Thanks to Kenn D. M&#248;ller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. J&#248;rgensen for quantitative PCR analysis.

Not: dairesel DNA saflaştırma ve dizileme yöntemi (daire-Seq) bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. 1. Yetiştirme, Hücre Hasat ve Plazma Membran bozulması <ol><li> Maya Pepton Dekstroz, 50 ml tam bir besin ortamı (YPD) içine bir O / N kültüründen (örneğin Saccharomyces cerevisiae), maya hücreleri inoküle. 1-3 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir düşük bir başlangıç ​​hücre yoğunluğu ya da yaklaşık olarak 0.01 OD 600 bir optik yoğunlukta inoküle. <ol><li> Hücreler, yaklaşık 24 saat veya OD 600&gt; 10.0 bir optik yoğunluk 48 sonra yaklaşık olarak 1 x 10 10 hücrelerin maksimum hücre yoğunluğu ulaşana kadar dakika (rpm), 150 mermi ajitasyon ile 30 ° C &#39;de inkübe hücreleri. NOT: düşük hücre konsantrasyonları kullanılabilir gibi kültür süresi önemli değildir. </li></ol></li><li> 50 ml konik tüp geçmek kültürü transfer santrifüj ile hücreler pelet800 xg 3 dakika ve supernatant atın. </li><li> 3 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yeniden pelet ve supernatant atın, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0 25 mi tampon solüsyonu ile pelet yıkayın. </li><li> bir plasmid sütun saflaştırma kiti temin 1.2 ml yeniden süspansiyon tamponunda hücre pelletini. </li><li> İsteğe bağlı adım: dairesel DNA elemanlarının 20 arıtılması için kontrol olarak son derece sulandırılmış plazmidler ekleyin. Not: Mevcut veri kümesinde, bir 7.7 ul plazmit karışımı 10 10 hücreleri ihtiva eden her bir örnek için uygulanmıştır. plazmid stok karışımı farklı konsantrasyonlarda üç plazmid oluşuyordu; 0.01 ng / numune 38 ng / numune de pBR322, pUC19 0.5 ng / numune de, ve pUG72. </li><li> Toplam süspansiyon hacmi: 3 oranında 2 ml iki mikro santrifüj tüplerine hücre süspansiyonu transfer her biri bir 1, 0.5 mm cam boncuklar ile takviye edilmiştir. </li><li> Plazma hücresi bozmaya 10 dakika vorteksleyin, maksimum hızda, her tüpMembranlar. 30 saniye için 268 x g&#39;de santrifüj ile boncuk pelet ve yeni bir tüpe mikrosantrfuj tübüne 1.2 mL birleştirilmiş süpernatant aktarın. Not: Alternatif 0.6 mi yeniden süspansiyon tamponu çözeltisi içinde Hücrelerin yerinden oynaması için zymolyase kullanarak, 1.6-1.7 adım. Zymolyase on adet 35 ° C&#39;de 1.5 saat içerisinde 5 x 10 7 hücre bozabilir. </li></ol> Kolon Kromatografisi 2. EccDNA Zenginleştirme <ol><li> plazmid kolon saflaştırılması için bir kit protokolü uygulayın. Kısaca, 1.2 mi alkalin çözelti ile her bir örnek tedavi yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> 1.2 mi nötralizasyon tampon ekleme 5 dakika boyunca 9650 x g&#39;de yumuşak ve santrifüj karıştırın. </li><li> 1 mi, dengeleme çözeltisi ile dengelenmiş bir sütun üzerine çözelti yük ve sıvı yerçekimi ile sütun dolaşmasını sağlar. </li><li> 4 ml yıkama çözeltisi ile sütun yıkayın. çözelti, reçine geçtikten sonra, dikkatli bir şekilde 0.3 ml elüsyon şekilde eklemedökülmesinden 0.35 mi kolonu boş hacim çok değiştirmek için kullanılır. </li><li> 1 mi yıkama çözeltisi ile yeni bir toplama tüpüne DNA Zehir 0.8 mi çöktürme karışımı ekleyerek çökelti DNA. 10 dakika boyunca 9650 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 5 ila 15 dakika boyunca 5 dakika hava Kuru 9650 xg&#39;de 0.5 mi,% 70 etanol, santrifüj ile DNA pelet yıkayıp 25 ul steril su içinde saflaştırılmış DNA çözülür. NOT: Suda DNA sadece kısa süreli depolama tavsiye edilir. Tercihen, adım 3&#39;e doğrudan geçin. </li></ol> 3. Sindirim Doğrusal kromozomal DNA&#39;nın kalan <ol><li> İsteğe bağlı adım: ekzonükleaz ile doğrusal DNA spesifik sindirimi kolaylaştırmak gibi Notl gibi nadir kesici endonükleaz ile saflaştırılmış DNA tedavisi için. 5 ug DNA için, 50 ul toplam hacim 1 birim Notl, 5 ul 10x sindirim tampon ve steril su kullanın. 16 saat ve ısı 37 ° C &#39;de reaksiyon inkübe 5 dakika boyunca 80 ° C&#39; de endonükleaz etkisiz hale getirirler. </li><li> 20 eklebirim ekzonükleaz (2 ul), 4 ul ATP (25 mM), 34 ul steril su ve 50 ul Endonükleaz&#39;a klivaj DNA&#39;ya doğrudan 10 ul 10x reaksiyon tamponu ATP-bağımlı Eksonükleaz kullanılarak 100 ul 1x reaksiyon hacmi ulaşmak kiti. </li><li> 5 gün veya daha fazla, 37 ° C de, doğrusal tek sarmallı ve çift sarmallı DNA hidrolizi gerçekleştirmek. Ek bir 4 ul ATP (25 mM), 0.6 ul 10 x reaksiyon tamponu ve 1 x reaksiyon hacmi enzimatik sindirim, DNA devam her 24 saatte egzonükleaz 20 birimleri ekleyin. </li><li> Lineer DNA çıkarılmasından sonra eksonükleaz ile muamele edilen çözelti örnek 2 ul aktin geni ACT1 20 bir kromozom işaretleyici kullanılarak niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), kromozom lineer DNA kaldırılması teyit etmek için. <ol><li> Her 20 ul qPCR reaksiyon hacmi 2 ul eksonükleaz ile muamele edilmiş numune, 150 nM ACT1 primerleri 5&#39;-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;ve 5&#39;-TGGACCACTTTCGTC içerirGTATTC-3 &#39;,% 2 (hacim / hacim) dimetil sülfoksit ve 10 | il yeşil fluoresan ana karışımı. </li><li> Reaksiyon koşulunu kullanın; 95 ° C&#39;de 15 saniye 45 döngü, 60 ° C&#39;de 30 saniye, ardından 95 ° C&#39;de 3 dakika,. NOT: Bu gen kopya sayısı değişimleri, böylece eccDNA Act1 taşıyan olmamalıdır 21-23 zararlı olduğundan ACT1 lineer DNA için özellikle uygun bir belirtecidir. </li><li> qPCR DNA parçalanması analizinde alternatifleri, standart PCR (4.3) ya da propidyum iodid koyulaştırması (4.4) vardır. <ol><li> ACT1 primerleri 5&#39;-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;ve-GAACGACGTGAGTAACACC-3 5&#39; &#39;PCR şablon olarak 2 ul eksonükleaz ile muamele edilmiş numune kullanılır. Pozitif ACT1 kontrol olarak, genomik S. ng 50-100 kullanın şablon olarak S. cerevisiae bir DNA. PCR reaksiyon koşulları; 95 ° C&#39;de, 56 ° C&#39;de 30 saniye ve 72 ° C&#39;de 1 dakika 30 saniye 35 döngü, ardından 95 ° C&#39;de 3 dakika,. </li><li> Jel electrophore Run PCR reaksiyonları0.5 ug% 1 agaroz üzerinde sis / ml etidyum bromür. 0.8 kb ACT1 bandı için arayın. </li></ol></li><li> yokluğu veya lineer DNA varlığı, önce, ve DNA amplifikasyonundan sonra, propidyum iyodür boyaması yolu ile kontrol edilebilir. <ol><li> 20 mM propidyum iyodid stokunun 1.000 H2O ile seyreltilmiş çözelti bir 1: 1 hacim: 1, her bir DNA numunesi karıştırın. Oda sıcaklığında 10-20 dakika süreyle karanlıkta çözüm bırakın ve 663-738 nm ve 5 ila 30 saniye arasında bir pozlama zamanında kırmızı uyarma floresan filtre kullanarak 100x büyütmede floresan mikroskobu ile DNA boyama analiz. DNA boyama kontrol olarak kullanımı maya ve / veya ø29 amplifikatörlü plazmid genomik DNA ø29-amplifikasyonuna tabi tutulabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Isı 30 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ekzonükleaz çözeltisi etkisiz hale getirirler. </li></ol> 4. DNA amplifikasyonu <ol><li> Saflaştırılmış yükseltmek ve ø29 DNA polimeraz 24-26 anlaşmanın ile adım 3.5) den eccDNA zenginleştirilmişpolimeraz, üretici protokolüne ing. <ol><li> Kısaca, 5 ul denatürasyon tamponu ile eccDNA zenginleştirilmiş 5 ul karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika sonra, 10 ul nötralizasyon tampon eklemek. İyice karıştırın ve 29 ul reaksiyon tamponu ve 1 ul ø29 DNA polimeraz içeren 30 ul ana karışımı ekleyin. (72 saat kadar), 16 saat ya da daha fazla süreyle 30 ° C &#39;de reaksiyon inkübe edin. Grup 3 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta ø29 DNA polimeraz etkisiz hale getirirler. </li></ol></li></ol> 5. Sıralama ve Veri Analizi <ol><li> 300 bp bir ortalama hedef pik boyutuna odaklanmış ultrasonikatör ile yükseltilmiş eccDNA kayma. 130 ul DNA örneği için aşağıdaki ayarları kullanın: 450W tepe yoğunluğu gücü, 60 sn tedavi,% 30 görev faktörü, patlama başına 200 devir, sıcaklık 7 ° C. </li><li> parçalanmış kütüphane hazırlanması için uygun bir yöntem kullanılarak, dizileme için kütüphanelerin sentezi için okur barkod indeksi etiketleri ve adaptörleri ekleyin. </li><li>141-nükleotid tek-uçlu yüksek verimli bir dizi platformunda okur örneğin, derin sıralama çalıştırın. </li><li> Harita soruşturma altında maya referans genomuna okur ve izin birden fazla bölgelere eşleştirmek için okur. Örneğin, bir serbestçe kullanılabilir iş akışı sistemi 27,28 ve kısa okuma hizalama haritalama yazılımı 29 kullanın. </li><li> Tespit boşlukları 20 olmadan, örneğin, birden fazla ardışık yedi okur okur bitişik (&gt; 1 kb) ile farazi eccDNAs bölgeleri okur. NOT: Yazılım kullanılabilir eşlenen keşfetmek için 27,28 ilgi genomik bölgelerde okur. </li></ol>

<ol>
	<li>Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tandem+Inversion+Duplication+in+Salmonella+enterica.:+Selection+Drives+Unstable+Precursors+to+Final+Mutation+Types.">The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types.</a> Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).</li><li>Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+Frequency+in+a+Population+of+Salmonella+enterica.+Rapidly+Approaches+Steady+State+With+or+Without+Recombination.">Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination.</a> Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).</li><li>Smith, C. A., Vinograd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+polydisperse+circular+DNA+of+HeLa+cells.">Small polydisperse circular DNA of HeLa cells.</a> Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).</li><li>Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Minute+Chromosomes+Can+Be+Produced+from+Precursors+Derived+from+a+Chromosomal+Deletion.">Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion.</a> Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).</li><li>Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+Circular+DNA+of+Tandemly+Repeated+Genomic+Sequences+in+Drosophila.">Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila.</a> Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).</li><li>Horowitz, H., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Autonomously+Replicating+Circular+Subtelomeric+Y'+Elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).</li><li>Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Circular+Amplifications+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+a+Breakage-Fusion-Bridge+Mechanism.">Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism.</a> Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).</li><li>Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+diverse+nitrogen-limited+environments+by+deletion+or+extrachromosomal+element+formation+of+the+GAP1+locus.">Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).</li><li>Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+chromosome+breakage+in+gene+amplification,+deletion+formation,+and+amplicon+integration.">A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration.</a> Genes &amp; development. 5 (2), 160-174 (1991).</li><li>Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Polymorphisms+at+Nucleotide+Resolution+with+a+Single+DNA+Microarray.">Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray.</a> Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).</li><li>Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+sequencing+of+structural+variation+from+eight+human+genomes.">Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes.</a> Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).</li><li>Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).</li><li>Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Variation+and+the+Fate+of+Beneficial+Mutations+in+Asexual+Populations.">Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations.</a> Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).</li><li>van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+extrachromosomal+circular+DNA+in+HeLa+cells+by+nonhomologous+recombination.">Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).</li><li>Vinograd, J., Lebowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+Topological+Properties+of+Circular+Dna.">Physical and Topological Properties of Circular Dna.</a> Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).</li><li>Shibata, Y., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+MicroDNAs+and+Chromosomal+Microdeletions+in+Normal+Tissues.">Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues.</a> Science. 336 (6077), 82-86 (2012).</li><li>Dillon, L. W., Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Extrachromosomal+MicroDNAs+Is+Linked+to+Mismatch+Repair+Pathways+and+Transcriptional+Activity.">Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity.</a> Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).</li><li>Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metamobilomics+-+our+knowledge+on+the+pool+of+plasmid+encoded+traits+in+natural+environments+using+high-throughput+sequencing.">Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing.</a> Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).</li><li>Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+bovine+rumen+plasmidome.">Insights into the bovine rumen plasmidome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).</li><li>M&#248;ller, H. D., Parsons, L., J&#248;rgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+circular+DNA+is+common+in+yeast.">Extrachromosomal circular DNA is common in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).</li><li>Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Actin-Binding+Proteins+-+Evidence+for+a+Role+in+Morphogenesis.">Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).</li><li>Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+profilin+suppress+the+lethality+caused+by+overproduction+of+actin+in+yeast+cells.">High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells.</a> FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).</li><li>Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressor+analysis+of+fimbrin+(Sac6p)+overexpression+in+yeast.">Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast.</a> Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).</li><li>Blanco, L., Bernad, A., L&#225;zaro, J. M., Mart&#236;n, G., Garmendia, C., Salas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+DNA+Synthesis+by+the+Phage+&#248;29+DNA+Polymerase.">Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage &#248;29 DNA Polymerase.</a> The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Amplification+of+Plasmid+and+Phage+DNA+Using+Phi29+DNA+Polymerase+and+Multiply-Primed+Rolling+Circle+Amplification.">Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.</a> Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).</li><li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+cloning+using+&#248;29+DNA+polymerase.">Cell-free cloning using &#248;29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).</li><li>Giardine, B., Riemer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+A+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis.">Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).</li><li>Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curing+Saccharomyces+cerevisiae+of+the+2+micron+plasmid+by+targeted+DNA+damage.">Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage.</a> Yeast. 14 (9), 847-852 (1998).</li><li>Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Including+Upper+Size+Range+Plasmids+in+Metamobilomes.">An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes.</a> PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).</li><li>Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors:+Origin+and+structure.">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure.</a> Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li><li>Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+human+MYC+localized+to+replicating+submicroscopic+circular+DNA+molecules.">Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).</li><li>Raymond, E., Faivre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hydroxyurea+on+extrachromosomal+DNA+in+patients+with+advanced+ovarian+carcinomas.">Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).</li><li>Shimizu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+Double+Minutes+and+Chromosomal+Homogeneously+Staining+Regions+as+Probes+for+Chromosome+Research.">Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research.</a> Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).</li><li>Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+differentiation+in+HL60+cells+by+the+reduction+of+extrachromosomally+amplified+c-myc.">Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).</li><li>Vogt, N., Lef&#232;vre, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+double-minute+chromosomes+bearing+amplified+copies+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+in+gliomas.">Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).</li><li>Ahn, K., Gotay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+rate+of+disease-related+copy+number+variations+in+childhood+onset+schizophrenia.">High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia.</a> Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).</li><li>Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+increases+in+both+common+and+rare+copy+number+load+associated+with+autism.">Global increases in both common and rare copy number load associated with autism.</a> Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).</li><li>Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplicon+rearrangements+during+the+extrachromosomal+and+intrachromosomal+amplification+process+in+a+glioma.">Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma.</a> Nucleic Acids Research. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Çember-Seq yöntem dizisi düzey çözünürlüğe sahip maya hücrelerinden eccDNA genom ölçekli algılanmasını sağlar. yöntemi, yoğun girdap veya pipetleme gerektirmez ve bir sonraki aşamada ekzonükleaz sindirimine yol açar eccDNA kırılma sınırlamak için yer çekimi ile sütun ayrımı kullanan etmez hafif eccDNA saflaştırılmasıdır. Yöntemin bu özellikler gen dizilerini içeren büyük eccDNAs tespit edilmesi için önemli olabilir. Çember-Sıra tam genlerin (Dataset 1) olmak üzere çok sayıda eccDNAs algıladı. Aynı zamanda 86-kb maya mitokondrial DNA tespit edildi. Böylece, bu protokol, büyük dairesel DNA elemanları saflaştırılmasını kolaylaştırır. minimumda DNA ekstraksiyon adım sayısını tutulması eccDNA kaybı riskini azaltır ve verimi en üst düzeye çıkarır. kontrol sonuçlarına göre, ani yüksek voltajlı plazmidler, daire-Dizi 2500 hücrelerinden tek dairesel DNA tespit edilmesi, son derece duyarlıdır. Ayrıca, bu tür 2P gibi bol endojen plazmidler kaldırma; plazmid veya mitokondriyal DNA önemli ölçüde hassasiyeti artırmak olabilir. Maya kültürlerinden 2P sertleştirilmesi 30 tarif edilmiştir. Seçenek olarak ise, 2μ ve mitokondriyal DNA ayrılması, SwaI gibi nadir kesici endonükleaz ile elde edilebilir. Ancak, restriksiyon enzim adım diğer ilgi eccDNAs hedef ve toplam eccDNA verimi sınırlayabilir. eccDNA tespiti için kritik adım uygun bir derinliğe kadar Lineer DNA (aşama 3) ve DNA dizi analizi (aşama 5) çıkarılması idi. Bir hücre popülasyonundan eccDNAs çoğunluğu kaydetmek için, derin sıralama 20 gerekli olabilir. dairesel DNA kavşak eşleştirilmiş uç vermesi beklenen diskordan o haritayı okur olarak eşleştirilmiş sonu sıralama, eccDNA tespiti bile daha fazla güven vermelidir. Bu farklılıklar dairesel DNA yapılarının keşif destek ve potansiyel ek eccDNA algılama filtre olarak kullanılabilir. Çember-Seq yöntem üç bağımsız S. kullanılarak doğrulandı cerevisiae CEN.PK popülasyonları. Tespit dizileri daha önce eccDNAs, endojen plazmidleri rapor ve katkılı plasmidlerin ve ayrıştırılması eccDNAs (Veri kümesi 1) yüzlerce dahildir. Bu bulgular S. önceki Çember-Seq veri setleri destek cerevisiae S288c 20. CEN.PK ve S288c popülasyonları yaygın birçok eccDNAs bulunması, bu noktalar, dairesel elemanlar (Şekil 4) biri için bir eğilime sahip olduğunu gösterir. Biz daha önce diğer gerilme geçmişlerindeki [GAP1 dairenin] kanıtı bulunmamıştır olsa [GAP1 daire], CEN.PK arka 8 azot sınırlı koşullar altında zenginleştirilmiş olduğunu göstermiştir. S288c ve CEN.PK hem CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 ve HXT6 HXT7 loci ile ilgili eccDNA bölgesinin bulunması, DNA daire haline için yatkınlık con olduğunu göstermektedirmaya suşları arasında görev yaptı. [HXT6 / 7 daire], [ASP3-1 daire], [COS111 daire] ve [CUP1-1 RSC30 daire] hücrelere veya eğer seçici avantaj kazandırmaz eğer onların varlığı sadece yüksek oranlarda bir etkisi olduğunu göstermiştir gerekmektedir DNA daireselleştiğini. Birlikte ele alındığında, sonuçlar daire-Seq kilobaz-boy eccDNAs tespit edilmesi için uygundur ve tam genleriyle eccDNAs belirlenmesi için avantaj olduğunu göstermektedir. Çember-Seq maya eccDNAs tüm genom ölçekli ekranlar sağlayan son derece hassas bir yöntemdir. Çember-Seq yöntem gen silme ve büyütmeleri üreten eccDNA rolünü aydınlatılması amacıyla yeni bir araştırma alanı açabilir. DNA, mimarisi ve yapısı, büyük ölçüde daha yüksek ökaryotlar ökaryotik mayadan korunmuş olduğu göz önüne alındığında, daire-Seq yöntem olup, prensip olarak, applicabl olmalıdırküçük değişiklikler ile, tüm ökaryotik hücrelerde e. Şu anda, bu yöntem megabaz büyüklüğünde eccDNAs arıtmak için özelliği henüz gösterilecek olmakla birlikte, herhangi bir sınırlama olması görünmemektedir. Buna ek olarak, bir haddeleme-çember amplifikasyonu metodu 31 kullanan ø29 DNA polimeraz, kullanımı eccDNA miktar daha zor hale küçük eccDNAs karşı bir önyargı oluşturur. Çember-Seq insan somatik hücrelerinden çift dakika dairesel DNA üzerinde çalışmalar için uygun hale tam genleri taşımak için yeterince büyük eccDNAs algılar. Proto-onkogenler bu elemanların 32-37 güçlendirilmiş zaman çift dakikada kansere katkıda bulunabilir. germ hücrelerinde eccDNAs Çalışmaları germline mutasyon oranlarını ölçmek ve hayvancılık, örneğin sperm kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Böylece, daire-Seq gen telif içeren hastalıkların yeni bir anlayış genetik varyasyon kopya sayısı varyasyonu şeklinde ortaya hangi oranda içgörüler verim ve kurşun potansiyeline sahipnumara varyasyonu 38-40.

Bu büyük hücre popülasyonunda tek bir DNA molekülü değişiklikleri tespit gerektirdiği için, erken ya da geçici kromozomal amplifikasyonu algılama zordur. Kromozom kopya sayısı varyasyonları (CNVs) genellikle varyasyonu 1,2 oluşturulan mekanizmanın delil olarak sadece son CNV yapısını bırakarak, onların kurulmasından sonra iyi tespit edilir. Algılama ve genomik düzenlenmeleri devam eden süreçleri aydınlatmak olabilir KNV oluşumunun erken dönemlerinde ekstrakromozomal dairesel DNA (eccDNA) geri kazanılması. Daha önce, eccDNA de novo buluş, elektron mikrograflar 3, metafaz kromozomlarda 4 veya iki boyutlu jel elektroforezi 5 Giemsa lekelemesi uygulanmıştır. Bu yöntemler, dairesel DNA sekansı ile ilgili çok az ya da hiç bir bilgi sağlar. Böyle Güney yerinde hybridizatio PCR 8, ters 6,7 veya floresan kurutma olarak hedeflenen tekniklern 9 yalnızca belirli eccDNA elemanları hakkında kanıt sağlar. Bu yöntemlerden hiçbiri, bir hücre popülasyonunda var olan tüm eccDNA türleri dizisini sağlar. Hücrelerin bir havuzda genomik ayrışmanın genom dizileme ve / veya fayans dizileri 10,11 ile karakterize edilebilir. Bilinen DNA arındırma yöntemleri ile silme veya amplifikasyon algılama genellikle mutasyona uğramış alel hücre popülasyonu 12,13 en azından% 0.1-1 temsil gerektirir. Asentrik eccDNAs dolayı sentromer olmaması ve çoğaltma DNA sentezinin muhtemel olmaması, bir hücre kültüründe daha geçici olması beklenmektedir. En eccDNAs tahminen düşük miktarlarda bulunan ve sekanslar, genom benzediği Böylece, alternatif bir DNA ekstraksiyon yöntemleri eccDNAs tespit etmek için gereklidir. Birkaç dairesel DNA saflaştırma teknikleri kromozomlar ve dairesel DNA arasındaki yapısal farklılıkları istismar. örneğin, yüksek hızlı ultracentrifug içinsezyum klorür gradyanlar tirme, insan HeLa kanser hücre hattı 14 350-3000 baz çifti (bp), büyük eccDNAs izole etmek için kullanılır. Ancak, yüksek hız sedimantasyon hızı 15 ve eccDNA verim değiştirerek, nick, süper dairesel DNA yapılarının omurgasını kırmak ya da olabilir. Dutta ve arkadaşları de novo fare dokularından ve tavuk kültürler ve insan hücreleri 16,17 dairesel DNA genom ölçekli tanımlama için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem plazmid saflaştırma ve enzimatik reaksiyonların ve DNA ekstraksiyon birkaç tur izledi sakaroz Ultrasantrifügasyon tarafından homojenize dokudan çekirdeklerin çekilmesidir. Bunların protokolü öncelikle 200-400 bp&#39;lik eccDNAs, adı microDNAs tanımlar. Dutta ve arkadaşları da Saccharomyces cerevisiae gelen microDNAs saflaştırılması çalıştı, ancak bu maya türlerinin 16 microDNA kayıt koyamadık. Biz yeni bir yöntem için geliştirdiğimizÇember-Seq denilen maya eccDNA de novo tespiti. Bu yöntem bütün genleri taşımak için yeterince büyük ve 86 kilobaz (kb) mitokondriyal DNA (mtDNA) gibi büyük dairesel DNA molekülleri için genom ölçekli anketler sağlar. Yuvarlak-Seq yöntemi ökaryotik maya hücreleri için optimize edilmiş ve derin dizilemesi ile birlikte, iyi kurulmuş bir prokaryotik plazmid saflaştırma yöntemi 18,19 geliştirilmiştir. Çember-Seq yaklaşım, 1756 farklı eccDNAs, tüm 1&#39;den büyük kb kullanarak, on S&#39;den saptandı cerevisiae S288c 20 nüfustur. Bir boyut kesme bütün genleri taşımak için yeterince büyük olduğunu eccDNA odaklanmak için seçildi. Yuvarlak-Seq çok hassas olduğu; Bu hücreler 20 bin içinde tek eccDNA tespit edildi. Bu çalışmada, daire-Seq yalıtmak ve başka S. üç biyolojik çoğaltır 294 eccDNAs tanımlamak için kullanıldı cerevisiae maya cinsi, CEN.PK. Veri eccDNA yaygın bir genetik eleme olduğunu ortaya koymaktadırS. nt cerevisiae suşları.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600882</td>
			<td>For qPCR analysis. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN06.4</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disruptor Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.2</td>
			<td>Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>K0502</td>
			<td>Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI, FastDigest</td>
			<td>Life Technologies -&#160; Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>FD0594</td>
			<td>Endonuclease. Alternative product can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini AX kit&#160;</td>
			<td>A&#38;A Biotechnology, Poland</td>
			<td>010-50</td>
			<td>Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit</td>
			<td>Epicentre, USA</td>
			<td>E3105K</td>
			<td>ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>81845</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUG6 plasmid</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td>P30114</td>
			<td>Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN genomic-tip 100/G&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>13343</td>
			<td>Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REPLI-g Mini Kit protocol&#160;</td>
			<td>Qiagen, USA</td>
			<td>150023</td>
			<td>Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>210929</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme)</td>
			<td>Nordic BioSite, Sweden</td>
			<td>Z1004-3</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data access to sequence files</td>
			<td>European Nucleotide Archive&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D</td>
			<td></td>
			<td>Genotype MATa MAL2-8c SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool</td>
			<td>EUROSCARF, Germany</td>
			<td></td>
			<td>S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3&#8710;1 leu2&#8710;0 met15&#8710;0 ura3&#8710;0 genexxx::KanMX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Spectrophotometer&#160;</td>
			<td colspan="2">NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher</td>
			<td>Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm.</td>
			<td></td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic library-build system</td>
			<td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td>
			<td></td>
			<td>DNA library preparation. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing platform</td>
			<td colspan="2">Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc.</td>
			<td>DNA sequencing. Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td colspan="2">Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td>
			<td>Alternative product can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methods</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% YPD media&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle-Seq test on genomic DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 &#181;g genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 &#181;l) in wells on an 0.5 &#181;g/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mapping software</td>
			<td>Bowtie2 aligner, John Hopkins University</td>
			<td></td>
			<td>Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Workflow bioinformatic system</td>
			<td>Galaxy, Open source.</td>
			<td></td>
			<td>A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. &#34;Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists&#34;. Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. &#34;Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.&#34; Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide purification of extrachromosomal circular dna from eukaryotic cells

<html> Ekstrakromozomal dairesel DNA&#39;lar (eccDNAs) Saccharomyces cerevisiae&#39;de yaygın genetik elemanlar ve hem de diğer ökaryotlarda bildirilmektedir. EccDNAs çok hücreli organizmalarda somatik hücreler arasında ve tek hücreli ökaryotlar evrimi genetik varyasyon katkıda bulunur. eccDNA tespit edilmesi için hassas yöntemler bu elemanlar genom stabilite ve ne çevreye ve biyolojik faktörlerin ökaryotik hücrelerde bunların oluşumuna neden nasıl etkilediğini açıklık için ihtiyaç vardır. Bu video Çember-Seq denilen duyarlı eccDNA-arıtma yöntemi sunar. yöntem dairesel DNA, lineer kromozomal DNA, eccDNA haddeleme daire amplifikasyon, derin sıralama ve haritalama kalan çıkarılması sütun arıtma kapsar. Kapsamlı eksonükleaz tedavi yeterli doğrusal kromozomal DNA bozulması için gerekli oldu. tarafından yuvarlanma daire amplifikasyon adımine-height:. Normal; &quot;10 10 hücrelerinin üç S. cerevisiae CEN.PK popülasyonlar üzerinde Çember-Seq yönteminin&gt; doğrusal DNA üzerinde dairesel DNA için zenginleştirilmiş φ 29 polimeraz Doğrulama 1 kilobaz daha büyük boyutlarda eccDNA profilleri yüzlerce tespit . ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, S288c ve CEN.PK DNA daireselleştiğini bu odakta suşları arasında muhafaza edilir önerir hem de dairesel DNA HXT7 genler. Özetle tekrarlanan bulgular, Çember-Seq yöntem geniş vardır ökaryotlarda ve belirli eccDNA türlerini tespit etmek için eccDNA genom ölçekli tarama uygulaması.

Yuvarlak-Seq yöntemi üç S doğrulamak için Hücreler, on kuşaktır YPD ayrı büyütüldü sonra 1 10 x 10 hücre cerevisiae CEN.PK popülasyonları elenmiştir. Daha önce 20 (veriler gösterilmemiştir), tarif edildiği gibi kromozomal doğrusal DNA kaldırılması, bir qPCR ACT1 sinyalinin olmaması ile de teyit edilmiştir. Saflaştırılmış ve zenginleştirilmiş eccDNA 68 milyon kadar sıralandı okur (141 nükleotid tek uçlu okur) ve CEN.PK113-7D referans genom (sürüm 19 Haziran 2012) çizilmiştir. C1, C2 ve C4 adlı üç örnekten varsayılan eccDNAs kayıtları okur uzun 1 kb daha bitişik tarafından eşlenen genomik bölgelere ayrıldı. 10.000 Monte Carlo simülasyonları dayanarak, bitişik tarafından eşlenen her bölgenin önemi 1 kb tahmin edilmiştir daha uzun okur. Bu 79, 159 ve 56 bölge büyük olasılıkla eccDNA dizileri (p &lt;0.1, Dataset 1) olarak şerh edilmiştir itibaren. Kaydedilen contiguo sayısıUS&gt; 1 kb örnekler, bundan başka (Şekil 2) dizisi olsaydı daha eccDNA elemanları kaydedilmiş açardı sekansı derinliğinin bir fonksiyonu olarak artan okur. Beklendiği gibi, daire-Seq yöntem çeşitli kromozom XII 2μ plazmid gibi bilinen dairesel DNA elemanları, mitokondriyal DNA, ribozomal RNA gen bir dizi okuma ekstre edilmiş ve numuneler çivili üç iç kontrol plazmidler arasında pBR322, pUC19 ve pUG72 sadece kolon saflaştırılması (Şekil 3) önce. Video bitişik bir örnek kromozom IV HXT7 _ARS432_ HXT6 mahaline eşleştirilmiş okur göstermektedir. Daha önce, [HXT6 / 7 daire] On S288c popülasyonları (1 x 10 10 hücreleri her biri) ve dairesel bir DNA yapısında daire-DİZ ile tespit edilmiştir ters PCR analizi 20 ile teyit edilmiştir. [HXT6 / 7 ciDairesel], aynı zamanda, üç CEN.PK popülasyonu (Şekil 4A), her kaydedilmiştir. Ayrıca, CEN.PK arasında, kopya numuneler arasında yaygın eccDNA genlerin en S288c veri setleri (Şekil 4B) ile ilgili eccDNA genleri çakışan. dairesel DNA saflaştırma, 30 ug genomik DNA, iki numune, her biri için daire-Seq protokol özgüllük test etmek için, test edildi. Bir numune, daire-Seq protokol ile saflaştırıldı her iki numuneden 100 ng plazmid DNA ve eccDNA ile takviye edilmiştir. Sütun ayrılmasından sonra, ürün eldesi plazmid (GD) plazmid ile numune için 1.60,% (480 ng) (GD + P) olmayan bir örnek için% 1.27 oranında (380 ng) idi. Ekzonükleaz tedavisinin etkileri. 29 saat, ACT1 karşı PCR kullanılarak 72 saat sonra, doğrusal DNA içeriği açısından test edildi Resim örnekler (veriler gösterilmemiştir) Act1 amplifiye içeriyordu. Her bir eksonükleaz ile muamele edilmiş numunenin bir kısmı ayrıca bir olduø29 tarafından mplified polimeraz ve enzimatik reaksiyonların ürünleri propidyum iyodid lekeleme (Şekil 5A-C) ve agaroz jel elektroforezi (Şekil 5G) ile analiz edilmiştir. Ekzonükleaz tedavi sonrası örnekleri az propidyum iyodin-leke (Şekil 5A-B) göstermektedir. Ø29 - tek genomik DNA ile amplifiye numune, kontrol numunesininkinden (Şekil 5E) &#39;e benzer iplik benzeri yapılar (Şekil 5C) saptandı. Ø29 - eklenen plazmid vardı güçlendirilmiş numune plazmid kontrolü (Şekil 5F) benzeyen odakları (Şekil 5D) saptandı. görüntüleri ø29 polimeraz doğrusal DNA üzerinde dairesel DNA için zenginleştirilmiş belirtti. En doğrusal kromozomal DNA, 29 saat ekzonükleaz tedavisi (Şekil 5A-B, G) sonra numunelerden çıkarıldı. Ancak, geniş eksonükleaz 100&#39;den fazla saat tedavi ve kullanarak 100&#39;den fazla adet oldu<html> güçlendirilmiş numuneler yine 72 saat eksonükleaz tedavi (Şekil 5C-D) sonra iplik benzeri yapıların bir arka plan gösterdi - ø29 olarak, tüm kromozomal doğrusal DNA kaldırmak gerekiyordu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . Kolon kromatografisi, çıkan fraksiyonunda doğrusal kromozomal DNA kalan 3) sindirim, 4) amplifikasyon 1) hücre kültürü, 2) saflaştırma ve eccDNA zenginleşmesine: Çember-Sıra yöntemin Şekil 1. Anahat protokolü 5 adım vardır ø29 DNA polimerazın ve yüksek oranda zenginleştirilmiş eccDNA 5) sıralama ve haritalama DNA S. okur cerevisiae referans genom. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. bitişik dizi derinliğinin fonksiyonu olarak&gt; 1 kb okur. EccDNA 1 10 x 10 hücreleri (eşlenen okur milyon) sekansı derinliğinin bir fonksiyonu olarak artış. Gösterilen: haploid CEN.PK S. biyolojik kopyaların 10 10 hücre bölünmesi ile ayrılmış cerevisiae nüfuslar (C1, C2, C4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> Bilinen dairesel DNA elemanlarının Şekil 3. tespiti. (AB) CEN.PK Biyolojik plazmidler için yüzde okuma kapsama araziler (yoğunluğu okuyun) Dağılım C1, C2 ve C4 çoğaltır. Vardı Haritalı (A) endojen maya plazmid okur: 2P; [RDNA daire] (Kromozom XII ribozomal RNA genlerinin); ve mitokondriyal DNA (mitokondriyal DNA). (B) Benzersiz plazmidler kontrol eşleştirilmiş okur. Kontrol plazmidler kolon saflaştırılması önce numuneleri içine çivili edildi. Hücre başına Plazmid oranları: pBR322 (artı işaretleri) 1: 1, pUC19 (daireler) 1:50, ve pUG72 (üçgenler) 1: 2,500. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> CEN.PK ve S288c Şekil 4. Ortak eccDNA elemanları. (A) Venn şeması 476 arasında örtüşme görüntüleme Üç CEN.PK örnekleri (C1, C2, C4) 294 eccDNA elemanları genler. 16 ortak örtüşen eccDNA genleri / plazmidler (tüm gen isimleri Dataset 1 olan) açıklamalı. S1-S2, R1-R4: 10 S288c örnekleri putatif eccDNAs üzerinde kayıtlı tüm genlerin göre (B), üç CEN.PK örnekleri (C1, C2, C4) arasında varsayılan eccDNAs üzerinde kayıtlı tüm genlerin Venn diyagramı,Z1-Z4 (referans 20). genler / plasmidler ve 2 türü arka ve ya 3 ya da daha fazla deney düzeneğinde, en az üst üste farazi eccDNA bölgeleri 13 biyolojik çoğaltır (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) &#39;da gösterilmiştir. Cı örnekleri, CEN.PK; R ve Z&#39;nin örnekleri, S288c BY4741; S örnekleri, S288c M3750. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> Şekil eksonükleaz sonra DNA örneklerinin 5. Görselleştirme ve ø 2 9 tedavisi. DNA (AF) Propidium iyodür boyama. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (A, C ve E), genomik DNA ile numuneler (GD); (B ve D) GD artı plazmid (GD + P) ile örnekler. ( <str<html> 29 saat ekzonükleaz muameleden sonra&gt; AB) (ekzo 29 H) Ong; Ø29 polimeraz amplifikasyonu takiben 72 saat ekzonükleaz muameleden sonra (CD) (ekzo 72 saat + ø29). (E) e sonra Genomik DNA kontrolü: ø29 polimeraz büyütmesi; (F) plazmid kontrolü (5.5 kb) sonra 29 polimeraz amplifikasyonu; (G ø) agaroz jel elektroforezi. L, 1 kb belirteçleri;: Soldan P, EXO 29 saat sonra plazma kontrolü (5.5 kb); GD, EXO 29 saat sonra (A gibi örnek); GD + P, EXO 29 saat sonra (B olarak örnek); GD ve GD + P, EXO sonra 29 saat + ø29; GD ve GD + P, EXO sonra 72 saat + ø29 (CD gibi örnek). Tablo S1 görün Daha fazla ayrıntı için. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> aset 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; CEN.PK. DataSet 1. Potansiyel DNA daireselleştiğini bölgeleri <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Dizi verileri olan gösterilmektedir ve 348 bölgeleri için analiz eder. Sütunlar AD, eccDNA haritalama vardır. farazi eccDNA tespit edildiği, numune, bir (soldan ilk sütun); B, kromozom; CD, başlangıç ​​ve bitiş varsayılan eccDNAs koordinatları. EH, eccDNA içeriği. E, özerk bölgede (ARS) dizisi çoğaltılıyor; F, bölgede tam geni; G, bölgede bulunan bir genin bir parçası; H, gen BLASTN tanımlanan. IO, EccDNA kapsamı ve p-değerleri. Ben, bp içinde benzersiz açıklamalı dizisi ile en uzun bölge; J, tüm okuma sayısıdır eşlenen; K, tüm eşlenen kapsamı eşleştirilmiş bir milyon okur (FPKM) dan kb başına parçalarından okur; Monte Carlo simülasyonları tesadüfen oluşması ile karşılaştırıldığında varsayılan eccDNA L, p-değeri; un M, sayıiquely okur eşlenen; NO; K ve L sadece benzersiz eşlenen kullanma gibi (UFPKM) okur. Haritalama için parametreler okur ve 20 açıklandığı gibi Monte Carlo simülasyonları idi.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells at JoVE.com

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Ökaryotik Hücrelerde gelen ekstrakromozomal dairesel DNA genom Arıtma

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

genome-wide-purification-extrachromosomal-circular-dna-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K Görüntüleme.  University of Copenhagen. This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation. 

Video: Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Prokaryotik Kültürler itibaren Plazmid DNA Aerodinamik Arıtma

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.