We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).

Tüm hayvan çalışmaları kabul Rutgers-RWJMS IACUC yöntemlere uygun olarak yapıldı. 1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> . Tablo 1 gereğince stok ve tampon çözümleri hazırlayın Tablo 2&#39;deki gibi çalışan çözümleri hazırlayın. </li></ol> 2. Kültür ve F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım <ol><li> Çözülme Dondurulmuş Hücreler <ol><li> Tablo 2&#39;de ayrıntılı olarak F9 NADİR-LacZ hücre kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Ceket 10 cm kültür tabaklarında% 0.2 jelatin 10 ml (işlemden hücre kültürü), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (Tablo 2 ye bakınız). damıtılmış su 10 ml iki durulama ile aşırı jelatin yıkayınız. Hemen kurutma jelatinin önlemek için şişeye F9 nadir LacZ hücre kültür ortamının 9 ilave edin. </li><li> 3 dakika - 2 için bir 37 ° C su banyosu içinde, F9 nadir LacZ hücre 14 bir şişe çözülme. Kaplanmış bulaşık C içine plakası hücreleri (6 ila 10 x yaklaşık 1 hücre / ml)kültür ortamının 9 ml içeren gruptur. 37 ° C &#39;de kültür,% 5 CO2. Ertesi gün orta değiştirin. </li></ol></li><li> F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım <ol><li> 1:10 oranında - 3 gün, her 2 düzenli geçit koruyun. Not: Hücreler bu onların farklılaşma neden olacaktır olarak confluency içine büyümesine izin vermeyin. </li><li> % 80-90 bir confluency kültürleri Böl. Ortamı çıkarın ve 1X fosfat tamponlu tuz, 10 ml (PBS) hücreleri yıkamak. 5 dakika boyunca inkübe PBS çıkarın ve tripsin 1 ml. kültür ortamı, pipet 9 ml yukarı ve aşağı ve split hücreler 01:10 geçişi için ekle. </li></ol></li><li> F9 NADİR-LacZ Hücreleri Dondurucu <ol><li> Adım 2.2.2 detaylı olarak% 90 izdiham - 80 F9 NADİR-LacZ hücreleri içeren bir 10 cm&#39;lik çanak Trypsinize. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de 15 ml santrifüj borusu ve bir dönüş ayrışmış hücreleri aktarın. </li><li> F9 NADİR-LacZ f 10 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet çıkarınorta reezing (bakınız Tablo 2). Kısım dondurma kaplara etiketli cryovials ve transfer şişelere 1 mi. Ertesi gün, sıvı azot tanklarına -80 ° C dondurucu O / N ve transfer şişelere kap dondurma yerleştirin. </li></ol></li></ol> E8.5 Embriyolar 3. Diseksiyon <ol><li> Çiftleşme Cage Set-up ve Tak Kontrol <ol><li> Set-up bir çiftleşme çifti içeren bir çiftleşme kafesi. Ertesi gün sabah, vajinal fiş olup olmadığını denetlemek ve bir fiş günde 0.5 23 olarak bulunmuştur gün belirleyin. günlük E8.5, hasat embriyolar. </li></ol></li><li> Embriyoların Diseksiyon <ol><li> Servikal dislokasyon ile baraj Kurban ve% 70 etanol ile karın bölgesi sprey (bakınız Tablo 2). cerrahi makas kullanarak karın üstündeki cilde kesilmiş bir çapraz yapın ve karın bölgesi ortaya çıkarmak için ayrı (anterior ve posterior) iki flep çekin. Benzer bir kesim olunperiton üzerinde karın ortaya çıkarmak. </li><li> Uterus bulun ve fallop tüplerinin gelen uterus bırakın ve makas 23 bir çift kullanarak mesometrium. PBS aşırı yağ ve kan yıkamak için 1x 10 ml 6 cm çanak (tedavi olmayan hücre kültüründe) olarak uterus yerleştirin. PBS 1x taze 10 ml içeren başka 6 cm çanak aktarın. </li><li> cerrahi makas kullanarak keserek bir embriyo içeren bir rahim ayrı. rahim ve desidua çıkarın ve hiçbir iki çift kullanarak embriyo içeren yumurta sarısı kesesi bırakın. 5 forseps 23. </li><li> embriyo yumurta sarısı kese Ayrı ve genotip için kullanılmak üzere, genomik DNA izolasyonu için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne sarısı kese aktarın. tripsin 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine bütün embriyoyu transfer geniş çaplı bir ucu ile bir P20 pipet kullanın. buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> Tüm embriyolar disseke edilene kadar 3.2.4 - Tekrar 3.2.3 adımları. </li></ol></li><li> embriyo Ayrılma<ol><li> 5 dakika enzimatik ayrışma kolaylaştırmak için 37 ° C&#39;de tripsin embriyolar içeren 1.5 ml tüpler inkübe edin. <ol><li> Öğütün yavaşça embriyo mekanik ayrışması için bir P20 pipet kullanılarak ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ hücrelerinden biri üzerinde iyi bir ayrışmış embriyolu tam 10 ul hacmi plaka (F9 nadir LacZ hücreleri kaplama adımını 5.1 96 çukurlu bir tablanın bir çukuru). Kültür O / N 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Laminektomi, Diseksiyon Yetişkin Lomber Spinal Kord ve Neurosphere Kültür <ol><li> laminektomi <ol><li> servikal dislokasyon ile bir yetişkin (P60) fare Kurban. </li><li> % 70 etanol ile dorsal yüzü sprey ve cerrahi makas kullanarak enine kesim yapmak. sırt ve omurga sütununu maruz ayrı hem kanatlara (anterior ve posterior) çekin. </li><li> cerrahi makas kullanarak, omurga kapsayan kasları keserek.kaburga altında, omuriliğin bel bölgesini bulun. makas kullanarak, derin bir kesik omuriliği ortaya çıkarmak için bu noktada omurga koparmaya olun. </li><li> Hiçbir ile omurganın bel bölgesini yukarı çekin. 5 forseps omurilik maruz kalan enine kesitinin deneyci bakacak şekilde. ince makas ipuçlarını kullanarak, maruz sonu 03:00 ve 09:00 pozisyonunda omur ve kas snip. forseps ile kesilmiş vertebra dorsal kapağını tutun. Lomber spinal kord uzunluğu maruz kadar kaudal bu kesim devam ediyor. </li><li> hayır kullanarak omurlar arasından omurilik bırakın. 5 yanı sıra künt uçlu forseps. DMEM / F12 kültür ortamı 3 ml içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe omurilik aktarın. tüm lomber omurilik izole edilene kadar buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> Spinal Kord Diseksiyon <ol><li> 6 cm çanak içine omurilik ile kültür ortamı dökün (non-hücre kültürü tedavi). </li><li> Bir stereomikroskop altında, hiçbir iki çift kullanarak ganglionlar ve kan damarlarını tutarak omurilik segmentinde etrafında dorsal kök ganglionlar ve kan damarlarını çıkarın. 5 forseps ve yavaşça omurilik uzak çekerek. Hiçbir orta ile 6 cm çanak omurilik segmenti aktarın ve ince bir neşter bıçak kullanarak doku kıyma. </li><li> Neurosphere ayrışma ortamı 1 ml içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer Kıyılmış doku (bakınız Tablo 2). Tüm omurilik işlendikten kadar 4.2.2 - 4.2.1 adımları buz ve tekrar tüpü koyun. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C &#39;de ayrışma ortamı içinde kıyılmış doku ihtiva eden tüpler inkübe karıştırmak için yan boru fiske ve daha sonra başka bir 10 dakika daha 37 ° C&#39;de inkübe edin. Mekanik ayrışma için çapları azalan yangın cilalı pipetler ile enzimatik sindirim, çiğnemek sonra. Not: deneyler gerçekleştirmeden önce çapları azalan yangın cilalı pipetler hazırlayın. Bir bardak Pasteur alınpipet ve temiz pamuk ile geniş ucunu. bir alkol lambası kullanarak, yangın lehçe alev pipetler ipuçları Farklı çaplarda oluşturmak için: &quot;Normal&quot;, &quot;para cezası&quot;, ve &quot;ekstra para cezası&quot;. &quot;Normal&quot; cilalı pipetler için, çapı (~ 1 mm) düşürmeden kenarları yuvarlak alevinde pipet ucunu burgu. &quot;Iyi&quot; (~&gt; 1 mm ve&gt; 5 mm çap) ve &quot;ekstra para cezası&quot; (~ 0.5 mm) cilalı pipetler oluşturmak için biraz daha uzun bir süre için alev pipet ucunu döndürün. 0.5 mm&#39;den daha az çaptaki pipetler kullanmayın. </li></ol></li><li> neurosphere Kültür <ol><li> içeren aşağı Spin tüpler 10 dakika boyunca 200 xg&#39;de omurilik dokusu ayrışmış. Neurosphere kültür ortamı, 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın (bakınız Tablo 2). ayrışma kolaylaştırmak için bir P200 pipet ardından P1,000 pipet ile toz haline getirin. Not: tanıtan kabarcıkları kaçının,hangi hücre canlılığı azalacaktır. </li><li> Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı edinin. Neurosphere kültür ortamı, 10 ml bir T25 şişesi içinde 1x10 5/10 ml yoğunlukta plaka hücreleri. Neurospheres 24 görünene kadar 7 gün boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5. </li></ol></li><li> neurosphere Ayrılma <ol><li> neurosphere kültürünü toplayın ve 15 ml tüpler transfer. 10 dakika boyunca 200 xg&#39;de Spin. geride 1 ml bırakarak süpernatant en çıkarmak. Hücre pelletini ve tek hücre içine neurospheres ayırmak için bir P1,000 pipet ile çiğnemek. Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı olsun. </li><li> Levha 1 x 10 5, 96 oyuklu bir plaka (96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ kaplama için bölüm 5.1) F9 nadir LacZ bir oyuk üzerinde neurosphere hücreleri kesilerek. Plaka çoğaltır olarak 3 kuyu. Kültür O / N 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2.</li></ol></li></ol> E8.5 Embriyolar ve Omurilik Neurospheres 5. RA Deneyi <ol><li> 96 oyuklu bir plaka kaplama F9 nadir LacZ <ol><li> Bir gün hasat E8.5 embriyolar veya neurospheres ayrışmasından önce, kaplama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin, 100 ul, 96 oyuklu bir plaka. Aspire ve jelatin distile su, 200 ul iki kez yıkayın. </li><li> Adım 2.2.2 detaylı olarak Trypsinize F9 NADİR-LacZ hücreleri 10 cm yemekleri sürdürdü. Levha 1 x 10 5 hücre / kuyu F9-NADİR LacZ hücreleri, ama G418 olmadan kültür ortamı kullanılarak bu sefer. </li><li> , Neurospheres (3 kuyu / genotip) yanı sıra, üç kopya halinde standart bir eğri (27 oyuk) - embriyo ko-kültür (altlık boyutuna bağlı olarak 20 ~ 12) için yeterli kuyu hazırlayın. </li></ol></li><li> F9 NADİR-LacZ ve E8.5 Embriyolar veya Omurilik Neurospheres Co-kültür <ol><li> F9 üstündeki bölüm 3.2 ve plaka ayrıntılı olarak hasat embriyolarbölüm 5.1 96-plaka NADİR-LacZ. Benzer bir şekilde, Aşama 4.4 ayrıntılı olarak açıklanan 96-çukurlu plaka içinde F9 nadir LacZ üstünde Neurospheres ve plaka ayrıştırmaları. Kültür O / N 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li></ol></li><li> Bir standart eğri oluşturma <ol><li> 100 nM, 10 nM, 1 nM, at- seri seyreltme ile 100 pM, 10 pM, 13:00, 100 FM: bir standart eğri oluşturmak için aşağıdaki konsantrasyonlarına sahip çözeltiler (en-RA), tüm-trans RA hazırlanması F9 nADİR-LacZ kültür ortamı ile RA stok (bakınız Tablo 1). </li><li> bölüm 5.1 F9 NADİR-LacZ hücrelerine konsantrasyonlarda-RA de bu farklı 100 ul ekleyin. Tedavi edilmemiş F9 NADİR-LacZ hücreleri negatif kontrol olarak içeren kuyu atayın. her RA konsantrasyonu ve negatif kontrol kuyuları triplicates hazırlayın. Kültür O / N 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. Not: F9 nadir LacZ hücre-trans RA değişen konsantrasyonlarda bir doza bağlı doğrusal bir şekilde yanıt verir. </li></ol></li><li> RA Deneyi <ol><li> Standart eğriler ve ko-kültürler içeren 96 oyuklu plakanın O / N kültürden sonra, ortamını çıkarın ve% 2.5 glutaraldehid, 100 ul ekleyerek kültürleri çözmek, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (bakınız Tablo 2). Fiksatif çıkarın ve PBS 1X 200 ul, yıkama başına 10 dakika ile iki kez yıkanır. </li><li> PBS çıkarın ve LacZ yıkama çözeltisi 200 ul ile üç kez yıkama, yıkama başına 10 dk (bakınız Tablo 2). Üçüncü yıkama sırasında folyo ile sarılmış bir 15 ml tüp içinde X-gal ile boyama solüsyon hazırlanır (bakınız Tablo 2). gerekli ne kadar boyama çözeltisi hesaplayın ve uygun bir miktar (200 ul / oyuk) hazırlanması. Not: X-gal boyama çözüm duyarlı ışıktır. hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde boyama solüsyonu kullanın. </li><li> 96 oyuklu bir plaka tutmak için yeterince büyük, bir plastik kap içine damıtılmış su ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirerek nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. X 200 ul eklegal boyaması 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu çözeltisi ve nemlendirilmiş bir odada plaka koyun. </li><li> Mavi renkli çökelti gelişimine izin vermek için 37 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka ihtiva eden nemlendirilmiş bir odacıkta inkübe edin. (- 16 saat 12) E8.5 embriyoların plaka O / N kuluçkaya yatmaktadır. 8 saat - neurosphere kültürler için, 4 plaka inkübe edin. </li></ol></li><li> OD 610 ve Görüntüleme de Absorbans Okuma <ol><li> renk reaksiyonundan sonra, LacZ boyama çözüm kaldırmak ve PBS 1x 200 ul ile değiştirin. RA raportör yanıtını ölçmek için standart bir ELISA plaka okuyucusu kullanılarak 610 nm&#39;de absorbansı ölçülür. Bir kamera ile donatılmış bir standart stereomikroskop kullanılarak görüntü bireysel kuyular. </li></ol></li></ol> F9 NADİR-LacZ Hücreleri 6. Altklonlaması <ol><li> RA F9 NADİR-LacZ rResponse denetleme <ol><li> herhangi bir deney başlamadan önce, RA için F9 NADİR-LacZ hücrelerinin tepkisini test edin. Plaka F9 NADİR-LacZ c96 oyuklu bir plaka içerisinde arşın (bakınız bölüm 5.1) ve 1 nM All-trans retinoik asit (adım 5.3) ekleyin. 37 ° de CO / N nemlendirilmiş bir oda içinde inkübe edin. </li><li> Bir mikroskop kullanılarak mavi renkli çökelti gelişimini gözünüzde canlandırın. Renk geliştirme gözdeki hücrelerin boyunca düzgün değilse, aşağıda ayrıntıları altklonlanmasıyla gerçekleştirmek (sol Şekil 1B, bakınız). </li></ol></li><li> F9 NADİR-LacZ Hücreleri Altklonlaması <ol><li> Adım 2.2.2 detaylı olarak 10 cm yemekleri kültüre F9 NADİR-LacZ hücreleri bölme. Bunun yerine 1:10 oranı, her bir koloni, tek bir F9 nadir LacZ hücre ortaya çıkar, öyle ki izole edilmiş koloni büyümesine izin vermek için 10 cm&#39;lik bir tabak içinde, 1 x 10 5 hücre / 10 mi düşük bir tohum yoğunluğu plaka. </li><li> İki gün sonra, kaplama, 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Jelatin çözeltisini çıkarın ve distile su, 500 ul kuyular iki kere yıkayın. F9 nadir LacZ hücre kültür ortamında 500 ul su ile değiştirin. </li><li> iyi birine steril bir P10 pipet ve transfer kullanarak bir koloni seçin; 24 ayrı koloniler elde etmek için bu 24 kez yapmak. 4 gün - 37 ° C, 3% 5 CO 2 kültür. </li><li> İki 24 oyuklu plakalar içinde ayrı ayrı koloniler Böl. kültür içinde 2 gün sonra bir 24 oyuklu plaka ve Kültür O / N her bir kuyu için RA 1 nm ekleyin. yüksek yanıt test etmek için bölüm 5.4 detaylı olarak LacZ boyama yapın. Güçlü ve muntazam müdahale belirlemek için iyi bir mikroskop altında her renk reaksiyonu gözünüzde canlandırın. </li><li> Güçlü bir alt klon yanıtlayıcı belirlendikten sonra, diğer 24 plaka karşılık gelen kültür genişletin. Dahası, 10 cm&#39;lik bir çanak o koloni genişletmek bölüm 2.3 detaylı olarak çeşitli şişeleri aşağı dondurmak ve diğer tüm sömürgeleri atın. Not: Orijinal kolonilerin dörtte biri yüksek yanıt neden Sadece yaklaşık. Tipik olarak, alt klonlama ilk turda üniforma LacZ boyanma yol açmaz ve alt klonlama bir sonraki tur için yapılması gerekenüniforma güçlü müdahale elde. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid.">Retinoic acid.</a> Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).</li><li>Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+the+functioning+brain.">Retinoic acid signaling in the functioning brain.</a> Science Signalling. 324, 1-3 (2006).</li><li>Lane, M. A., Bailey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+retinoid+signalling+in+the+adult+brain.">Role of retinoid signalling in the adult brain.</a> Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+signalling+in+the+development+of+the+central+nervous+system.">Retinoid signalling in the development of the central nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).</li><li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+and+spinal+cord+development.">Retinoids and spinal cord development.</a> J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).</li><li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signalling+during+development.">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li><li>Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+synthesis+in+mouse+embryos+during+gastrulation+and+craniofacial+development+linked+to+class+IV+alcohol+dehydrogenase+gene+expression.">Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression.</a> J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).</li><li>Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+premature+retinoic+acid+synthesis+in+Xenopus+embryos+following+premature+expression+of+aldehyde+dehydrogenase+ALDH1.">Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1.</a> Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).</li><li>Bastien, J., Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retinoid+receptors+and+the+transcription+of+retinoid-target+genes.">Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.</a> Gene. 328, 1-16 (2004).</li><li>Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+retinoic+acid+function+during+embryonic+brain+development+using+retinaldehyde-rescued+Rdh10+knockout+mice.">Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice.</a> Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).</li><li>Sakai, Y., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+retinoic+acid+catabolism+with+reporter+systems+and+by+in+situ+hybridization+for+CYP26+enzymes.">Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes.</a> Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+retinoic+acid+catabolic+enzymes+shows+high+expression+in+the+developing+hindbrain.">A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain.</a> Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).</li><li>Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+retinoic+acid+response+element-hsplacZ+transgene+defines+specific+domains+of+transcriptional+activity+during+mouse+embryogenesis.">Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis.</a> Genes &amp; Dev. 5, 1333-1344 (1991).</li><li>Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+retinoid+release+from+embryonic+neural+tissue+detected+by+an+in+vitro+reporter+assay.">Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay.</a> Development. 116, 55-66 (1992).</li><li>Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic-acid+critical+period+in+the+early+postnatal+mouse+brain.">A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain.</a> Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).</li><li>Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+the+brain+marks+formation+of+optic+projections,+maturation+of+the+dorsal+telencephalon,+and+function+of+limbic+sites.">Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites.</a> J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).</li><li>Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+organ+of+Corti+contains+retinoic+acid+and+forms+supernumerary+hair+cells+in+response+to+exogenous+retinoic+acid+in+culture.">The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture.</a> Development. 119, 1041-1053 (1993).</li><li>McCaffery, P., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+spots+of+retinoic+acid+synthesis+in+the+developing+spinal+cord.">Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord.</a> Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).</li><li>Hu, L., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+analogs+and+retinoic+acid+influence+the+expression+of+retinoic+acid+receptor+alpha,+beta,+and+gamma+mRNAs+in+F9+teratocarcinoma+cells.">Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratocarcinomas+and+mammalian+embryogenesis.">Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis.</a> Science. 209 (4458), 768-776 (1980).</li><li>Strickland, S., Mahdavi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+differentiation+in+teratocarcinoma+stem+cells+by+retinoic+acid.">The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid.</a> Cell. 15 (2), 393-403 (1978).</li><li>Li, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+GPCR,+Gpr161,+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation.">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li><li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (1986).</li><li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion,+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

F9 nadir LacZ hücre çizgisi 14 doku eksplantlarında 12,14,17,18 tarafından üretilen RA saptanması için kullanılabilen bir güçlü bir sistemdir. RA 12,14,18 ile muamele edilmemiş hücreler tespit Resim spesifik olmayan bir tepki ile, 100 fM kadar düşük RA konsantrasyonlarda duyarlıdır. Ayrıca, raportör hücre dolayısıyla LacZ Reaksiyon ölçülmesi ve RA seviyelerine 12,14,18 büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir sağlayan konsantrasyon belirli bir aralık içinde doğrusal bir şekilde all-trans RA yanıt. Burada sunulan hızlı ve kolay RA muhabiri tahlil embriyo ve kültürlü yetişkin nöral kök hücrelerin görselleştirme (Şekil 2) ve bağıl kantitatif ölçümü (Şekil 3) için F9 NADİR-LacZ haberci hücre hattını kullanır. Bu muhabir sistem Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi bireysel örnekler arasında endojen RA seviyeleri, karşılaştırılmasına olanak sağlar. RA tespit edebilmek için yeterince duyarlıkültürlenmiş neurospheres (Şekil 2B) tarafından üretilen tek tek E8.5 embriyolar (Şekil 2A) ve RA tarafından oluşturulan. RA konsantrasyonları bu hücre hattının doza bağlı tepki örnekleri (Şekil 3B) arasındaki görece RA seviyelerinin örnekleri RA seviyelerine (Şekil 3A) miktarının yanı sıra, karşılaştırma için izin verir. F9 RARE raportör hücre hattı fırınlama süresi boyunca doku örnekleri tarafından üretilen RA toplam miktarını ölçen dikkat etmek önemlidir. Bu RA sentezi ve katabolizması net dengesi eşdeğerdir. F9 NADİR-LacZ hücre muhabiri sistemi son derece hassas ve çok yönlü iken, biz bu sistemin güvenilirliğini sağlamak için dahil olması pek çok kritik sorun giderme adımları vardır. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, ilk, onlara g izin vermeden normal yolu ile bu hücrelerin sağlığını korumak için önemlidirbirleştirilmek üzere kürek. İkinci olarak, gözlemledik daha geçitler kültürler sürekli G418 ile seçim altında muhafaza bile, tutarsız RA yanıtlarına neden olma eğilimindedir. Bu sorunu gidermek için, 20 pasajlar sonra kültürleri atmak ve yeni bir flakon çözülme tavsiye edilir. Buna ek olarak, düzenli kontroller muhabiri hücreleri hala medyada RA varlığı güçlü yanıt olmasını sağlamak için yapılmalıdır. Üçüncü olarak, erken pasajlar güçlü yanıt (Şekil 1B, righ t) elde edilene kadar gerekli olabilir RA (sol Şekil 1B), bir ya da alt klonlama birkaç tur yoksul ya da düzgün olmayan tepki göstermek durumunda. Son olarak,-kültür birlikte önce, tür embriyo ve neurospheres doku örnekleri tek hücrelere ayrışmış önerilir. Biz daha tutarlı kolorimetrik ölçümlerde numunelerin sonuçları bu ayrışma gözlemlenmiştir. ayrışan hücreler uni gibi bu kültür kaynağında RA&#39;nın daha düzgün bir dağılımı nedeniyle olabilirmuhabir hücreleri form temas. Çeşitli modifikasyonlar orijinal protokole 14 yapılmıştır. İlk olarak, F9 nadir LacZ hücre RA yanıtı, hücreleri doğrudan doğruya sabitlenmesi ve 610 nm&#39;deki soğurma gücü ölçülerek yerine hücrelerin toplanması ile B-galaktosidaz aktivitesi 14 lisat analiz edilmesi ile ölçüldü. Başka bir değişiklik RA tepkisinin ölçümü öncesinde F9 NADİR-LacZ ile ayrışmış numunelerin doğrudan ko-kültür olduğunu. Önceki yöntemler ayrı ayrı numune kültüre ve NADİR-LacZ 16,18 F9 bu kültürlerden sadece medya ekleyerek bildirdi. onun varlık güçlü bir sisteme rağmen, F9 NADİR-LacZ haberci deneyi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu raportör hücre hattının bir sınırlaması, all-trans RA varlığında güçlü bir şekilde tepki verir, ancak, aynı zamanda, 9-cis-RA ve 13-sis-RA dahil olmak üzere diğer retinoik asit izomerleri tepki gösterir; Ancak, tüm-trans RA iştigal daha duyarlı 100 kat olandiğer izomerler 18 kırmızı. Bu sistemin bir başka sınırlama doğrusal doza bağımlı tepki sadece 10 -7 10 -13 M arasında düşer ki M at-RA 14,18; Bu şekilde, bu sınırların dışında RA seviyelerini karşılaştıran, ölçümler, doğrusal aralığı içinde kadar numunenin bir seri seyreltme yapılması gerekli olabilir. Bu öncelikle bir kolorimetrik tahlil olduğundan Son olarak, renk geliştirme uç örnekleri ve deneyler arasında değişir. Bu nedenle, her zaman için, her bir deney için paralel olarak kaplama, bir standart eğri raportör hücre yanıtının ölçülmesi için kullanmak önemlidir. Sonuç olarak, neurospheres olarak, daha önce bildirilmemiş, E8.5 embriyoların kantitatif RA seviyelerini ölçmek ve F9 NADİR-LacZ RA raportör hücre hattının kullanımını bildirmişlerdir. Bu raportör sistemi çok yönlülüğü hemen hemen herhangi bir hücre ya da doku tipi RA seviyelerinin ölçümü sağlar, ve m, olabiliray gelecekte çeşitli uygulamaların geliştirilmesi ile sonuçlanır.

Retinoik asit (RA) retinol ve vitamin A bir metabolitidir türevidir ve çeşitli hücresel dehidrojenazların 1 sıralı aktivitesi ile üretilmektedir. Nedeniyle amphiphatic kimyasal yapısı nedeniyle, hali hazırda lipid membranlar geçer ve çözünebilir morfogenetik faktörü 1 olarak hareket edebilir. Nükleer retinoid reseptörleri için bir ligand olarak işlev gören ve gen ekspresyonu 2-10 aktive ederek pek çok gelişme ve yetişkin hücresel süreci düzenleyen önemli bir moleküldür. RA olmadan bu RA reseptörleri (RARS) baskılayıcı olarak DNA ve hareket bağlama RARE; RA bu reseptörlere bağlanması, hedef gen ekspresyonu 1,5,6 sonuçlanan transkripsiyonel aktivatörleri haline getirir. RA sinyal yolu iyi karakterize olmasına rağmen, RA küçük boyutlu (~ 300 Da) ve amfipatik doğası direkt histolojik görselleştirme ve halen RA ölçümü 11 teknik olanaksız hale getirir. dir için tek yöntemRA seviyeleri vb ölçümü, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) 11 kullanılarak doku örneklerinden RA izolasyonu geçer. Bu yöntem, genellikle, farklı numuneler 12 havuzu kolaylaştırdı doku büyük miktarlarda gerektirir. Bu nedenle, bu teknik, tek tek embriyolar ya da örnek / doku küçük miktarlarda RA seviyelerinin ölçümü için pek uygun değildir. RA hücresel fonksiyonu incelemek için, birkaç yöntem dolaylı RA varlığını ortaya koymak geliştirilmiştir. Bu yöntemler, beta-galaktosidaz veya lusiferaz 11,13,14 ifadesini süren RARE son derece duyarlı, RAR-beta ihtiva eden raportör sistemler kullanır. Rossant ve ark., 13 tarafından oluşturulan transgenik NADİR-LacZ haberci fare yerinde 11,13,15,16 RA sinyalizasyon Spatiotemporal bölgelerini görselleştirmek için ideal bir sistem ancak kantitatif ölçümler için uygun değildir. T F9 NADİR-LacZ hücre hattı 14,O, diğer yandan, doku eksplantlarında 11,12,14,17,18 RA RA seviyelerinin niceliksel ölçümlerini içerir saptanması için yararlıdır. F9 teratokarsinoma hücrelerinin beta, endojen alfa- ifade eder ve y-retinoik asit, 19 alıcıları, ve RA 19-21 maruz kaldıktan sonra parietal endoderm şeklınde farklılaşmayı başlatır. F9 hücrelerinin uzun bir RA haberci deneyi için ideal bir hücre çizgisi olarak seçilmiştir neden RA-uyarılan hücre farklılaşması için bir model olarak belirlenmiştir. Wagner ve ark tarafından üretilen F9 türetilmiş Sil-15 RA raportör hücre çizgisi. 14, E. içerir insan beta-retinoik asit reseptörü (RAR-p) geni (nadir) 64-bp retinoik asit, yanıt elementi bir kopyasının alt coli&#39;LacZ geni. Seçip stabil klonlar korumak için, yapı da G418 mevcudiyetinde bir seçilebilir marker olarak aminoglikosit fosfotransferaz (NEO r) geni de içerir. Bu konstrukt, COLacZ boyama yoluyla görselleştirilebilir RA varlığında, B-galaktosidaz uyarılabilir ifade nfers ve bu yanıt, daha sonra olması kolorimetrik yöntemler 11,12,14,18 kullanılarak ölçülür olabilir. Bu çok yönlü raportör hücre hattı yaygın olarak 17 koklear ve embriyonik taban plakası eksplantlar 14 olarak haberci hücrelerde, doku örneklerinin ko-kültür ile endojen RA üretim saptanmasında kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu muhabir hattı ayrıca oluşum safhasındaki omurilik toplanmış bölümleri kültürlenmesini ve F9 nadir LacZ hücre 18 için bu kültürlerden kıvamlandırılmış ortam eklenerek geliştirilmesi omurilik RA seviyelerinin ölçümü için kullanılmıştır. Niceleme standart ELISA plaka okuyucusu 11,12,18 kullanılarak kolorimetrik okuma yoluyla LacZ boyama sonra yapıldı. Son olarak, bu raportör hücre hattı Monitori RA metabolik enzimlerin mevcudiyetinde saptanmasında kullanılmıştırng RA seviyeleri 12,18 değişir. Burada bu raportör hücre kuşağının duyarlılığı tek tek birlikte kültüre E8.5 embriyolardan oluşturulan RA seviyelerinin ölçümü sağlar bildirmektedir. Bu, farklı genotipleri bireysel embriyoları arasında karşılaştırma sağlar. Spesifik bir örnek olarak, Gpr161 RA sinyal yolu 22 boyunca kısmen Nörülasyonu düzenleyen yetim GPCR olduğunu ve genel RA düzeyde Gpr161 (Gpr161 il) ve resesif mutasyon etkisinin araştırılması için bu raportör hücre soyu kullanılarak rapor embriyo. Buna ek olarak, çok yönlülük ve kolay kullanım, bu muhabir sisteminin ölçmek ve hatta yetişkin omurilik kök hücrelerinden elde edilen neurosphere kültürlerde, farklı doku örneklerinin RA seviyelerini karşılaştırmak için özgürlük sağlar. Burada F9 NADİR-LacZ RA temsilcisi ile doğrudan ko-kültür aracılığıyla embriyo ve neurosphere kültürlerde göreceli RA seviyelerinin kantitatif tayini tarifÖrter hücre çizgisi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9 RARE-LacZ reporter cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10131-027</td>
			<td>Store at 4 &#176;C; light-sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (2 % stock solution)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-33</td>
			<td>Prepare 100 &#956;g/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% glutaraldehyde</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M155</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 &#183; H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5670</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferrocyanide (K&#8324;[Fe(CN)&#8326;] &#183; 3H&#8322;O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-9387</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium ferricyanide (K&#8323;[Fe(CN)&#8326;])</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-8131</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-d-galactopyranoside)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3941</td>
			<td>Store stock at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>41639</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all-trans Retinoic Acid (at-RA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R-2625</td>
			<td>Store 1 ml aliquots of stock in -80 &#176;C; extremely sensitive to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Store at 4 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003176</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td>Store in 1 ml aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>385908</td>
			<td>Store 200 &#956;l aliquots at -20 &#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Store in 200 &#956;l aliquots at -20 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing container</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm culture dish (cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm culture dish (non-cell culture treated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml amber microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml cryovials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>no. 5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-ended forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pasteur pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alcohol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative measurement of relative retinoic acid levels in e8.5 embryos and neurosphere cultures using the f9 rare-lacz cell-based reporter assay

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

F9 nadir LacZ haberci jelatin kaplı bir yüzey üzerinde yetiştirilen yapışkan bir embriyonik karsinoma hücre hattıdır. Raportör yapı hücreleri beta-galaktosidaz. 11,12,14,18 orantılı indüksiyon ile RA kantitatif yanıt sağlar. Bu hücreler, epitelyal morfoloji (Şekil 1A) görüntüler. 1:10 oranında 3 gün - için yüksek katlama oranı, hücrelerin her 2 bölünmesi tavsiye edilir. Bu raportör hücre hattı ile çalışma sırasında bile kültür ortamına G418 eklenmesi ile RA, bu hücrelerin yanıtı çok geçitler (sol Şekil 1B) ve bu raportör kapasitesini etkileyen sonra zayıflar gözledik Bu hücre hattı. duyarlılığının bu kayıp daha sonraki pasajlar da transgen kısmi kaybına bağlı olabilir. Bu periyodik alt klonlama RA kuvvetli ve düzgün müdahale için gerekli olduğu gibi (Şekil1B, sağ). Bu hücre hattı, çeşitli kullanımları daha önce 12,14-18 yayınlanmış olsa da, burada rapor farklı genotipleri bireysel E8.5 embriyolardan endojen RA düzeylerini ölçmek için, bu hücre soyu kullanılmasıdır. Bölgesindeki Gpr161 il / il mutasyon sonucu 22 sinyal embriyonik RA azalmıştır. F9 nadir LacZ hücreleri ile ayrışmış embriyoların ko-kültür ile gösterildiği gibi, bu Gpr161 vl / il embriyolar, vahşi tip litermatında (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında, endojen RA azaltmıştır. Çünkü aynı zamanda burada rapor Bu raportör hücre hattı, çok yönlü yetişkin Gpr161 ağırlık / ağırlık olarak fareler (Şekil 2B) elde neurosphere kültürleri ile üretilen RA seviyesini tespit etmek için, bu hücrelerin yeni bir kullanımıdır. Bu muhabir hücre hattı endojen RA üreten erişkin omurilik kök hücrelerinden o neurosphere kültürleri göstermek mümkün oldu. Büyük farkboyama yoğunluğu değini E8.5 embriyolar göre omurilik neurospheres için daha büyük bir raportör hücre yanıtı göstermektedir. Bu, bağlı neurosphere kültürler E8.5 embriyolar daha homojen ve böylece daha fazla RA-üreten hücrelerin içermesi gerçeğine bağlı olabilir E8.5 embriyolar ile karşılaştırıldığında, zaman içinde neurospheres tarafından üretilen daha büyük RA seviyelerine bağlı olabilir. raportör hücrelerinin doza-bağımlı bir lineer karşılık olarak en-RA sonuçlar farklı konsantrasyonlarda ilave edilmesi. Bu yanıt bir 610 nm&#39;de absorbans okunarak kolorimetrik ölçülebilir. Oluşturulan standart eğri daha sonra, doğal tipte neurosphere kültürleri (Şekil 3A) ve E8.5 embriyolar (Şekil 3B) gibi örneklerde RA düzeylerini ölçmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> Şekil 1. Bakımenance, F9 nadir LacZ Hücreler alt klonlama. (A) F9 NADİR-LacZ hücrelerinin bir faz-kontrast görüntü gösterilir. Bu hücreler, 10 saat bir katlama zaman ve her 3 günde bir geçmiş olması gerekir. - 1:10 oranında (yaklaşık 70% 80 izdiham) (B) ve daha sonra, LacZ-RA, 1 nM ilavesiyle kültürlerinin periyodik test boyama kültürleri RA (sağda) güçlü ve homojen müdahale kalmasını sağlamak için yapılmalıdır. fakir ve muntazam olmayan yanıt (sol) durumunda, alt klonlama gerçekleştirilmelidir. Ölçek 100 mikron barlar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> Şekil 2. LacZ Boyama Co-kültür Örnekleri (Dissosiye E8.5 Embriyolar / Neurospheres) ve F9 NADİR-LacZ hücrelerini. (A) E8.5 fare embriyo<html> Çeşitli genotiplerinin s ayrılmış ve F9 nadir LacZ hücre üzerine plakalanmıştır. LacZ 24 saat boyama sonra ko-kültür örneklerinin tarafından üretilen endojen RA F9 NADİR-LacZ hücrelerinin tepki görselleştirme sağlar. Raportör hücrelerinin azalması tepki tarafından görüntülendi olarak azalmıştır endojen RA&#39;da Gpr161 vl mutasyon sonuçları. (B) Sol. yetişkin omurilik, nöral kök hücre kültürlerinde neurospheres bir faz-kontrast görüntüsü gösterilmektedir. Sağ. Yetişkin Gpr161 ağırlık / ağırlık olarak omurilik türetilen Neurospheres ayrılmış ve F9 nadir LacZ hücre üzerine plakalanmıştır. LacZ boyama aşağıdaki mavi çökelti varlığı, bu neurospheres endojen RA varlığını gösterir. neurosphere ve E8.5 embriyo ko-kültürler arasında boyanma yoğunluğu farkı E8.5 embriyolar daha neurospheres RA mevcut büyük seviyelerini göstermektedir. Ölçek 100 mikron barlar.target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> Şekil 3. Standart eğri ve RA Düzeylerinin Kolorimetrik miktarının belirlenmesi. F9 nadir LacZ haberci hücre çizgisinin tepkisi standart ELISA plaka okuyucusu kullanılarak 610 nm de kolorimetrik ölçülebilir. (A) göreli RA seviyesini ölçmek için kullanılan bir standart eğri Örnek vahşi tip neurosphere kültürü s. Ko-kültürlenmiştir E8.5 embriyolardan göre RA seviyelerine (B) belirlenmesi. N = 3; * P &lt;0.05, öğrencinin t-testi. Hata çubukları SEM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Stock Tamponlar / Çözümler </td><td> Bileşenler </td><td> Depolama koşulları </td></tr><tr><td> % 10 sodyum deoksikolat monohidrat (Cı 24 H 39 NaO 4 · H2O) </td><td> 100&#39;in ml DH 2 O 10 ml </td><td> 4 ºC </td></tr><tr><td> 1 M magnezyum klorür (MgCI2) </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> 100x potasyum ferrosiyanür (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) </td><td> 10 mi DH 2.12 g 2 O </td><td> Karanlıkta RT </td></tr><tr><td> 100x potasyum ferrisiyanür (K 3: [Fe (CN) 6]) </td><td> 10 mi dH 1.64 g 2 O </td><td> Karanlıkta RT </td></tr><tr><td> 20 mg / ml X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid) </td><td> 20 mg / ml stok çözelti yapmak için 5 ml dimetil formamid ilave </td><td> -20 ºC </td></tr><tr><td> 10 mM (3 mg / ml) her trretinoik asit ans </td><td> 16.67 ml mutlak etanol içinde, 50 mg çözülür. 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. </td><td> 1.5 ml amber mikrosantrifüj tüpleri karanlıkta -80 ºC, </td></tr><tr><td> papain </td><td> 7 ml HBSS bir flakon çözülür </td><td> 4 ºC </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tamponlar ve Çözüm bileşimler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tamponlar / Çözümler Çalışma </td><td> Bileşenler </td><td> Depolama koşulları </td></tr><tr><td> F9 NADİR-LacZ hücre kültür ortamı </td><td> 50 ml cenin sığır serumu (FBS) (nihai konsantrasyon% 10) </td><td> Filtre-sterilize edin. </td></tr><tr><td></td><td> 5 mi 100X Penisilin Streptomisin (nihai konsantre 1X) </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td></td><td> 4mi 50 mg / ml G418 (son kons 0.4 mg / ml) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 ml DMEM / F-12 (L-glutamin ve HEPES) </td><td></td></tr><tr><td> % 0.2 jelatin </td><td> 25 mi% 2.0 jelatin </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td></td><td> 80 ml saf su </td><td></td></tr><tr><td></td><td> İyice karıştırın </td><td></td></tr><tr><td> % 70 etanol </td><td> 30 ml% 95 etanol </td><td> sprey şişesinde yerleştirin. </td></tr><tr><td></td><td> 70 mL distile su </td><td> Oda sıcaklığında saklayın </td></tr><tr><td> Neurosphere ayrıştırma ortamı </td><td> 1 mi 20U papain </td><td> her zaman taze hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 100 ul 13 mg / ml tripsin </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 ul 7 mg / ml hyaluronik asit </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28 ul 10 mg / ml DNasel </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 ul 4 mg / ml kynurenic asit </td><td></td></tr><tr><td> Neurosphere kültür ortamı </td><td> DMEM / F-12 (L-glutamin ve HEPES) </td><td> her zaman taze hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> % 2 B-27 takviyesi </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 ng / ml fibroblast büyüme faktörü (FGF) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 ng epidermal büyüme faktörü (EGF) </td><td></td></tr><tr><td> % 2.5 glutaraldehid </td><td> 250 ul% 50 glutaraldehid </td><td> her zaman taze hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 4750 ul 1x PBS </td><td></td></tr><tr><td> LacZ yıkama çözeltisi </td><td> 0.5 ml% 10 deoksikolat (nihai konsantrasyon% 0.1) </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td></td><td> 1.0 ml% 100 NP-40 (son derişim 0.2%) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 mi 10X PBS </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 500 ml saf su </td><td></td></tr><tr><td> X-gal ile boyama çözeltisi </td><td> 1x potasyum Ferrosiyanat </td><td> her zaman taze hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 1x potasyum ferrisiyanür </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 mg / ml X-gal </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Uygun hacme LacZ yıkama solüsyonu kullanarak </td><td></td></tr><tr><td> F9 NADİR-LacZ donma orta </td><td> F9 NADİR-LacZ kültür ortamı +% 5 DMSO </td><td> her zaman taze hazırlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Çalışma Tamponlar ve Çözüm kompozisyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay at JoVE.co

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

F9 NADİR-LacZ Hücre tabanlı Muhabir Test kullanma E8.5 Embriyolar ve Neurosphere Kültürleri Bağıl Retinoik Asit Düzeylerinin Kantitatif Ölçümü

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

quantitative-measurement-relative-retinoic-acid-levels-e85-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.8K Görüntüleme.  Rutgers University. Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line. 

Video: Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Bir ve İki Boyutlu Kültürlerde Elektrik ve Manyetik Alanlar Kullanan Nöronların Harici Uyarımı

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript describes procedures that may be used to monitor &#947;-secretase-mediated cleavage of either APP-C99 or Notch, using a Gal4 promoter-driven firefly luciferase reporter system. These assays were established by stably co-transfecting HEK293 cells with the Gal4-driven luciferase reporter gene and either the Gal4/VP16-tagged C-terminal fragment of APP (APP-C99; CG cells), or the Gal4/VP16-tagged Notch-&#916;E (N&#916;E; NG cells). Using these reporter assays in parallel, we have demonstrated that an ErbB2 inhibitor, CL-387,785, can preferentially suppress &#947;-secretase cleavage of APP-C99 in CG cells, but not N&#916;E in NG cells. The differential responses exhibited by the CG and NG cells, when treated with CL-387,785, represent a preferred characteristic for &#947;-secretase modulators, and these responses are in stark contrast to the pan-inhibition of &#947;-secretase induced by DAPT. Our studies provide direct evidence that &#947;-secretase activities toward different substrates can be differentiated in a cellular context. These new assays may therefore be useful tools in drug discovery for improved AD therapies.

We have successfully generated two substrate-specific &#947;-secretase assays. Both cell-based assays presented here are designed to quantify &#947;-secretase enzymatic activities via the output of firefly luciferase reporters.

Amiloid habercisi γ-Secretase-aracılı Protein ve çentik bölünme hücre tabanlı Luciferase muhabir tahlil platformlarda nicel ölçüm

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing neuronal dysfunction which eventually leads to cognitive decline. Hyperphosphorylated tau aggregates in the neuron are believed to cause most of the pathology associated with AD. These aggregates are assumed to be released into the extracellular compartment and taken up by adjacent healthy neurons where they induce further tau aggregation. This &#34;prion-like&#34; spreading can be interrupted by antibodies capable of binding and &#34;neutralizing&#34; extracellular tau aggregates as shown in preclinical mouse models of AD. One of the proposed mechanisms by which therapeutic antibodies reduce pathology is antibody-mediated uptake and clearance of pathological aggregated forms of tau by microglia. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess tau uptake by microglia. This assay uses the mouse microglial cell line BV-2, allows for high specificity, low variability and medium throughput. Data generated with this assay can contribute to a better characterization of anti-tau antibody effector functions.

Here we describe a cell-based assay to quantitatively assess tau uptake by microglia with the aim of creating an investigational tool to better characterize the mechanisms of action of anti-tau antibodies.

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Farelerde İntrathecally Sentezlenmiş Proteinlerin Kantitatif Ölçümü

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...