketli sabit membran yaprak görüntüleme için tek bir süper çözünürlüklü görüntüye 37 içine aynı membran levhadan tüm görüntü yığınlarını yeniden. </li><li> MEOS3.1-PH PLC δ1 etiketli canlı hücre örnekleri, 1000 kare birkaç küçük yığınlarının içine bütün görüntü yığını ayrı 1.000-ardışık kare yığını bir zamansal çözünürlüğe sahip tek bir süper çözünürlüklü görüntü olarak yeniden böylece 10 sn. Sonunda, nihai zaman serisi yığınına 23 içine tüm zaman serisi görüntüleri birleştirir. NOT: canlı hücre PALM görüntülemede, aktif prob az sayıda taşıma veya ayırmak olabilirağartma önce PM PI (4,5) P 2. prob oversampling hesaba katmak için, görüntü analizi sırasında tek bir emisyon olay haline (yerine 65 nm) 130 nm içinde komşu çerçeveler bireysel molekül sinyallerini birleştirir. </li></ol></li><li> Yeniden görüntüler elde ettikten sonra, çift-korelasyon 41 ile molekül yoğunluğu, mikro etki yoğunluğu / boyutunu ve küme analizi ölçmek için Matlab özel olarak yazılmış bir program ile daha fazla görüntü analizi yürütmek. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

membran levha üretimi ve örnek tespit: Sorun giderme için, iki işlem ekstra dikkat gerekir. protokolde tarif edildiği gibi aşama 1.1.6 lamelleri inkübasyon süresi membran levha üretimi için önemlidir. Bizim deneysel koşullar altında optimum inkübasyon süresi 7-10 dakika (Şekil 2). 10 dakika inkübasyon daha uzun veya daha az PDL kaplı lamelleri üzerinde hiçbir zar yaprak yol açacaktır yerine PDL lamelleri ve kısa inkübasyon üzerine membran levhalar sağlam hücreler üretecek. Protokolde tarif edildiği gibi, tespit sırasında fiksatif ve sıcaklık PM PI (4,5) P2 dağılımının muhafaza edilmesi için çok önemlidir. Oda sıcaklığında Fiksasyon ya da tek başına% 4 -PFA kullanımı PM normal lipit dağılımını bozar olabilir. Lipid araştırma membran PALM mikroskopi uygulayarak, biz (4,5) P2, m aracılık önemli bir fosfoinositid PI nanometre ölçekli dağılımını gözlemlemek mümkünherhangi bir temel hücre etkinliklerini. INS-1 hücrelerinde sınırlı konsantrasyon geçişlerini PI (4,5) P 2 Bu mekansal dağılımı, lipid-protein etkileşimleri ve PI bu hücrelerde (4,5) P2 yerel sinyal olaylarını yeniden düşünmek için bir çerçeve sunmaktadır. Ayrıca, bu işin geliştirilen yöntemler, biyolojik süreçlerde Fosfoinosititler çalışma yeni araçlarla sağlar ve böylece, uygun problar diğer zar fosfolipid araştırma uygulanabilir. Deterjan tedavi ve sitoplazmada potansiyel sinyal kirliliği: Bu çalışmada membran tabakaların kullanılması fosfolipid morfolojik çalışmalarda iki önemli endişeleri atlar. Deterjanlar genellikle kümeleme ve PM fosfolipid sinyali anlamlı kaybına neden olurlar. Sitozolik sinyalin kirlenme gibi PI (3,4,5) P3 ve PI (3,4) P2 olarak PM 23 düşük bolluk fosfoinositidlerde durumunda özellikle sorunludur. Membran tabaka numuneleri Circu edebiliyoruzönemli ölçüde kortikal aktin ağ ve klatrin kaplı çukurlar 42,43 plazma membranı ile bağlantılı yapılar, bozmadan bu sorunları mvent. PM PI (4,5) P2 göreceli homojen dağılım fibroblast zarında 44 GST-PH PLC δ1 problar kullanılarak diğer şoklama EM çalışmaları ile iyi bir anlaşma olduğunu. Yanlış örnek işleme koşulları yanıltıcı sonuçlar üretebilir dikkat etmek önemlidir. İlk olarak, daha düşük bir sıcaklıkta (4 ° C) &#39;de tespit adımları ve membran levha üretimi için sabitleyici GA kullanımı için çok önemlidir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, GA olmayan sıcak sıcaklık ve PFC sabitleme hücre PM Fosfoinosititler düzeltmek için yeterli değildir. Bu sağlam PI (4,5) P2 dağılımını bozar ve fizyolojik koşullar altında, canlı hücrelerde gözlenen olmayan keskin kümeleri oluşturabilir. İkinci olarak, PAmCherry1 olarak kullanımıSMLM probu, yerine başka problar daha nicel PALM görüntüleme için çok önemlidir. PAmCherry1 uygulamasının yararı parlaklık, yüksek foto-aktivasyon verimliliği ve en önemlisi, çok sınırlı fotoğraf yanıp sönen olarak iyi karakterize tek bir moleküler fotoğraf fiziksel özellikleri 35,40,45, geliyor. Bu özellikler foto-yanıp sönen potansiyel küme eserler ortadan kaldırmak ve kantitatif membran PI (4,5) P2 moleküler yoğunluğunu analiz etmemizi sağlar. Bu yaklaşım aynı zamanda sınırlamaları vardır. Hücre görüntüleme önce bozulur, çünkü Birincisi, bu çalışmada kullanılan membran levha yöntemi tamamen PI (4,5) P2 fizyolojik dağılımını taklit olmayabilir. Ancak, bizim canlı PALM görüntüleme membran levha örnekleri ile gözlemlenen sonuçları destekleyen, PI (4,5) P2 benzer görece homojen dağılımını göstermektedir. Daha önceki çalışmalarında 23 tartışıldığı gibi İkincisi, SMLM görüntüleme uzmanlık ve ekstra olarak gerektirirTENTION kullanılan sondalar, örnek hazırlama ve fiksasyon, görüntü örnekleme ve yeniden yapılanma gibi farklı süreçler, doğabilecek görüntüleme eserler önlemek için. PH alanı göre sondalar ve antikorlar yaygın fosfoinositid çalışmalarında 46,47 kullanılmıştır da Son olarak, zarda tüm PI (4,5) P2, bu yaklaşım ile tespit etmek mümkündür kalır. Örneğin, diğer endojen proteinlerin bağlı PI (4,5) P2 PH prob veya antikorlar için erişilebilir olmayabilir ve bu durum kendilerini prob uzay engel için PI (4,5) P2 bir küçümsenmesi neden olabilir. Etiketleme PI (4,5) P2 alternatif bir yol orijinal kuyruk bir değişiklik ile En Fluor PI (4,5) P2 48, bir ön-etiketli PI (4,5) P2 analog kullanarak olurdu PI (4,5) P2. onun inositol halka endogenou aynı olduğundan Ancak, hızlı canlı hücre metabolizması diğer fosfoinositid alt tiplere hızla dönüştürülebilirs PI (4,5) P2. Bu canlı hücrelerde bu ön-etiketli PI (4,5) P2 analog sadakatle PI (4,5) P 2 ziyade metabolik ürünlerini temsil edip endişe uyandırmaktadır. Bu nedenle, bazı sınırlamalara rağmen, PH alanı tabanlı sondalar yaygın hücrelerin PM PI (4,5) P2 dağıtım ve dinamiklerini izlemek için kullanılan en iyi prob arasında devam etmektedir. Bu metodolojinin gelecekteki uygulama böyle PI (3,4,5) P3 ve PI (3,4) P2 gibi diğer fosfoinositid çalışmaları, kadar uzatılabilir. Özetle, burada kullanılan yeni SMLM yaklaşımı hücrelerinde fosfoinositid incelemek için yeni yollar açar. Örneğin, PI (4,5), p, 2 kullanarak, özel hücre membran moleküllerinin morfolojik ve nicel çalışma PALM görüntüleme özelliklerinin yanı sıra sakıncaları göstermektedir. Bu yaklaşım çıkarlarının diğer moleküllere adapte edilebilir ve hücre biyolojisi geniş bir uygulama olacaktır.

Fosfoinosititler toplam membran lipidlerine küçük bir kısmı katkıda hücresel süreçlerin çeşitli kritik roller oynar. Onlar 3 rd inositol halkaların geri dönüşümlü fosforilasyon veya defosforilasyonundan türetilen yedi üye, 4 th ve 5. pozisyonları 1 bulunmaktadır. Fosfatidilinositol 4-fosfat (PI4P) ve fosfatidilinositol 4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) hücre plazma zarı (PM) 2,3 belirleyici lipidler gibi nispeten bağımsız işlev iki büyük fosfoinositidler vardır. Fosfatidilinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) daha az bol PI4P ve PI (4,5) P2 daha, ancak kanser 4 ve diyabet 5 dahil olmak üzere farklı hücresel süreçleri benzersiz işlevleri vardır. Bu lipidler kendi etkileyiciler ve birçok diğer proteinler ile kompleks moleküler etkileşimler vardır. Nedenle, bu pho mekansal organizasyonunu anlamak için çok önemlidirnanometre ölçeğinde PM sphoinositides. Montaj kanıtlar sınırlı PM alanlarında protein kompleksleri veya molekül kümeleri noktaları 6 sinyal olarak hizmet verebilir göstermiştir. Örneğin, sintaksin 1a, membran füzyon 7-9 düzenleyen önemli bir protein PM küme organizasyonunu gösterir. sintaksin 1a küme organizasyonunun uzlaşma görünümünden ayrı, PM fosfoinositidlerde mekansal dağılımı tartışmalıdır. PI (4,5) P2 dağılımları kullanılan kümeleri 14-18, hücre türlerine bağlı olarak ve deneysel yöntemler yoğun üzere, üniforma 10-12, büyük yamalar 13,14 arasında değişmektedir. Yüksek çözünürlükte PI (4,5) P2 mekansal organizasyonu da tutarsızdır. Uyarılmış emisyon-tükenmesi ile bir çalışma (STED) mikroskopi 19 yoğun PI (4,5) P2 nano kümeleri çok sayıda ortaya koymuştur (~ çapı 73 nm) PC-12 hücrelerinde 20 PM levhalar </s&gt; Yukarı. Bu sonuç, hızlı dondurma elektron mikroskobu (EM) 21,22, kimyasal sabitleme çok daha iyi, canlı hücrelerin sağlam PM yapısını koruyan bir yaklaşım kullanarak çalışmalardan farklıdır. İkinci PI (4,5) P2 belirgin havuzu gösterdi; Nispeten konsantre PI (4,5) kaveolanın ve kaplamalı çukurlara P 2 yanı sıra düz PM bölgeye homojen dağılımı. Ayrıca, membran yaprak nano PI (4,5) P2 organizasyon, canlı ve sabit hücrelerde farklılık gösterebilir. Bizim son çalışma tek-molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM) 23 kullanılarak hem sabit hem de canlı INS-1 hücrelerinde bu sorunu araştırdık. SMLM bağımsız flüoroforlar, yüksek hassasiyet ile lokalize edilebilir ve böylece stokastik herhangi bir zamanda florofor yalnızca küçük bir bölümünde devreye dayanır. Birçok süper çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımları, geleneksel ışık mikroskobu kırınım limitini aşmak için benzer ilkeleri kullanarak geliştirilmiştir böyle birs fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) 24, floresan fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (FPALM) 25, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (Fırtına) 26,27 ve doğrudan STORM (dSTORM) 28. Foto-değiştirilebilir veya ışıkla fluorophores (boyalar veya floresan proteinleri) ile, SMLM teknikleri canlı hücreler 31,32 video-oranı ile nanometre çözünürlükte 24,29,30 de görüntü biyolojik yapıları bilim adamları sağlar. Örnek olarak PI (4,5) P 2 kullanarak, ÖS fosfoinositidlerde ve nano ölçekli dağılımını incelemek için SMLM bir yaklaşım getirdi. Özellikle PI bağlanan PLCδ1 (fosfolipaz C δ1) PH alanı (4,5) P2 PM görüntüleme PI (4,5) P2 alt hücresel dağılımı ve dinamikleri 33,34 için köklü bir sonda olduğu . Biz genetik olarak iki floresan proteinleri, PAmCherry1 35 ve iRFP 36 Bu etki alanını etiketledi </sup&gt; çift renkli füzyon proteininin (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) üretilmesi için (Şekil 1A-B). PAmCherry1 PALM PH alanının fotoaktıfleştırılebılır prob olarak hizmet vermekte ve iRFP PALM satın önce transfekte edilmiş hücrelerin belirlenmesi için genel bir göstergesi olarak hizmet veren . Biz sabit zar tabaka halinde SMLM görüntüleme için bu iki renkli floresan prob geçerlidir. Canlı PALM görüntüleme için, onun daha iyi foton verimliliği ve parlaklık (Şekil 1C-D) mEOS3.1-PH PLCδ1 probu oluşturmak için PH PLCδ1 etki mEOS3 37 yerine PAmCherry1 etiketledi. Insülin salgılayan INS-1 hücreleri 38 PM bu yeni problarla SMLM görüntüleme PI (4,5) ayarlanmıştır bölgelerin çoğunda P2 hem de konsantre PI (4,5) P2 homojen etiketleme ortaya çıkardı seyrek düz PM ve bazı filopodia benzeri yapıların 23 intermixed olan mikro bölgeler. Sonra birPI (4,5) P 2 noScale dağılımı o canlı hücrelerin nasıl işlediğini yeniden düşünmek için bir yapısal temel sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Bizim süper çözünürlük sisteminin yerelleştirme belirsizlik (σ) 14.73 nm 23 olduğunu. TIRF ve PALM görüntüler arasında doğrudan karşılaştırmalar uzaysal çözünürlüğü önemli bir gelişme gösterdi. Şekil 3A-B PI (4,5) P2 antikoru ve iRFP-PAmCherry1-PH PLC ile etiketlenmiş temsili PI (4,5) P2 TIRF görüntüleri gösterir tipik membran yaprak ve canlı hücrelerde δ1. Membran levhalar konvansiyonel TIRF mikroskopi ile görüntüleri gelişmiş yeşil floresan protein etiketli sağlam canlı hücrelerde olanlara oldukça benzer olan (EGFP) (Şekil 3C) (EGFP-PH PLCδ1) PH etki etiketledi. Tüm numuneler problar eşit dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Bunun aksine, numunelerin optimum olmayan sabitleme keskin yoğun PI (4,5) P2 kümeleri ve sinyal yoğunluğundaki bir azalma (Şekil 4) ile sonuçlanmıştır. optimum sabitleme koşulları altında, tO PI sabit hücrelerde (4,5) P2 (Şekil 5) süper çözünürlüklü görüntüler sadece sınırlı konsantrasyon geçişlerini ile PM önemli bir kısmında prob homojen dağılımını ortaya koydu. PI (4,5) P2 prob ile zenginleştirilmiş bazı zar yamalar seyrek dağıtılan ve çeşitli boyutlarda vardı. Canlı hücre PALM görüntüleri (Şekil 6) sabit hücreler olarak benzer bir mekansal dağılımını gösterir. Geniş alanlarda bolluk önemli değişiklikler olmadan PI (4,5) P yerel alanlarda hızlı dinamikleri zaman sonuçları üzerinden 2 sinyal ayrıntılı analizi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Bu çalışmada kullanılan floresan probları Şekil 1. Şema. Sabit membran tabaka deneylerinde kullanılan (AB) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 prob. Geleneksel TIRF görüntüleme (A), 640 mil boyunca<html> Lazer iRFP heyecanlandırmak için kullanılır (Örn: 692 nm; Em: 713 nm). Bu durumda alınan TIRF görüntü PALM görüntüleme (B) ile elde edilen süper çözünürlüklü görüntüleme için bir TIRF referans görüntü olarak hizmet vermektedir. A 405 nm lazer için kullanılan PAmCherry1 fluorofor foto-etkinleştirmek ve bir 561 nm lazer PAmCherry1 heyecanlandırmak için kullanılır (Ex: 564 nm; Em: 595 nm) PALM görüntüleme için. (CD) canlı hücre deneylerinde kullanılan mEos3.1-PH PLCδ1 sonda. Geleneksel TIRF görüntüleme sırasında (C), bir 488 nm lazer mEOS3.1 (:;: 519 nm Em 506 nm Ex) heyecanlandırmak için kullanılır. (: 573 nm; Em: Ex 584 nm) 405 nm lazer ile Fotoçevrim sonra (D), mEos3.1 kırmızı forma dönüşür. PALM satın almalar için kullanılır ve bir 561 nm lazer <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> s / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; INS-1 hücreleri membran levha hazırlanması için Şekil 2. Şema (A). Bir PDL kaplı lamel üzerine aşağı bakacak şekilde kültürlenmiş hücreler ile lamel yerleştirin ve PDL- hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere, 4 ° C &#39;de 7 ~ 10 dakika bekleyin kaplanmış lamel. (B) cımbız ile üst lamel soyun ve PDL önceden kaplanmış lamel bağlı membran sayfasını düzeltmek. (C) Görüntü TIRFM ve PALM ile numune. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> Şekil 3. PI (4,5) P2 mekansal organizasyon geleneksel TIRF mikroskop altında membran çarşaf ve sağlam canlı hücreler arasındaki benzer. (A)zar levhaları tipik TIRF görüntüsü% 4 PFA ve% 0.2 GA ile 4 ° C &#39;de sabit. PI (4,5) P2 PI (4,5) P2 spesifik antikor ile etiketlenmiştir. (B) iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 ifade INS-1 hücreden bir zar tabaka. Farklı seviyelerde EGFP-PH PLCδ1 ifade iki tam canlı hücre (C) TIRF görüntüsü. Ölçek çubukları: (A): 3 um; (B) ve (C):. 5 mikron <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> Şekil 4. PI zar levhaları 2 mekansal organizasyon ortak sabitleme koşulları duyarlıdır (4,5), s. (A) zar levhaları tek% 4 PFA ile 37 ° C &#39;de sabit bir(Şekil 3A&#39;da gibi) PI (4,5) P2, belirli bir antikor ile işaretlenmişlerdir. (B) Membran levha yalnız PFA oda sıcaklığında sabit ve PI (4,5) P2 spesifik antikor ile etiketlenmiş. PI yoğun kümeleri (4,5) P2 probları Şekil 3A&#39;da gösterilen daha da floresans görüntüleri aksine, TIRF mikroskop altında açıkça görülebilir olduğuna dikkat edin. Ölçek çubukları: AB:. 3 mikron <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> PI Şekil 5. PALM görüntüleme (4,5) P 2 sondaları INS-1 hücre PM kendi nanometre ölçekli dağılımını ortaya koymaktadır. (A) iRFP-PAmCherry1-PH ifade INS-1 hücreden bir zar tabakasının iRFP TIRF görüntü PLCPAmCherry1 sinyali yeniden dayalı aynı bölgede PM PALM görüntüsünü İlgili δ1. (B). Homojen PI (4,5) P majör PM bölgeler ve çeşitli PI (4,5) P2 mikro bölgeler 2 mekansal dağılımı unutmayın. (C) (b) &#39;de kutulu bölgesinin büyütülmüş bir görünüşüdür. Oklar seyrek PI (4,5) P2 sondaları ile zenginleştirilmiş PM mikro bölgesini dağıtılan göstermektedir. Ölçek çubukları: A ve B: 3 um; C: 500 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> Canlı INS-1 hücreleri Şekil 6. PALM görüntüleme (A). MEos3.1-PH PLC eksprese eden bir canlı INS-1 hücre PI (4,5) P2 ve TIRF resmiδ1. Görüntü hızla PALM edinme (35 ° C) daha önce yeşil kanal satın alındı. (B) 10 sn aralıklarla Sıralı canlı hücre PALM görüntüler. Insets yerel PI (4,5) P2 (B) farklı zamanlarda aynı düz çizgi 1 pozisyon boyunca yoğunluk ve (C) yoğunluk profillerini göstermektedir. 10 saniye içinde onların büyük yerel yoğunluk değişiklikleri unutmayın. (D) PI ortalama yoğunluğu değişikliklerin zaman seyri (4,5), (B) &#39;de geniş bir alana (box2, 3x3 mm) ve küçük daire (3, 4 ve 5, 500 nm çapında) içinde p 2 5 içinde PALM görüntüleme dak (kare / sn 10). Yerel PI (4,5) P2 sondaları hızlı yoğunluk dalgalanmaları Not (daire 3, 4 ve 5) geniş bir alana (kutu 2) çok küçük değişikliklere göre. Belirtilen zamanlarda (B) &#39;de box2 bölgesinde (E) Genişletilmiş palmiye ve görüntüler. Oklar p altında PI (4,5) P2 zenginleştirilmiş membran yamaları gösterirhysiological koşullar. Ölçek çubukları: C: 3 um; E: 500 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif . 

Video: Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Biyokimya

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...